>[0021] 步驟二：確定胎兒核酸含量。
[0022] 基于第一和第二測(cè)序數(shù)據(jù)，或者基于第一、第二和第三測(cè)序數(shù)據(jù)，確定所述孕婦體 液樣本中的胎兒核酸含量。
[0023] 其中，基于第一和第二測(cè)序數(shù)據(jù)確定孕婦體液樣本中的胎兒核酸含量，是這 樣進(jìn)行的：首先是篩選出在第一測(cè)序數(shù)據(jù)中有兩種基因型以及在第二測(cè)序數(shù)據(jù)中只 有一種基因型的位點(diǎn)。位點(diǎn)的篩選可以通過(guò)比對(duì)來(lái)進(jìn)行，比對(duì)可以利用S0AP(Short OligonucleotideAnalysis Package)，bwa，samtools等軟件進(jìn)行，本實(shí)施方式對(duì)此不作限 制，比對(duì)的進(jìn)行也可以識(shí)別出多態(tài)性位點(diǎn)。比對(duì)所使用的參考序列是已知序列，可以是預(yù)先 獲得的目標(biāo)個(gè)體所屬生物類(lèi)別中的任意的參考模板。例如，若目標(biāo)個(gè)體是人類(lèi)，參考序列可 選擇NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的HG19。進(jìn)一步地，也可以預(yù)先配置包含更多參考序列的資源庫(kù)，在 進(jìn)行序列比對(duì)前，先依據(jù)目標(biāo)個(gè)體的性別、人種、地域等因素選擇或是測(cè)定組裝出更接近的 序列來(lái)作為參考序列，有助于獲得更準(zhǔn)確的檢測(cè)分析結(jié)果。在比對(duì)過(guò)程中，根據(jù)比對(duì)參數(shù)的 設(shè)置，各測(cè)序數(shù)據(jù)中的每條或每對(duì)讀段（reads或一對(duì)末端讀段pair-end reads)最多允許 有η個(gè)堿基錯(cuò)配（mismatch), η優(yōu)選為1或2,若reads中有超過(guò)η個(gè)堿基發(fā)生錯(cuò)配，則視 為該條/對(duì)reads無(wú)法比對(duì)到參考序列。一個(gè)位點(diǎn)，假設(shè)在參考序列上該位點(diǎn)是Α，第二測(cè) 序數(shù)據(jù)的比對(duì)結(jié)果表明第二測(cè)序數(shù)據(jù)即母親測(cè)序數(shù)據(jù)中比對(duì)上到參考序列該位點(diǎn)的堿基 都是A，但是第一測(cè)序數(shù)據(jù)即母親與胎兒的測(cè)序數(shù)據(jù)的比對(duì)結(jié)果表明第一測(cè)序數(shù)據(jù)中比對(duì) 到參考序列該位點(diǎn)的堿基是A和另外一種非A的堿基，非A堿基比如T、C或G，由于第一測(cè) 序數(shù)據(jù)中是母親和胎兒核酸的混合測(cè)序數(shù)據(jù)，而從第二測(cè)序數(shù)據(jù)的比對(duì)結(jié)果可知母親的該 位點(diǎn)為AA，那么就可判斷出第一測(cè)序數(shù)據(jù)中該位點(diǎn)非A堿基來(lái)源于胎兒，這樣篩選出所有 這樣的位點(diǎn)，基于這些位點(diǎn)在混合測(cè)序數(shù)據(jù)中占的比例，就能反映出混合核酸中胎兒核酸 的含量。類(lèi)似的，若第二測(cè)序數(shù)據(jù)的比對(duì)結(jié)果表明母親某位點(diǎn)的基因型為雜合的，比如AG， 而第一測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果顯示支持該位點(diǎn)AG和AA兩種基因型，這樣基于第一測(cè)序數(shù)據(jù)中 A堿基的數(shù)量、含量或比例，也能估算獲得孕婦外周血樣本中的胎兒核酸含量。當(dāng)像上面前 者情況，在第二測(cè)序數(shù)據(jù)中只有純合基因型、而在第一測(cè)序數(shù)據(jù)中除有一樣的純合基因型 還有雜合基因型時(shí)，胎兒核酸含量f = 2cV(C+d)，而當(dāng)像上面后者情況，在第二測(cè)序數(shù)據(jù)中 只有雜合基因型、而在第一測(cè)序數(shù)據(jù)中除有那雜合基因型還有純合基因型，胎兒核酸含量f =(c-dV(c+d)，公式中的c為第一測(cè)序數(shù)據(jù)中支持等位基因 A的讀段數(shù)目，d為第一測(cè)序 數(shù)據(jù)中支持非A等位基因的讀段數(shù)目。
[0024] 基于第一、第二和第三測(cè)序數(shù)據(jù)確定孕婦體液樣本中的胎兒核酸含量，是通過(guò)以 下進(jìn)行的：篩選出在第二測(cè)序數(shù)據(jù)和第三測(cè)序數(shù)據(jù)中為不同純合基因型的位點(diǎn)，比如該位 點(diǎn)在第二和第三測(cè)序數(shù)據(jù)中的基因型分別為RR和rr，這樣以遺傳角度，胎兒核酸中該位點(diǎn) 的基因型為Rr，基于多個(gè)這種類(lèi)型的位點(diǎn)計(jì)算孕婦外周血樣本中胎兒核酸含量，胎兒核酸 含量f = gAg+h)，g為第一測(cè)序數(shù)據(jù)中支持等位基因 r的讀段數(shù)目，h為第一測(cè)序數(shù)據(jù)中 支持等位基因 R的讀段數(shù)目。位點(diǎn)的篩選涉及的比對(duì)，比對(duì)參數(shù)的設(shè)置、比對(duì)結(jié)果等可參照 前面基于第一和第二測(cè)序數(shù)據(jù)估算胎兒核酸含量的描述進(jìn)行。
[0025] 步驟三：構(gòu)律父母的目標(biāo)區(qū)域單體型。
[0026] 基于第二、第三和第四測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建母親和父親的目標(biāo)區(qū)域單體型，即基于父母 各自的測(cè)序數(shù)據(jù)和已知的該對(duì)父母的目標(biāo)區(qū)域帶變異的子女（先證者）的測(cè)序數(shù)據(jù)，來(lái)構(gòu) 建父母各自的單體型。將父母各自的測(cè)序數(shù)據(jù)以及先證者的測(cè)序數(shù)據(jù)分別與參考序列比 對(duì)，利用軟件比如SOAPsnp、GATK、bowtite等識(shí)別出父母以及先證者目標(biāo)區(qū)域中的SNP和獲 得各個(gè)SNP的基因型，由于先證者的兩條單體型（兩組SNP集合）是由父親和母親的各一 條單體型組成的，所以依據(jù)孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，依據(jù)父母及先證者的各個(gè)SNP所在位點(diǎn)的基 因型，比如利用多個(gè)區(qū)分型SNP，區(qū)分型SNP指該位點(diǎn)父母為不同基因型能夠提供給下一代 能區(qū)分單體型來(lái)源的SNP，構(gòu)建父親和母親的單體型。單體型傾向作為一個(gè)遺傳單元遺傳給 子代，在這里，單體型是一組SNP的集合。
[0027] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的實(shí)施方式對(duì)步驟二和步驟三的進(jìn)行沒(méi)有先后順序限制， 可以先進(jìn)行步驟二再進(jìn)行步驟三，或者先進(jìn)行步驟三獲得父母目標(biāo)區(qū)域單體型再進(jìn)行步驟 二確定胎兒核酸含量。
[0028] 步驟四：確定胎兒目標(biāo)區(qū)域單體型。
[0029] 基于母親和父親的目標(biāo)區(qū)域單體型以及胎兒核酸含量，確定所述胎兒目標(biāo)區(qū)域單 體型。具體地，利用多個(gè)在父親目標(biāo)區(qū)域單體型上為雜合、在母親目標(biāo)區(qū)域單體型上為純 合的位點(diǎn)確定胎兒遺傳到的父親目標(biāo)區(qū)域單體型，這是由于若胎兒某SNP位點(diǎn)為雜合的， 由于源自母親的只可能為一種類(lèi)型的堿基，所以就可確定該位點(diǎn)的另一堿基來(lái)自父親，利 用多個(gè)這樣的位點(diǎn)，比如可以確定超過(guò)10個(gè)這樣的位點(diǎn)的等位基因源自父親的一條單體 型，就能確定胎兒兩條單體型中的源自父親的那條單體型。而對(duì)于胎兒另一條單體型的確 定，可類(lèi)似的利用多個(gè)在父親目標(biāo)區(qū)域單體型上為純合、在母親目標(biāo)區(qū)域單體型上為雜合 的位點(diǎn)來(lái)確定，但由于胎兒核酸樣本，即母體外周血樣本混有大量的母體DNA，單從以上類(lèi) 型SNP沒(méi)法判斷胎兒遺傳了 R還是r所在的母親單體型，因?yàn)樵撐稽c(diǎn)任何的等位堿基也都 可能就只是母體的，在這里我們結(jié)合胎兒核酸含量來(lái)確定胎兒遺傳到的母親的單體型。對(duì) 于多個(gè)在父親單體型上為純合、母親單體型上為雜合的多態(tài)性位點(diǎn)，這樣的位點(diǎn)在母體外 周血樣本中每個(gè)都可表示為Rr，若多個(gè)這樣的位點(diǎn)都符合R/r = (1+x% V(l-x% )，則判 定胎兒遺傳了母親等位基因 R所在的單體型，若多個(gè)這樣的位點(diǎn)都符合R/r = 1，則判定胎 兒遺傳了母親等位基因 r所在的單體型，R和r表示一對(duì)等位基因，X%表示胎兒核酸含量， R/r =比對(duì)后第一測(cè)序數(shù)據(jù)中支持R的讀段數(shù)目/比對(duì)后第一測(cè)序數(shù)據(jù)中支持r的讀段數(shù) 目。由此，確定胎兒的單體型。
[0030] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，上述實(shí)施方式中各種方法的全部或部分步驟可以 通過(guò)程序來(lái)指令相關(guān)硬件完成，該程序可以存儲(chǔ)于一計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)中，存儲(chǔ)介質(zhì)可 以包括：只讀存儲(chǔ)器、隨機(jī)存儲(chǔ)器、磁盤(pán)或光盤(pán)等。
[0031] 依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供一種確定胎兒目標(biāo)區(qū)域單體型的裝置，該裝 置能夠用以完成本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中的方法的部分或全部步驟，如圖1所示，該裝置 1000包括：測(cè)序單元100,用以獲得孕婦體液中的游離核酸，捕獲目標(biāo)區(qū)域，對(duì)所述捕獲得 的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行序列測(cè)定，獲得第一測(cè)序數(shù)據(jù)，用以捕獲胎兒家系成員核酸中的同樣目標(biāo) 區(qū)域，對(duì)所述家系成員的同樣目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行序列測(cè)定，獲得家系成員測(cè)序數(shù)據(jù)，所述家系成 員測(cè)序數(shù)據(jù)包括第二、第三和第四測(cè)序數(shù)據(jù)，分別對(duì)應(yīng)胎兒母親、胎兒父親和先證者的同樣 目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序數(shù)據(jù)；胎兒核酸含量確定單元200,與所述測(cè)序單元100相連，用于基于第 一和第二測(cè)序數(shù)據(jù)，或者基于第一、第二和第三測(cè)序數(shù)據(jù)，以確定所述孕婦體液樣本中的胎 兒核酸含量；父母單體型確定單元300,與所述測(cè)序單元100相連，用于基于第二、第三和第 四測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建母親和父親的目標(biāo)區(qū)域單體型；胎兒?jiǎn)误w型確定單元400,與所述胎兒核 酸含量確定單元200和所述父母單體型確定單元300相連，用于基于母親和父親的目標(biāo)區(qū) 域單體型以及胎兒核酸含量，確定所述胎兒目標(biāo)區(qū)域單體型。對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中 的方法的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)的描述，同樣適用本發(fā)明這一實(shí)施方式的裝置，在此不再贅述。
[0032] 以下結(jié)合對(duì)具體樣本依據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域單體型的確定、基因型的確 定、單體型或基因型確定后的用途進(jìn)行詳細(xì)的描述及結(jié)果展示。下面示例，僅用于解釋本發(fā) 明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在本發(fā)明中所使用的"第一"、"第二"、"第三"等僅用于 方便描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性，也不能理解為之間有先后順序關(guān)系。 本發(fā)明的描述中，除非另有說(shuō)明，"多個(gè)"的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上。
[0033] 除另有交待，以下實(shí)施例中涉及的未特別交待的試劑、序列（接頭、標(biāo)簽和引物）、 軟件及儀器，都是常規(guī)市售產(chǎn)品或者公開(kāi)的，比如購(gòu)自Illumina公司的hiSeq2000測(cè)序平 臺(tái)建庫(kù)相關(guān)試劑盒來(lái)進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建等。
[0034] 一般方法：
[0035] 1.目標(biāo)捕獲區(qū)域的選擇及探針的設(shè)計(jì)
[0036] 目標(biāo)捕獲區(qū)域包括SMN1基因外顯子區(qū)，SMN1基因內(nèi)部及其上下游3M區(qū)域內(nèi)高雜 合率SNP位點(diǎn)的捕獲測(cè)序。SNP的選擇參考dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇其中參考染色體數(shù)大于100 條、MAF在0. 3-0. 5之間的SNP位點(diǎn)。同時(shí)，為了保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，保證SNP位點(diǎn)所在序 列63mer堿基序列在基因組上為唯一比對(duì)，且GC含量在40%-50%。SMNl區(qū)域捕獲區(qū)域如 表1及表2所示
[0037] 2.家系致病單體型的獲得
[0038] 通過(guò)生物信息分析，對(duì)孕婦、孕婦丈夫及先證者在目標(biāo)基因及其上下游區(qū)域的SNP 位點(diǎn)基因型進(jìn)行判斷。通過(guò)對(duì)三者的SNP基因型進(jìn)行連鎖分析，以確定與致病突變緊密連 鎖的SNP位點(diǎn)的基因信息，并進(jìn)一步獲得與致病突變連鎖的單體型信息。整體技術(shù)路線如 圖2所示。
[0039] (1)從孕婦、孕婦丈夫及先證者的外周血中抽提基因組DNA，并使用電泳及0D對(duì)獲 得的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。