r>[0040] (2)使用質量檢測合格的基因組DNA進行目標區域捕獲文庫的制備。文庫制備 是將1 μ g基因組DNA打斷成主帶為200-300bp小片段DNA，然后將打斷后DNA片段進行 末端補平，在3'端加堿基"A"，使得DNA片段能與3'端帶有"T"堿基的特殊接頭連接，經 Non-Captured PCR(未捕獲前PCR)構建完成的文庫，通過SMN1基因目標區域捕獲探針選取 的特定基因的Exon及側翼±30bp區域進行富集，再通過PCR擴增富集后產物，最后通過雜 交前后PCR產物QPCR檢測獲得序列捕獲雜交效率。
[0041] (3)使用高通量測序儀對獲得的樣品文庫進行測序。使得目標區域平均測序深度 達到200 X以上。
[0042] (4)通過生物信息分析，對測序信息進行分析和研究，以得到相關基因的單核苷酸 變異（SNV)、少數堿基的插入和缺失（InDel)等遺傳變異信息。并明確與目標待檢致病突 變相連鎖遺傳的SNP信息，即致病單體型。假設先證者分別從父母雙方得到一個致病突變， 若，
[0043] 1)假設先證者致病基因外某一位點的基因型為AA，父親為AC，母親為AA。則可知： 先證者從父親處獲得了 A，從母親處獲得了一個A，且這兩個SNP位點均與致病突變相連鎖 遺傳。而在父親中C與非致病等位基因（allele)連鎖；
[0044] 2)假設先證者致病基因外某一位點的基因型為AC，父親為AC，母親為AA。則可知： 先證者從父親處獲得了 C，從母親處獲得了一個A，且這兩個SNP位點均與致病突變相連鎖 遺傳。而在父親中C與非致病allele連鎖；
[0045] 3)假設先證者致病基因外某一位點的基因型為AC，父親為AA，母親為AC。則可知： 先證者從父親處獲得了 A，從母親處獲得了一個C，且這兩個SNP位點均與致病突變相連鎖 遺傳。而在母親中C與非致病allele連鎖；
[0046] 將上述推測方法應用到SMN1基因及兩側3M區域的SNP位點，則可獲得者一范圍 內的單體型信息，獲知在這一區域內與致病突變連鎖的單體型信息。從而并可進一步推斷 出與非致病allele緊密連鎖的SNP信息。
[0047] 3.孕婦血漿DNA目標區域捕獲測序
[0048] 對孕婦血漿DNA進行目標區域捕獲測序，并進行生物信息學SNP/indel分析。以 親緣關系是否正確及胎兒DNA含量為質控環節，僅對質控合格的樣品進行后續分析。對孕 婦的血漿游離DNA測序數據進行genotyping，并結合該家系單體型進行連鎖分析，判斷胎 兒是否遺傳了夫婦的致病單體型。
[0049] (1)從1. 2ml孕婦血漿中抽提細胞游離DNA，并使用Qubit定量DNA進行質量檢測。
[0050] (2)使用質量檢測合格的基因組DNA進行目標區域捕獲文庫的制備。首先對DNA 片段進行末端補平，在3'端加堿基"A"，使得DNA片段能與3'端帶有"T"堿基的特殊接頭 連接，經Non-Captured PCR構建完成的文庫，通過SMN1目標區域捕獲探針選取的特定基因 的Exon及側翼±30bp區域進行富集，再通過PCR擴增富集后產物，最后通過雜交前后PCR 產物QPCR檢測獲得序列捕獲雜交效率。
[0051] (3)使用高通量測序儀對獲得的樣品文庫進行測序。使得目標區域平均測序深度 達到500 X以上。
[0052] 4.胎兒基因型推測
[0053] (1)通過生物信息分析，對測序信息進行分析和研究，以得到相關基因的單核苷酸 變異（SNV)、少數堿基的插入和缺失（InDel)等遺傳變異信息。
[0054] (2)對血漿游離DNA中胎兒DNA的含量進行計算，計算方式如下
[0055] a)假設母親白細胞DNA基因型為AA，胎兒基因組DNA為AT，則此時血漿中可觀 察到的基因型為A和T，若支持A的reads數為c，支持C的reads數為d，則此時f = 2d/ (c+d)；
[0056] b)假設母親白細胞DNA基因型為AT，胎兒基因組DNA為AA，則此時血漿中可觀察 到的基因型為A和T，若支持A的reads數為c，支持T的reads數為d，則此時f = (c-d) / (c+d) 〇
[0057] 若胎兒DNA含量>3%則認為質控合格，進入后續實驗。
[0058] (3)判斷胎兒從父親處遺傳的基因型，計算方式如下：
[0059] a)選擇母親為純合，而父親為雜合的位點進行父親遺傳單體型的判斷。假設某一 SNP位點母親基因型為AA，父親基因型為AC，若血漿測序數據call SNP結果為A，C，且C的 含量符合估計的胎兒濃度。則表明胎兒從處獲得SNP C所在的allele;
[0060] b)將SMN1捕獲區域內所有滿足a)條件的SNP用于判斷胎兒從父親處所獲得的 SNP信息，構成胎兒從父親處獲得的單體型信息。并根據2-(4)中的信息，明確該單體型是 否與致病突變相連鎖，從而獲知胎兒是否從父親處獲得致病allele。
[0061] (4)判斷胎兒從母親處遺傳的基因型，計算方式如下
[0062] 選擇母親為雜合，而父親為純合的位點進行母親遺傳單體型的判斷。假設某一 SNP 位點母親基因型為AC，父親基因型為AA，若血漿測序數據call SNP結果為A和C，若胎兒從 母親處遺傳了 A等位基因，胎兒的基因型為AA，則可觀察到A/C近似與（l+fV(l-f);若胎 兒遺傳了 C等位基因，胎兒的基因型為AC，則可觀察到A/C近似為0.5。對等位基因的reads 支持數構建二項分布模型分別計算出遺傳 A、C的概率后得到相對概率Pa、Pc (Pa+Pc = 1) 并將所有SNP各點概率構建HMM模型用Viterbi算法（Lawrence R. Rabiner, PROCEEDINGS OF THE IEEE, Vol. 77, No. 2,1989年2月）判斷胎兒從母親處獲得的單體型信息，并根據單 體型是否與致病突變相連鎖，得知胎兒是否從母親處獲得致病allele。
[0063] (5)綜合（3)和（4)的結果，獲得胎兒的基因型信息。
[0064] 實施例
[0065] 對1例具有生育SMN1患病二胎高風險的孕婦（天津婦幼保健院）進行無創產前 基因檢測。孕婦及其丈夫均為為SMN1基因7號外顯子缺失突變的雜合攜帶者，并生育過一 個SMN1純合突變的患者。現第二次懷孕，抽取孕婦外周血并及時分離血漿，而后通過血漿 DNA及孕婦、孕婦丈夫、先證者的基因組DNA進行捕獲測序，對本胎胎兒的基因情況進行分 析。
[0066] 用鹽析法提取標本DNA，大片段DNA進行超聲打斷，目前使用樣品打斷方法為 Covaris打斷法，將樣品DNA打碎至100-700bp范圍的片段。（注：打斷效果一般以所要求 制備文庫Insert片段主帶位置在200-250bp位置較為理想，若打斷效果不理想則需要進行 重新打斷。）
[0067] 用鹽析法提取血漿游離DNA，使用Qubit定量后直接進行文庫構建。
[0068] 1.文庫制備
[0069] 1. 1末端修復和純化
[0070]
[0071] 將配置好的mix震蕩混勻后，每個反應加入25 μ L酶反應混合液。
[0072] 反應條件：20°C，30min
[0073] 使用180 μ L Ampure Beads進行產物純化，回收的DNA溶于30yL(其中1.9yL 為損耗）的水中。
[0074] 1. 2 末端加 "A"（A-Tailing)
[0075]
[0076] 將配置好的mix震蕩混勻后，每管加入6. 9 μ L酶反應混合液。
[0077] 反應條件：20°C，30min
[0078] 注：末端加"A"后不純化
[0079] 1. 3 Adapter的連接和純化
[0080]
[0081] 將配置好的mix震蕩混勻，每個反應加入15 μ L酶反應混合液。
[0082] 反應條件：l6°C，l2_l6h (過夜）
[0083] 使用75 μ L Ampure Beads進行產物純化，回收的DNA溶于35yL(其中2yL為損 耗）的水中。
[0084] 1. 4Non_Captured 樣品 Pre-LM-PCR
[0085]
[0086] PCR 程序：
[0087] 94Γ 2min； 94°C 15s, 62 C 30s, 72°C 30s, 4c>clcs； ir〇 5min； 4°C forever
[0088] 2.芯片雜交，目標區域捕獲富集
[0089] 本實驗中參照NimbieGen使用說明書進行雜交洗脫，獲取目的基因并PCR富集。
[0090] 3.上機測序
[0091] 本實驗采用hiseq2000或hiseq2500PE101+8+101程序進行上機測序。
[0092] 4.信息分析
[0093] 測序儀獲取原始短序列；
[0094] 去除測序數據中的接頭和低質量數據；
[0095] 短序列定位到人類基因組數據相應的位置上；
[0096] 統計測序結果信息，短序列數量、目標區域覆蓋大小、平均測序深度等；
[0097] 過濾低質量值和低覆蓋度的單核苷酸；
[0098] 注釋，確定突變