專利名稱：巴戟天組織培養方法
技術領域：
本發明涉及一種植物的組織培養方法。
背景技術：
巴戟天是茜草科多年生攀援木質藤本植物，是我國四大南藥之一。其肉質根可供藥用，具有補腎壯陽、強筋骨、祛風濕的作用，為主要的出口創匯藥材。傳統的栽繁殖技術主要是用種子和扦插繁殖，其繁殖速率很低，嚴重影響其產量和質量。長期以來，其繁殖技術一直是生產中亟待解決的突出問題之一。
采用組織培養技術繁殖植物可以得到很高繁殖速率，植物組織培養技術是利用植物細胞全能性(即每一個細胞都潛在著發育成一個新個體的能力)。采取植物上的細胞團，分生組織或營養器官的微小部分，通過人工配制不同營養成分和激素調控，使這些組織細胞形成成千上萬小植株并且保存了母體內全部優良遺傳性狀，這種方法可以在短時間內獲得大量試管苗。由于生產幼苗是在試管內進行并擺放在有光照條件下的恒溫房間內，四季都可以進行，而且在極少的面積內進行大規模生產，因而不占用土地。如果利用組織培養技術成功地繁殖巴戟天，不但可以有效提高其成活率，提高藥用價值，節約資源，節省人力，物力，而且還可提高經濟效益，為我國出口創匯，這是一個很好的發展方向。
巴戟天的試管快繁至少在以下四個方面具有重要的意義第一，繁殖速度極快。由于巴戟天植物生命周期長，通過種子繁殖往往難以滿足生產上對苗木的需求量。扦插繁殖雖然可以在一定程度上加快繁殖速度，但大面積生產仍難以用這種方法滿足苗木需求量，試管繁殖不受氣候因素的影響、可以一年四季在室內繁殖，而且繁殖速度極快。所以，在速度上具有其他方法無法比擬的優點。
第二，便于保持優良種性。在自然界，巴戟天在遺傳上往往是高雜合的。如果用種子繁殖，則會導致嚴重的性狀分離；而通過試管快繁獲得的苗木在遺傳性狀上則一般是高度一致的，因為試管繁殖是一種嚴格的無性繁殖途徑。
第三，試管快繁在保存和繁育優良突變體或優良雜種一代方面也具有非常重要的意義。一株具有明顯優勢的巴戟天突變體，或者一個具有明顯優勢的后代，經過試管快繁后即可大面積推廣種植。
第四，經濟效益顯著。巴戟天植物的試管快繁較之草本植物更具有利用價值，因為一株優良巴戟天苗木定植后可生長幾年甚至更長時間，而且單位面積上用苗量不大。所以，單株巴戟天試管苗所得的經濟效益就更加顯著。
草本植物的組織培養方法已有報道，但木質藤本植物巴戟天的組織培養方法未見報道。由于巴戟天表面有絨毛，從野外采集的外植體，如莖尖、嫩莖、嫩葉等，其表面滋生著菌類病毒，有的菌類甚至長入組織內部，致使表面消毒劑很難殺死組織內部的菌類而導致材料在接種之后污染，因此，巴戟天外植體的表面消毒往往是一件令研究者傷透腦筋的事，是巴戟天的組織培養的關鍵技術內容。巴戟天病害迄今已知有10種，主要為巴戟枯萎病，發病率可高達80％以上。如果消毒處理不徹底，則培養成功率很低。

發明內容
本發明的目的是提供一種可以快速、大規模繁殖巴戟天的組織培養方法。
本發明提供的巴戟天組織培養方法，包括以下步驟1、消毒將從巴戟天外植體取下的分生組織首先按常規方法消毒，然后采用抗菌素無菌水溶液浸泡消毒，例如采用500萬單位/升的青霉素無菌水溶液浸泡60分鐘，并在超凈工作臺上用無菌水沖洗2-3次，再用濾紙吸干水份。
為了減少污染機會，進行表面消毒之前應根據具體情況采取以下幾項措施(1)從健壯的植株上取材料，不要取有傷口或者有病蟲的材料；(2)要在晴天中午或下午取材料；(3)在室內或無菌條件下進行預培養；(4)對取自田間的材料在表面消毒之前要進行預處理；(5)初接種時采用小容器，每個容器中盡量少接外植體。
2、誘導將巴戟天的分生組織(如帶節莖段、莖尖等)，接種在誘導培養基上，該培養基含有常規基本培養基(Murashige and Skoog培養基，以下簡稱MS培養基)、6-芐基嘌呤(6-BA)1毫克/升、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0.5毫克/升、蔗糖3％。培養20天后，待培養物膨大形成愈傷組織時，即開始下階段。
3、分化增殖將上階段所得培養物轉移到分化增殖培養基上，該培養基含有MS培養基、6-芐基嘌呤(6-BA)1.5毫克/升、蔗糖3％。培養30天后，開始出現叢生巴戟天苗，待小苗長到2cm高度時，進行下階段。
4、生根將上階段所得小苗齊根取下，轉移至常規生根培養基。該培養基含有1/2MS培養基、吲哚丁酸(IAA)0.5毫克/升、萘乙酸(NAA)0.2毫克/升、蔗糖1％。15天后，小苗基部開始出現白色短根，并繼續長出完整的根系，之后15天，即可按常規方法移栽長成正常的巴戟天植株。
本發明的培養基有以下優點誘發時間短，出苗快，增殖頻率高，生長周期較其它培養基短，且苗齊苗壯，生長良好。
采用本發明提供的方法在誘導階段一般20天左右就可開始出現脫分化，在分化階段，30天左右即可開始出現叢生種苗，在生根階段約15天后，可見白色短根，再過約15天，便可移栽了，而常規繁殖方法一般只能一年繁殖一次，一次繁殖數株，本發明方法可周年繁殖，一個莖尖一年可繁殖幾十萬株。
故本發明的方法，不僅培養植株速度快，繁殖率高，而且易于操作大規模生產。
具體實施例方式1、取材取巴戟天的莖尖，用水沖洗干凈。
2、材料消毒方法將取下的莖尖在75％酒精中浸泡30秒，放入0.1％升汞溶液中浸泡10-15分后，在超凈工作臺上用無菌水沖洗8-10次，后用濾紙吸干水份。然后采用500萬單位/升的青霉素無菌水溶液浸泡60分鐘后，在超凈工作臺上用無菌水沖洗2-3次，后用濾紙吸干水份。
3、接種在超凈工作臺上，用常規無菌操作方法將洗干凈的巴戟天莖尖用剪刀剪成2cm長，使莖尖分生組織向上，直插或斜插在誘導培養基上。該培養基含有MS培養基、6-芐基嘌呤(6-BA)1毫克/升、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0.5毫克/升、蔗糖3％。
4、分化增殖；將已形成愈傷組織的莖尖接種到分化增殖培養基上，該培養基含有MS培養基、6-芐基嘌呤(6-BA)1.5毫克/升、蔗糖3％。一周后可見到綠色微凸的芽點，四周后芽點明顯增大，并分化出叢生芽。
5、生根巴戟天組織培養誘導形成的芽，生長至2cm長時，切下轉入含有生長素的生根培養，該培養基含有1/2 MS培養基、IAA 0.5毫克/升、NAA 0.2毫克/升、蔗糖1％。轉瓶后一般1個月左右開始形成根，獲得完整植株。
培養溫度及光照條件培養溫度為25℃士2℃；光照強度為1500-2000勒克斯。
6、移栽當試管小苗長到具有完整的根、莖、葉時，將試管口打開，在常溫下敞開瓶口24小時，讓幼苗在自然光下或培養室光照下鍛煉2天，然后取出轉入已消毒的細沙中沙培煉苗，添加1/2 MS培養液作養分，待生長穩定，長出新葉后移栽于露天種植，幼苗移栽獲得成活。一般成活率在90％左右。
權利要求
1.巴戟天的組織培養方法，其特征在于包括以下步驟(1)消毒將從巴戟天外植體取下的分生組織首先按常規方法消毒，然后采用抗菌素無菌水溶液浸泡消毒，并用無菌水沖洗2-3次，再用濾紙吸干水份；(2)誘導將巴戟天的分生組織，接種在誘導培養基上，該培養基含有MS培養基、6-芐基嘌呤1毫克/升、2，4-二氯苯氧基乙酸0.5毫克/升、蔗糖3％，培養20天后，待培養物膨大形成愈傷組織時，即轉入下階段；(3)分化增殖將上階段所得培養物轉移到分化增殖培養基上，該培養基含有MS培養基、6-芐基嘌呤1.5毫克/升、蔗糖3％，培養30天后，開始出現叢生巴戟天苗，待小苗長到2cm高度時，即轉入下階段；(4)生根將上階段所得小苗齊根取下，轉移至生根培養基，該培養基含有1/2MS培養基、吲哚丁酸0.5毫克/升、萘乙酸0.2毫克/升、蔗糖1％，15天后，小苗基部開始出現白色短根，并繼續長出完整的根系；
2.根據權利要求1所述的巴戟天的組織培養方法，其特征在于所述采用抗菌素無菌水溶液浸泡消毒方法，采用500萬單位/升的青霉素無菌水溶液浸泡60分鐘，并在超凈工作臺上用無菌水沖洗2-3次，再用濾紙吸干水份。
全文摘要
本發明涉及一種植物的組織培養方法。該方法包括消毒、誘導、分化增殖、生根和移栽等階段,在消毒階段采用抗菌素(例如青霉素)無菌水溶液浸泡消毒;在誘導、分化增殖、生根和移栽等階段的培養基以MS常規基本培養基為基礎,輔以6－芐基嘌呤、2,4－二氯苯氧基乙酸、LAA、萘乙酸和蔗糖等營養素、激素、生長素等。具有誘發時間短、出苗快、增殖頻率高、生長周期短,且苗齊苗壯、生長良好等優點。
文檔編號A01H4/00GK1379972SQ0211524
公開日2002年11月20日 申請日期2002年5月16日 優先權日2002年5月16日
發明者李旭群 申請人:李旭群