專利名稱：番茄黃化曲葉病毒病的嫁接接種鑒定法的制作方法
技術領域：
本發明涉及番茄黃化曲葉病毒病的接種法。
背景技術：
番茄黃化曲葉病毒病是一由煙粉虱(5^^^ ^&d)傳播的雙生病毒，隨 著近年來煙粉虱的大發生，番茄黃化曲葉病毒病成逐年加重趨勢。因此， 建立番茄黃化曲葉病毒病接種鑒定方法并對現有的品種或品系進行抗病性 鑒定已經迫在眉睫。
目前，文獻H. Delatte, H. Holota, B. Reynaud and J. Dintinger. Characterisation of a quantitative resistance to vector transmission of 7bmato ye〃ovv /ea/ ci/W vz'rus in Z^ycopers/cow _p/mp/we//i/b/z'wAn[J]. European Journal of Plant Pathology (2006) 114:245—253報道了一種采用煙粉虱(5e附Wa to&c/)
接種鑒定法，但是，該方法存在一些明顯的缺陷1、受煙粉虱的繁殖生長 季節限制，由于煙粉虱多在夏秋季發生，冬春季煙粉虱很少，所以很難在
冬春季進行煙粉虱接種鑒定。2、受煙粉虱發生地域的限制，由于煙粉虱多
在我國的南方地區發生，因此在北方地區無法糴用煙粉虱接種鑒定發。

發明內容
本發明的目的是提供一種番茄黃化曲葉病毒病的嫁接接種鑒定法，以 克服現有技術存在的上述缺陷。
本發明的方法包括如下步驟 (1)選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對待鑒定的材料進行育苗，待兩片真葉時，采用斜切接法將其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前5
天，保持90 95%的濕度，溫度為20 25。C，遮光育苗，嫁接5天以后， 在40 70%的濕度，溫度為25 3(TC的條件下正常培養育苗；
對待鑒定的材料進行育苗期間，采用阿克泰防止煙粉虱的侵染； 術語"斜切接法"在文獻紀偉鋒.番茄嫁接技術[J].西南科技大學學 報.2005.01:68-69.中有詳細的描述；
(2)嫁接后的15 40天內，提取接穗的DNA，用PCR法檢測接穗中 是否已經含有番茄黃化曲葉病毒病。
所述的PCR法為一種常規的方法，在文獻Zhang Yongping,Zhu weimin CuiHuimei.Molecular identification and the complete nucleotide sequence of TYLCV isolate from Shanghai ofChina[J] .Virus Genes,DOI
10.1007/s 11262-008-0226-0.中有詳細的報道。
所說的番茄的品種選自2300或2583，可采用市售的產品；
本接種鑒定方法有以下優點-
能保證接種鑒定的準確性，接種鑒定方法簡單，可以一年四季或在沒 有煙粉虱發生的地區采用嫁接法進行接種鑒定。


圖1為實施例1的嫁接15天后提取接穗DNA檢測番茄黃化曲葉病毒 病圖片。
圖2為實施例1的嫁接30天后提取接穗DNA檢測番茄黃化曲葉病毒 病圖片。
圖3為實施例2的嫁接15天后提取接穗DNA檢測番茄黃化曲葉病毒 病圖片。圖4為實施例2的嫁接30天后提取接穗DNA檢測番茄黃化曲葉病毒 病圖片。
具體實施例方式
實施例1
番茄的品種選自2300。
(1) 選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對待鑒定的材料進行 育苗，待兩片真葉時，采用斜切接法將其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前3 天，保持90%的濕度，溫度為2(TC，遮光育苗，嫁接5天以后，在50%的 濕度，溫度為25t:的條件下正常培養育苗；
對待鑒定的材料進行育苗期間，采用阿克泰防止煙粉虱的侵染；
(2) 嫁接后的15天，30天，分別提取接穗的DNA，用PCR法檢測
接穗中是否已經含有番茄黃化曲葉病毒病；
具體的步驟如下 接穗的DNA提取方法
1. 1.5ml離心管加入離心管蓋大小的新鮮葉片2片；
2. 加入液氮，用尖頭玻棒輕輕研磨，然后加入250^ilCTAB混合均勻；
3. 65。C水浴lh;
4. 置于4'C冰箱或室溫冷卻至15'C以下；
5. 加入250^il24:l氯仿/異戊醇，上下混勻5min，保證樣品和氯仿充分 混合；
6. 12000rpm離A、10min;
7. 取上清液200pl，加入預先加好200pl異丙醇的1.5ml離心管中，輕輕 上下顛倒混勻；8. 4'C冰箱靜置30min以上；
9. 12000rpm離心10min，棄上清液；
10. 吹干DNA，讓異丙醇揮發干凈；
11. 加入1 OOjil ddH20 (含1 |il 1 Omg/ml的RNase )溶解DNA;
12. 37"C水浴或室溫1小時去除RNA。
PCR法檢測方法 引物序列
CoPR， 5'〉GA(AGCT)G(GC)AT G(ACT)GT(AG)CA (AGT)GCCATATA〈3'
AV494, 5，〉GCC (CT) AT (AG) TA (CT) AG (AG) AAGCC (AC) AG<3，。
PCR反應條件
10mmol/L dNTP 0.5 [xl， 25mmol/LMgcl2 1.5(il，10*PCR Buffer 2.5(il, COPR和AV494各2.5)al， Taq酶0.2U，力口ddH20使體系為25^il。PCR程序為94" 預變性4min; 94。C變性lmin， 50。C退火45s, 72。C延伸45s， 35個循環；72°C 延伸10min。取PCR產物15[！1，于1.5°/。瓊脂糖電泳，觀察結果。
圖1為嫁接15天后提取接穗DNA檢測番茄黃化曲葉病毒病圖片； 圖2為嫁接30天后提取接穗DNA檢測番茄黃化曲葉病毒病圖片。 圖2為嫁接30天后提取接穗DNA檢測番茄黃化曲葉病毒病圖片。 結果表明
嫁接15天時僅在部分接穗體內檢測到TYLCV病毒，而嫁接30天時， 在接穗中都檢測到TYLCV病毒。說明嫁接可以有效的傳播番茄黃化曲葉病毒。嫁接后接穗傳毒，但接穗表現癥狀所需的時間相對煙粉虱接種法要長，
嫁接后40天才在所有接穗中觀察到病癥。
由此可見，采用待鑒定品種作接穗嫁接到感病植株上，嫁接40天后進 行病害調查可以作為番茄黃化曲葉病毒病的接種鑒定方法。
實施例2
番茄的品種選自2583。
1)選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對待鑒定的材料進行育 苗，待兩片真葉時，采用斜切接法將其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前5 天，保持95%的濕度，溫度為25'C，遮光育苗，嫁接5天后，在70%的濕 度，溫度為3(TC的條件下正常培養育苗；
對待鑒定的材料進行育苗期間，采用阿克泰防止煙粉虱的侵染；
(2)嫁接后的15天，30天，分別提取接穗的DNA，用PCR法檢測
接穗中是否已經含有番茄黃化曲葉病毒病；
具體的步驟如下-接穗的DNA提取方法
1、 1.5ml離心管加入離心管蓋大小的新鮮葉片l 2片。2、加入液氮，用尖
頭玻棒輕輕研磨，然后加入'250plCTAB混合均勻。3、 65。C水浴lh。 4、置
于4t:冰箱或室溫冷卻至15。C以下。5、加入250^il24:l氯仿/異戊醇，上下混
勻5min，保證樣品和氯仿充分混合。6、 12000rpm離心10min。 7、取上清液
20(Hd，加入預先加好200pl異丙醇的1.5ml離心管中，輕輕上下顛倒混勻。8、
4。C冰箱靜置30min以上。9、 12000rpm離心10min，棄上清液。10、吹干DNA，
讓異丙醇揮發干凈。11、加入100nlddH20 (含l)il 10mg/ml的RNase)溶解
DNA。 12、 37"C水浴或室溫1小時去除RNA。PCR法檢測方法 引物序列
AV494, 5，>GCC (CT) AT (AG) TA (CT) AG (AG) AAGCC (AC) AG<3,。
PCR反應條件10mmol/LdNTP0.5 pJ， 25mmol/LMgcl2 1.5nU0*PCR Buffer 2.5^d,COPR和AV494各2.5^d， Taq酶0.2U，力口ddH20使體系為25pl。 PCR程序為94。C預變性4min; 94。C變性lmin， 5(TC退火45s， 72""C延伸45s， 35個循環；72。C延伸10min。取PCR產物15jxl，于1.5%瓊脂糖電泳，觀察結果。
圖3為嫁接15天后提取接穗DNA檢測番茄黃化曲葉病毒病圖片。圖 4為嫁接30天后提取接穗DNA檢測番茄黃化曲葉病毒病圖片 結果表明
嫁接15天時僅在部分接穗體內檢測到TYLCV病毒，而嫁接30天時， 在接穗中都檢測到TYLCV病毒。說明嫁接可以有效的傳播番茄黃化曲葉病 毒。嫁接后接穗傳毒，但接穗表現癥狀所需的時間相對煙粉虱接種法要長， 嫁接后40天才在所有接穗中觀察到病癥。
由此可見，采用待鑒定品種作接穗嫁接到感病植株上，嫁接40天后進 行病害調査可以作為番茄黃化曲葉病毒病的接種鑒定方法。 .
權利要求
1.番茄黃化曲葉病毒病的嫁接接種鑒定法，其特征在于，包括如下步驟(1)選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對待鑒定的材料進行育苗，待兩片真葉時，采用斜切接法將其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前3～5天，保持90～95％的濕度，溫度為20～25℃，遮光育苗，嫁接5天以后，在40～70％的濕度，溫度為25～30℃的條件下正常培養育苗；(2)嫁接后的15～40天內，提取接穗的DNA，用PCR法檢測接穗中是否已經含有番茄黃化曲葉病毒病。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，對待鑒定的材料進行育苗期間，采用阿克泰防止煙粉虱的侵染。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所說的番茄的品種選自2300或2583。
全文摘要
本發明提供了一種番茄黃化曲葉病毒病的嫁接接種鑒定法，括如下步驟(1)選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對待鑒定的材料進行育苗，待兩片真葉時，采用斜切接法將其嫁接到感病番茄砧木上，嫁接后的前3～5天，保持90～95％的濕度，溫度為20～25℃，遮光育苗，嫁接5天以后，在40～70％的濕度，溫度為25～30℃的條件下正常培養育苗；(2)嫁接后的15～40天內，提取接穗的DNA，用PCR法檢測接穗中是否已經含有番茄黃化曲葉病毒病。本發明能保證接種鑒定的準確性，接種鑒定方法簡單，可以不受煙粉虱發生時間和地域的限制，可以一年四季或在沒有煙粉虱發生的地區采用嫁接法進行接種鑒定。
文檔編號A01G1/06GK101560571SQ20081003612
公開日2009年10月21日 申請日期2008年4月16日 優先權日2008年4月16日
發明者萬延慧, 力 于, 朱為民, 朱龍英 申請人:上海市農業科學院