專利名稱：海洋微生物來源的殺蟲化合物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種殺蟲化合物，特別涉及一種從海洋放線菌南海8號的菌絲體中提取分離的殺蟲化合物ST及其制備方法和應用。
背景技術：
甜菜夜蛾(spoptera exigua Hubner)已成為一種世界性害蟲，由于食性雜，可廣泛為害蔬菜、花卉、藥用作物、牧草等栽培作物，已知寄主多達170種以上。近年來，該蟲的危害逐漸加重，尤其在高溫期為害十分突出，已成為農業生產上的一種重要害蟲。甜菜夜蛾每年可繁殖數代，如福建省每年可繁殖8代，在賓川地區一年發生6～7代，世代重疊。由于在對甜菜夜蛾的防治上仍然主要依賴于大量使用化學農藥，加上操作上的不規范，使甜菜夜蛾普遍產生了抗藥性，其中對有機磷、擬除蟲菊酯類殺蟲劑普遍產生抗藥性，而且抗性發展較快，抗性水平也相對較高，對氨基甲酸酯類殺蟲劑也表現出較高的抗性。甜菜夜蛾對多種藥劑產生的抗藥性問題是不容忽視的，已在國際上引起了廣泛的重視。
尋找新的農用抗生素是當今生物農藥研究領域的一個重要課題，從海洋微生物中尋找有殺蟲活性的抗生素更是研究的熱點。殺蟲抗生素作為農用抗生素中最為重要的一個部分在農用抗生素的研究中占據了重要地位。

發明內容
為了克服上述現有技術的不足，本發明的首要目的在于提供一種海洋微生物來源的殺蟲化合物ST。該殺蟲化合物ST為通過大量的活性篩選從海洋放線菌南海8號菌體中分離純化得到的活性組分。
本發明的另一目的在于提供上述殺蟲化合物ST的制備方法。
本發明的再一目的在于提供上述殺蟲化合物ST的應用，該殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾的較高的生物活性。
本發明所用菌種為海洋放線菌南海8號(Strptomyces sp.GDPPRA NH8)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，學名為Streptomyces sp，菌種在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏時間為2006年9月5日，保藏號為CCTCC NoM 206087。
GDPPRA NH8的形態特征為在高氏一號瓊脂培養基上，基絲乳白至黃白色，氣絲灰褐色，無可溶性色素。
本發明的目的通過下述技術方案實現一種海洋微生物來源的殺蟲化合物的制備方法，包括如下步驟(1)海洋放線菌南海8號的種子培養將高氏一號培養基裝入茄子瓶中，121℃高壓滅菌30mins，取出擺斜面，冷卻凝固后在無菌條件下接入菌種，在28℃下培養4～6d，即菌絲和孢子生長成熟。
(2)海洋放線菌南海8號的的發酵培養將斜面中培養好的菌株制成濃度約為1×107個/ml的孢子懸浮液，取0.2ml孢子懸浮液接入50ml發酵培養基中，30℃160轉/分鐘連續培養96小時后，將培養好的發酵液過濾，收集菌絲體。
(3)在室溫(28±1℃)下將海洋放線菌南海8號的菌絲體用70％乙醇按照W菌絲體∶V70％乙醇為1∶2的比例分別浸提兩次，所得菌絲浸取液濃縮至固體浸膏。
(4)將固體浸膏用乙酸乙酯按照W浸膏∶V乙酸乙脂為1∶2比例分別萃取兩次，將萃取得到溶液濃縮后得到萃取物。
(5)對萃取物進行真空液相層析(硅膠H，100～200目)，通過甲醇溶劑體系進行洗脫。
(6)將真空液相層析后得到的組分進行硅膠柱層析(硅膠H，100～200目)，通過V甲醇∶V三氯甲烷為1∶4進行洗脫，純化得到淡黃色片狀結晶，即為殺蟲化合物。
所述菌種為海洋放線菌南海8號(Strptomyces sp.GDPPRA NH8)，在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏時間為2006年9月5日，保藏號為CCTCC NoM206087。
所述高氏一號培養基優選組成為可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，海水精 3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O1.03g，瓊脂16g，PH7.2～7.4，水1000ml。
所述的發酵培養基組成為大豆蛋白粉30g，蔗糖40g，海水精3g，CaCO32g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，PH7.2～7.4，水1000ml；在121℃高壓滅菌半小時。
一種殺蟲化合物ST就是通過上述制備方法制備而成。
上述殺蟲化合物ST在制備防治甜菜夜蛾的藥劑中的應用，該殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾具有較高的生物活性。
本發明與現有技術相比，其優點和有益效果在于1)本發明殺蟲化合物ST作為一種新型的殺蟲抗生素，對甜菜夜蛾表現出較高的生物活性；并比較系統地研究了對甜菜夜蛾生物活性，為生產上應用提供了理論依據。本發明提取過程簡單，為工業提取奠定了基礎。
2)本發明殺蟲化合物ST本身為一種生物農藥，對環境無污染。
本發明的試驗證明，殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾表現出較高的胃毒和拒食活性，同時也有較好的觸殺活性。甜菜夜蛾各齡幼蟲的胃毒毒力測定結果2齡幼蟲24h、48h和72h的LC50分別為3.02ug/mL、2.34ug/mL和1.42ug/mL，3齡幼蟲24h、48h和72h的LC50分別為6.40ug/mL、5.00ug/mL和2.73ug/mL，4齡幼蟲24h、48h和72h的LC50分別為10.10ug/mL、5.06ug/mL和3.66ug/mL。ST對甜菜夜蛾3齡幼蟲的拒食活性表明濃度為5ug/mL時拒食率在75％以上，對3齡幼蟲的觸殺活性表明在濃度為100ug/mL時24h、48h和72h死亡率都在90％以上，同時試驗結果還表明殺蟲化合物ST對三齡幼蟲的生長發育有明顯的抑制作用。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步詳細的介紹，但本發明的實施方式不限于此。
實施例1殺蟲化合物ST的提取制備a.海洋放線菌南海8號的種子培養改良的高氏一號培養基，其組成為可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，海水精 3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O1.03g，瓊脂16g，PH7.2～7.4，水1000ml；上述培養基配好裝入茄子瓶中，121℃高壓滅菌30mins，取出擺斜面，冷卻凝固后在無菌條件下從菌種保藏砂土小試管中接入菌種(海洋放線菌南海8號)，放在28℃下培養4～6d，即菌絲和孢子生長成熟。
b.海洋放線菌南海8號的發酵培養基大豆蛋白粉30g，蔗糖40g，海水精3g，CaCO32g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，PH7.2～7.4，水1000ml；高壓滅菌鍋121℃下滅菌半小時。
c.海洋放線菌南海8號的發酵培養將斜面中培養好的菌株(海洋放線菌南海8號)制成孢子懸浮液(濃度約為1×107)，取0.2ml孢子懸浮液接入250ml三角瓶，內裝50ml發酵培養基，30℃160轉每分鐘在搖床上連續培養96小時后取出。
d.將上述培養好的發酵液過濾，收集菌絲體。
e.在室溫(28±1℃)下將海洋放線菌南海8號的菌絲體用70％乙醇按照W菌絲體∶V70％乙醇為1∶2的比例分別浸提兩次，所得菌絲浸取液濃縮至固體浸膏。
f.將固體浸膏用乙酸乙酯按照W浸膏∶V乙酸乙脂為1∶2比例分別萃取兩次，將萃取得到溶液濃縮后得到萃取物。
g.應用砂芯漏斗和真空泵組成真空液相層析儀，對萃取物進行真空液相層析(硅膠H，100～200目)，通過2000ml甲醇溶劑體系進行洗脫。
i.將真空液相層析后得到的組分進行硅膠柱層析(硅膠H，100～200目)，通過V甲醇∶V三氯甲烷為14進行洗脫，純化得到淡黃色片狀結晶，即為殺蟲化合物ST。
實施例2本發明的殺蟲化合物ST通過試驗，表明殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾表現出較高的胃毒和拒食活性，同時也有較好的觸殺活性。
殺蟲化合物ST用丙酮稀釋，然后再用V丙酮∶V水＝3∶7進行對半稀釋至所需濃度。采用鱗翅目幼蟲胃毒毒力測定方法測定對各齡幼蟲的活性，采用葉碟法測定拒食活性，采用點滴法測定對甜菜夜蛾的觸殺活性。結果如表1、表2和表3所示。
表2殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性


表1殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾各齡幼蟲的胃毒作用

表3殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾3齡幼蟲的拒食活性

實施例3采用胃毒作用方法在低劑量下觀察殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾三齡幼蟲生長發育狀況，成蟲采用10％蜂蜜和不同濃度化合物ST粗品稀釋液飼喂，觀察對成蟲的影響。
試驗結果表明殺蟲化合物ST能明顯降低甜菜夜蛾的化蛹率，并隨著濃度的增加其雌雄性比明顯增高。殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾成蟲產卵量和雌雄成蟲壽命有顯著的抑制作用。結果如表4和表5所示。
表4殺蟲化合物ST對三齡幼蟲化蛹、蛹重、羽化及雌雄性比的影響

表5殺蟲化合物ST對成蟲產卵量和壽命的影響

從試驗結果看出，本發明的殺蟲化合物ST通過試驗表明對甜菜夜蛾表現出較高的胃毒和拒食活性，同時也有較好的觸殺活性。殺蟲化合物ST能明顯降低甜菜夜蛾的化蛹率，并隨著濃度的增加其雌雄性比明顯增高。殺蟲化合物ST對甜菜夜蛾成蟲產卵量和雌雄成蟲壽命有顯著的抑制作用。甜菜夜蛾為蔬菜上重要害蟲，殺蟲化合物ST作為一種新穎的活性化合物對甜菜夜蛾表現較高的生物殺蟲活性，是一種新型的特效生物農藥。
權利要求
1.一種海洋微生物來源的殺蟲化合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)海洋放線菌南海8號的種子培養將高氏一號培養基裝入茄子瓶中，121℃高壓滅菌30mins，取出擺斜面，冷卻凝固后在無菌條件下接入菌種，在28℃下培養4～6d；(2)海洋放線菌南海8號的的發酵培養將斜面中培養好的菌株制成濃度為1×107個/ml的孢子懸浮液，取0.2ml孢子懸浮液接入50ml發酵培養基中，30℃160轉/分鐘連續培養96小時后，將培養好的發酵液過濾，收集菌絲體；(3)在室溫下將海洋放線菌南海8號的菌絲體用70％乙醇按照W菌絲體∶V70％乙醇為1∶2的比例分別浸提兩次，所得菌絲浸取液濃縮至固體浸膏；(4)將固體浸膏用乙酸乙酯按照W浸膏∶V乙酸乙脂為1∶2比例分別萃取兩次，將萃取得到溶液濃縮后得到萃取物；(5)對萃取物進行真空液相層析，通過甲醇溶劑體系進行洗脫；(6)將真空液相層析后得到的組分進行硅膠柱層析，通過V甲醇∶V三氯甲烷為1∶4進行洗脫，純化得到淡黃色片狀結晶，即為殺蟲化合物。
2.根據權利要求1所述的一種海洋微生物來源的殺蟲化合物的制備方法，其特征在于，所述菌種為海洋放線菌南海8號即Strptomyces sp.GDPPRA NH8，在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏時間為2006年9月5日，保藏號為CCTCCNoM 206087。
3.根據權利要求1所述的一種海洋微生物來源的殺蟲化合物的制備方法，其特征在于所述高氏一號培養基的組成為可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，海水精3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，瓊脂16g，PH7.2～7.4，水1000ml。
4.根據權利要求1所述的一種海洋微生物來源的殺蟲化合物的制備方法，其特征在于所述的發酵培養基組成為大豆蛋白粉30g，蔗糖40g，海水精3g，CaCO32g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，PH7.2～7.4，水1000ml；121℃高壓滅菌半小時。
5.一種海洋微生物來源的殺蟲化合物通過權利要求1所述的制備方法制備而成。
6.權利要求5所述的海洋微生物來源的殺蟲化合物在制備防治甜菜夜蛾的藥劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種海洋微生物來源的殺蟲化合物及其制備方法和應用。該化合物是從海洋放線菌南海8號的菌體中提取分離而得到。該殺蟲化合物對甜菜夜蛾表現出較高的胃毒和拒食活性，同時也有較好的觸殺活性。本發明殺蟲化合物對甜菜夜蛾表現出較高的生物活性；并比較系統地研究了對甜菜夜蛾生物活性，為生產上應用提供了理論依據。本發明提取過程簡單，為工業提取奠定了基礎。
文檔編號A01P7/04GK1923008SQ20061012227
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月21日 優先權日2006年9月21日
發明者林壁潤, 沈會芳, 蒲小明, 潘群英, 李曉剛 申請人:廣東省農業科學院植物保護研究所