專利名稱：防治蔬菜疫病的生防菌株與制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治蔬菜疫病的生防菌株與制劑的制備方法，具體涉及一種微生物菌株綠針假單胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，利用該菌株制備微生物制劑的方法，以及該微生物制劑在防治蔬菜疫病等植物土傳性真菌病害方面的應(yīng)用。屬于生物防治和生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國(guó)的蔬菜種植面積大，產(chǎn)量高。2005年全國(guó)蔬菜種植面積1774萬(wàn)公頃，總產(chǎn)量為5.63億噸。每年因病蟲害而造成的蔬菜經(jīng)濟(jì)損失難以估計(jì)，其中蔬菜疫病是一種常見的蔬菜病害。
蔬菜疫病由鞭毛菌亞門疫霉屬的真菌侵染所致，病原菌可以侵染黃瓜、冬瓜、南瓜、番茄、辣椒、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆等十余種蔬菜，植株的葉、莖、果實(shí)等部位均可發(fā)病。在生產(chǎn)中，為害較重的有黃瓜疫病、辣椒疫病、番茄晚疫病、茄子綿疫病、韭菜疫病等。
高溫多濕季節(jié)易發(fā)生蔬菜疫病，給蔬菜生產(chǎn)帶來(lái)重大損失。防治不及時(shí)則會(huì)造成植株腐爛和大量死亡，引起大量減產(chǎn)，損失嚴(yán)重。
目前控制蔬菜疫病的蔓延的主要措施是噴灑化學(xué)藥劑，但是化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用而引起的各種問題也接踵而來(lái)，如造成殘毒、土質(zhì)退化、污染環(huán)境及病蟲害抗藥性的產(chǎn)生等。對(duì)于人體健康、生態(tài)環(huán)境造成了很大的威脅，不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。目前綠色農(nóng)業(yè)、食品安全、無(wú)公害蔬菜、無(wú)污染蔬菜的概念已日益深入人心。盡管國(guó)外有轉(zhuǎn)基因蔬菜問世，但是其生物安全性仍有爭(zhēng)議。
1980年以來(lái)，利用微生物進(jìn)行植物病蟲害的生物防治方法逐漸受到人們的重視。由于植物根際促生細(xì)菌(PGPR)具有天然防治植物病害與促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特點(diǎn)，并且低毒，對(duì)環(huán)境相容性好，因此研制新型的微生物疫病防治和生長(zhǎng)促進(jìn)菌劑非常必要。綠針假單胞菌是一種常見的拮抗微生物，利用綠針假單胞菌進(jìn)行農(nóng)作物的防治時(shí)有報(bào)告，絕大多數(shù)對(duì)人體無(wú)害。
目前，國(guó)際上能有效防治蔬菜疫病的微生物制劑未見報(bào)道，也沒有防治蔬菜疫病的生物農(nóng)藥的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前對(duì)蔬菜疫病缺乏有效的生物防治手段，提供一種防治蔬菜疫病的生防菌株與制劑的制備方法，得到的生防菌制劑可以防治土傳性真菌病害，對(duì)各種蔬菜作物的疫病有較好的防治效果。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采集不同甜椒根際土樣，取甜椒根須和附著于根須的土壤樣品溶于1/3KMB液體培養(yǎng)基中，并添加抗生素，重復(fù)振蕩培養(yǎng)后，再經(jīng)含同樣劑量抗生素的KMB瓊脂平板培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后用異步培養(yǎng)法進(jìn)行辣椒疫霉抑菌性試驗(yàn)，從中篩選出具有最大抑菌活性的強(qiáng)拮抗菌株——綠針假單胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，該菌株現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏號(hào)為1748。再利用活化冷凍保藏的菌株進(jìn)行放大培養(yǎng)制備微生物制劑，可用于防治各種蔬菜作物的疫病。
本發(fā)明所述的一種防治蔬菜疫病等真菌病害的生防菌株CGMCC 1748的生物學(xué)特性如下1、形態(tài)特征桿狀，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢，單極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。在KMB培養(yǎng)基上形成的1.2mm菌落，菌落可產(chǎn)生橙色色素，圓形，表面凸起，光滑，較粘稠，易挑起，邊緣整齊。
2、培養(yǎng)特征該菌株在在KMB培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成菌落，菌落可產(chǎn)生橙色色素，圓形，表面凸起，光滑，較粘稠，易挑起，邊緣整齊。
3、菌株的生理生化特性能產(chǎn)生熒光色素，能水解脂酶、氧化酶、過氧化氫酶、檸檬酸鹽、明膠，不水解淀粉，不產(chǎn)生H2S。菌株GP72最適培養(yǎng)溫度為28℃～32℃，最適生長(zhǎng)pH值為7.0～8.0，可產(chǎn)生橙色非熒光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖，不產(chǎn)生膿青素，也不進(jìn)行反硝化作用。
4、菌株具有良好的穩(wěn)定性將該菌株置于-70℃冰柜中保存，傳代5次仍保持菌株的活性穩(wěn)定。本菌株的發(fā)酵液在4℃以下可以貯存一年。
本發(fā)明所述的防治蔬菜疫病的生防菌株與制劑的制備方法具體如下1、菌株的獲得采集不同甜椒根際土樣若干，稱取甜椒根須和附著于根須的土壤樣品溶于1/3KMB液體培養(yǎng)基中，甜椒根須、土壤樣品與1/3KMB液體培養(yǎng)基的質(zhì)量比為1∶0.5～3∶30～80，在培養(yǎng)液中添加抗生素氨芐青霉素40μg/ml、氯霉素13μg/ml、放線菌酮100μg/ml，28～32℃下180～280rpm/min搖床振蕩1～2小時(shí)，將6個(gè)平行樣品混和，以減少隨機(jī)性。然后取200μl培養(yǎng)液涂布于含同樣劑量抗生素的KMB瓊脂平板上，在28～32℃條件下培養(yǎng)16～18小時(shí)，待長(zhǎng)出單菌落后用異步培養(yǎng)法進(jìn)行辣椒疫霉抑菌性試驗(yàn)，從中篩選出具有最大抑菌活性的強(qiáng)拮抗菌株，即為綠針假單胞菌GP72(Pseudomonaschlororaphis)，CGMCC 1748。
2、微生物制劑的制備用King’s B培養(yǎng)基(KMB培養(yǎng)基)活化冷凍保藏的CGMCC 1748菌株，然后將上述的培養(yǎng)物移入搖瓶放大培養(yǎng)，按1％～5％接種量進(jìn)行接種后，在水浴搖床中震蕩培養(yǎng)，作為種子液，然后，進(jìn)行搖瓶放大生產(chǎn)或發(fā)酵生產(chǎn)制備微生物制劑，接種量為2％～5％，培養(yǎng)溫度為28℃～32℃，生長(zhǎng)pH值為7.0～8.0，發(fā)酵周期為36～60小時(shí)。
本發(fā)明所述King’s B培養(yǎng)基(KMB培養(yǎng)基)的組分為蛋白胨15～25g，甘油10～20g，KH2PO40.3～0.5g，無(wú)水MgSO40.6～0.9g瓊脂14～20g，pH7.0～8.0，定容至1L。
本發(fā)明所述1/3KMB液體培養(yǎng)基的組分與KMB相同，但無(wú)瓊脂，最后定容至3L。
本發(fā)明制備得到的微生物制劑可用于防治蔬菜疫病等真菌病害，包括對(duì)辣椒、黃瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆等蔬菜的疫病防治，對(duì)油菜菌核病、黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、棉花立枯病、水稻紋枯病等真菌引起的植物土傳病害的防治。經(jīng)試驗(yàn)，對(duì)于辣椒、黃瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子等蔬菜作物的疫病有較好的防治效果，對(duì)于其他的土傳性真菌病害如油菜菌核病、黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病等病害的防治效果達(dá)50～80％。
本發(fā)明的微生物制劑還可用于蔬菜生長(zhǎng)的促進(jìn)劑。使用本發(fā)明的制劑，可有效的促進(jìn)植物的增長(zhǎng)，與對(duì)照和常規(guī)栽培技術(shù)相比，菌劑處理后蔬菜幼苗的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)都明顯加快，生物活菌劑表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作物生長(zhǎng)的作用，可提高收獲物的產(chǎn)量。
本發(fā)明的菌株可以作為生物農(nóng)藥的生產(chǎn)菌株。使用本發(fā)明的制劑可以避免化學(xué)農(nóng)藥造成的土壤污染、土質(zhì)退化、農(nóng)藥殘留、抗藥性病害的產(chǎn)生和再次蔓延等嚴(yán)重的問題。
菌株分類命名綠針假單胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2006年7月保藏編號(hào)1748具體實(shí)施方式
以下通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例11、菌株的獲得采集不同甜椒根際土樣若干，稱取1g甜椒根須和1g附著于根須的土壤樣品溶于50ml 1/3 KMB液體培養(yǎng)基中，并添加抗生素氨芐青霉素(40μg/ml)、氯霉素(13μg/ml)、放線菌酮(100μg/ml)，28℃下230rpm/min搖床振蕩1小時(shí)，將6個(gè)平行樣品混和，從中取200μl培養(yǎng)液涂布于含同樣劑量抗生素的KMB瓊脂平板上。在28℃培養(yǎng)18h待長(zhǎng)出單菌落后用異步培養(yǎng)法進(jìn)行辣椒疫霉抑菌性試驗(yàn)，從中篩選出具有最大抑菌活性的強(qiáng)拮抗菌株，鑒定為綠針假單胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)。
該菌株現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏號(hào)為1748。
2、微生物制劑的制備用King’s B培養(yǎng)基(KMB)活化冷凍保藏的CGMCC1748菌株，然后將上述的培養(yǎng)物移入搖瓶放大培養(yǎng)，按2％接種量進(jìn)行接種后，在水浴搖床中震蕩培養(yǎng)，作為種子液，然后，進(jìn)行搖瓶放大生產(chǎn)或發(fā)酵生產(chǎn)制備微生物制劑，接種量為5％，培養(yǎng)溫度為28℃，生長(zhǎng)pH值為7.0，發(fā)酵周期為48小時(shí)。
上述KMB培養(yǎng)基的組分為蛋白胨18g，甘油16g，KH2PO40.392g，無(wú)水MgSO40.732g瓊脂16g，pH7.5，定容至1L。
上述1/3KMB液體培養(yǎng)基的組分與KMB相同，但無(wú)瓊脂，最后定容至3L。
獲得的微生物制劑對(duì)甜椒疫病的防治應(yīng)用處理方法取上述含GP72菌液的微生物制劑(109CFU/mL)，稀釋150倍，對(duì)甜椒幼苗灌根，葉面噴霧。與對(duì)照和常規(guī)栽培技術(shù)相比，菌劑處理后幼苗的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)都明顯加快，經(jīng)處理的幼苗每株平均株高提高10％以上，葉片數(shù)增加20％以上，花蕾數(shù)增加20％以上。微生物活菌制劑表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作物生長(zhǎng)的作用。
實(shí)施例21、菌株的準(zhǔn)備用接種針挑取冷凍保藏的菌株(綠針假單胞菌GP72)樣品，加入0.2ml無(wú)菌水待樣品溶解后轉(zhuǎn)入KMB培養(yǎng)基培養(yǎng)16小時(shí)。
2、微生物制劑的制備將上述的培養(yǎng)物移入搖瓶放大培養(yǎng)，按3％接種量進(jìn)行接種后，在水浴搖床中震蕩培養(yǎng)，作為種子液，然后，進(jìn)行搖瓶放大生產(chǎn)或發(fā)酵生產(chǎn)制備微生物制劑，接種量為4％，培養(yǎng)溫度為28℃，生長(zhǎng)pH值為7.5，發(fā)酵周期為60小時(shí)。
上述KMB培養(yǎng)基的組分為蛋白胨20g，甘油15g，KH2PO40.50g，無(wú)水MgSO40.75g瓊脂16g，pH7.5，定容至1L。
獲得的微生物制劑對(duì)黃瓜枯萎病的防治應(yīng)用處理方法取上述含GP72菌液的微生物制劑(2*109CFU/mL)，稀釋200倍。將黃瓜種子在菌懸液浸泡30min后瀝干，與干泥拌勻后播種。苗床經(jīng)稀釋的菌懸液澆灌后，供使用。苗床和秧苗以及定植時(shí)，都用稀釋的菌懸液澆灌。分別在定植后的40天考查了霜霉病的發(fā)病率及危害程度，定植后的56天考查了黃瓜枯萎病發(fā)病株數(shù)。發(fā)現(xiàn)與未使用生防菌制劑的常規(guī)栽培對(duì)照組相比，黃瓜的枯萎病發(fā)病率下降75％左右，霜霉病的病情指數(shù)也分別下降90％。表明該制劑能有效地抑制土壤中的枯萎病菌。
權(quán)利要求
1.一種防治蔬菜疫病的生防菌株，其特征在于所述的菌株為綠針假單胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏號(hào)為1748。
2.一種權(quán)利要求1所述的防治蔬菜疫病的生防菌株制劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)菌株的獲得采集不同甜椒根際土樣若干，稱取甜椒根須和附著于根須的土壤樣品溶于1/3KMB液體培養(yǎng)基中，甜椒根須、土壤樣品與1/3KMB液體培養(yǎng)基的質(zhì)量比為1∶0.5～3∶30～80，在培養(yǎng)液中添加抗生素氨芐青霉素40μg/ml、氯霉素13μg/ml、放線菌酮100μg/ml，28～32℃下180～280rpm/min搖床振蕩1～2小時(shí)，將6個(gè)平行樣品混和；然后取200μl培養(yǎng)液涂布于含同樣劑量抗生素的KMB瓊脂平板上，在28～32℃條件下培養(yǎng)16～18小時(shí)，待長(zhǎng)出單菌落后用異步培養(yǎng)法進(jìn)行辣椒疫霉抑菌性試驗(yàn)，從中篩選出具有最大抑菌活性的強(qiáng)拮抗菌株，即為綠針假單胞菌GP72(Pseudomonaschlororaphis)，CGMCC 1748；2)微生物制劑的制備用KMB培養(yǎng)基活化冷凍保藏的CGMCC 1748菌株，然后將上述的培養(yǎng)物移入搖瓶放大培養(yǎng)，按1％～5％接種量進(jìn)行接種后，在水浴搖床中震蕩培養(yǎng)，作為種子液，然后，進(jìn)行搖瓶放大生產(chǎn)或發(fā)酵生產(chǎn)制備微生物制劑，接種量為2％～5％，培養(yǎng)溫度為28℃～32℃，生長(zhǎng)pH值為7.0～8.0，發(fā)酵周期為36～60小時(shí)；其中，所述KMB培養(yǎng)基的組分為蛋白胨15～25g，甘油10～20g，KH2PO40.3～0.5g，無(wú)水MgSO40.6～0.9g瓊脂14～20g，pH7.0～8.0，定容至1L；所述1/3KMB液體培養(yǎng)基的組分與KMB相同，但無(wú)瓊脂，最后定容至3L。
3.一種權(quán)利要求2的防治蔬菜疫病的生防菌株制劑的應(yīng)用，其特征在于用于對(duì)辣椒、黃瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆的疫病防治；用于對(duì)油菜菌核病、黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、棉花立枯病、水稻紋枯病的防治；用于蔬菜生長(zhǎng)促進(jìn)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治蔬菜疫病的生防菌株與制劑的制備方法，首先利用甜椒根須和附著于根須的土壤樣品，以及添加抗生素的KMB培養(yǎng)基，培養(yǎng)篩選出一種綠針假單胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏號(hào)為1748。然后利用活化冷凍保藏的菌株進(jìn)行放大培養(yǎng)，所得到的微生物制劑可用于對(duì)辣椒、黃瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆的疫病防治；用于對(duì)油菜菌核病、黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、棉花立枯病、水稻紋枯病的防治；還可以作為蔬菜生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用，提高蔬菜產(chǎn)量。
文檔編號(hào)A01N63/02GK1932006SQ200610117059
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日
發(fā)明者張雪洪, 劉海明, 蔣海霞, 許煜泉 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)