一種抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體avctc及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC及其制備方法和應(yīng)用。所述多基因嵌合體AVCTC的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；所述多基因嵌合體AVCTC為番茄TMV病毒復(fù)制酶基因片段ORF400-700、番茄CMV病毒復(fù)制酶基因片段ORF45-345、番茄TYLCV病毒復(fù)制酶基因片段ORF420-720、煙草TMV病毒復(fù)制酶基因ORF2964-3264和黃瓜CMV復(fù)制酶基因ORF2057-2357的嵌合基因，是利用基因合成方法制備而成。將該多基因嵌合體AVCTC轉(zhuǎn)化番茄，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因番茄的抵抗番茄黃化曲葉病毒的能力，為植物抵抗病毒提供有益的幫助。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)期以來(lái)，番茄病毒病一直是生產(chǎn)上的巨大威脅，特別是從六十年代起，隨著番茄在全國(guó)各地極為普遍地種植，該病迅速傳播，廣為流行，日益嚴(yán)重。自1909年美國(guó)發(fā)現(xiàn)第一種番茄病毒_TMV(煙草花葉病毒)以來(lái)，世界各地共相繼報(bào)道了近30種可侵染番茄的病毒。病毒病傳播廣、危害重，又幾乎無(wú)藥可治，這就使得抗病毒病育種成為消除番茄病毒病威脅的主要策略。然而傳統(tǒng)的育種艱苦費(fèi)時(shí)，從而大大限制了育種工作的進(jìn)展。與之相t匕，基因工程育種具有明顯的優(yōu)越性:①育種周期短；②適用范圍廣，尤其適用于傳統(tǒng)育種因缺乏抗原而難以進(jìn)行的抗CMV育種；③在育種過(guò)程中不會(huì)帶入其他不良農(nóng)藝性狀的基因等。因此，基因工程在番茄抗病毒病育種中的應(yīng)用日益受到人們的重視[孫神敏等，自然雜志，2002，25 (3):136-139]。
[0003]番爺黃化曲葉病毒(TYLCV)屬于雙生病毒科(Gemin1-viridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),該病毒屬于雙生病毒亞組III,是一類(lèi)粉風(fēng)傳播的雙生病毒，主要通過(guò)煙粉虱或紅薯白粉虱傳播，可以侵染茄科、豆科等多種植物，超過(guò)20種植物易受TYLCV的影響。
[0004]針對(duì)TYLCV的抗病育種工作開(kāi)始于20世紀(jì)60年代，主要措施是利用雜交將野生番茄中的抗病或耐病基因轉(zhuǎn)育到栽培品種中。1988年，世界上第一個(gè)抗TYLCV的商品化品種TY-20出現(xiàn)了，它表現(xiàn)為雖然感染病毒，但癥狀延遲出現(xiàn)，而且產(chǎn)量還相當(dāng)好。除TY-20之外，另2個(gè)來(lái)自野生抗原Lycopersicon peruuianum的雜交Fl品種也開(kāi)發(fā)成功。植物基因工程在番茄抗病蟲(chóng)育種材料的創(chuàng)新中取得了重要成果。自從Powell等率先獲得煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化植物以來(lái)，在番茄中已有許多類(lèi)似成功的研究報(bào)道。
[0005]利用基因工程獲得抗番茄黃化曲葉病毒材料的研究目前得到很大進(jìn)展。通過(guò)在寄主中表達(dá)病毒衣殼蛋白基因、表達(dá)病毒復(fù)制蛋白mRNA的反義RNA、均可獲得對(duì)該病害的不同程度的抗性。RNA沉默機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為抗病毒基因工程提供了新的途徑，該方面的研究在國(guó)際上已經(jīng)在廣泛進(jìn)行。早在1994年，以色列農(nóng)業(yè)研究組織遺傳系的Kunik等就開(kāi)展了番茄抗黃花曲葉病毒(TYLCV)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，他們將TYLCV病毒的外殼蛋白Vl基因轉(zhuǎn)化番茄，顯著提高了轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)TYLCV病毒的抗性。2007年，巴基斯坦國(guó)家生物技術(shù)和遺傳工程研究所的Mubin等將TYLCV病毒AV2的反義基因?qū)霟煵荩⑻岣吡宿D(zhuǎn)基因煙草對(duì)TYLCV病毒的抗性。
[0006]然而，RNAi技術(shù)抗單個(gè)植物病毒也有其局限性，Canizares等研究報(bào)道，植物病毒存在抑制植物轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機(jī)制，意味著利用RNAi技術(shù)抗一種植物病毒存在巨大風(fēng)險(xiǎn)。只要轉(zhuǎn)基因植物發(fā)生了另一種病毒危害， 則該植物病毒啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默抑制作用將使轉(zhuǎn)基因植物RNAi抗病毒技術(shù)失去了作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種抗番爺黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC及其制備方法和應(yīng)用，并將該多基因嵌合體AVCTC轉(zhuǎn)化番茄，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因番茄的抵抗番茄黃化曲葉病毒的能力，可以為植物抵抗病毒提供有益的幫助。
[0008]本發(fā)明利用基因工程技術(shù)培育抵抗番茄黃化曲葉病毒的植物，具體是將來(lái)自番茄TMV, CMV和TYLCV三種病毒復(fù)制酶基因片段，及煙草TMV復(fù)制酶和黃瓜CMV復(fù)制酶基因的嵌合基因AVCTC (AVI/AV2/ACI/TMVREP/CMVREP)轉(zhuǎn)化到番茄中，從而大大提高番茄對(duì)番茄黃化曲葉病毒的抵抗能力。本發(fā)明必將更好彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種方法的不足，促進(jìn)番茄品種改良事業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展。
[0009]因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一，在于提供一種抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC。
[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二，在于提供一種抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC的制備方法。
[0011]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三，在于提供一種抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC在提高番茄抗番茄黃化曲葉病毒中的應(yīng)用。
[0012]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0013]一種抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所
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[0014]所述的抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC是來(lái)自番茄TMV病毒復(fù)制酶基因片段AVl (0RF400-700)、番茄CMV病毒復(fù)制酶基因片段AV2 (0RF45-345)、番茄TYLCV病毒復(fù)制酶基因片段ACl (0RF420-720)、煙草TMV病毒復(fù)制酶基因TMVREP (0RF2964-3264和黃瓜CMV復(fù)制酶基因CMVREP (0RF2057-2357)的嵌合基因。
[0015]一種抗番爺黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC的制備方法，具體是由來(lái)自番茄TMV病毒復(fù)制酶基因片段AVl (0RF400-700)、番茄CMV病毒復(fù)制酶基因片段AV2 (0RF45-345)、番茄TYLCV病毒復(fù)制酶基因片段ACl (0RF420-720)、煙草TMV病毒復(fù)制酶基因TMVREP (0RF2964-3264)和黃瓜CMV病毒復(fù)制酶基因CMVREP (0RF2057-2357)通過(guò)基因合成法制備而成本發(fā)明的多基因嵌合體AVCTC基因，其所用的引物如下:
[0016]
【權(quán)利要求】
1.一種抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC，其特征在于，所述多基因嵌合體AVCTC是番茄TMV病毒復(fù)制酶基因片段0RF400-700、番茄CMV病毒復(fù)制酶基因片段0RF45-345、番茄TYLCV病毒復(fù)制酶基因片段0RF420-720、煙草TMV病毒復(fù)制酶基因0RF2964-3264和黃瓜CMV復(fù)制酶基因0RF2057-2357的嵌合基因。
3.如權(quán)利要求1所述的抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC的制備方法，具體是由來(lái)自番茄TMV病毒復(fù)制酶基因片段0RF400-700、番茄CMV病毒復(fù)制酶基因片段0RF45-345、番茄TYLCV病毒復(fù)制酶基因片段0RF420-720、煙草TMV病毒復(fù)制酶基因0RF2964-3264和黃瓜CMV病毒復(fù)制酶基因0RF2057-2357通過(guò)基因合成法制備而成，其所用的引物如下:

4.如權(quán)利要求1或2或3所述的抗番茄黃化曲葉病毒的多基因嵌合體AVCTC在提高番茄抗番茄黃化曲葉病毒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103667322SQ201310593843
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】朱波, 姚泉洪, 彭日荷, 韓紅娟, 付曉燕, 趙偉, 田永生, 許晶, 薛永, 高建杰, 韓靜, 王波, 王麗娟, 李振軍 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院