專利名稱：給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法
技術領域：
本發明涉及一種給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法。
背景技術：
番爺黃化曲葉病韋(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV),屬于雙生病韋科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒，因該屬病毒在自然條件下只能由煙粉風(Bemisia tabaci)以持久方式傳播,又被稱為粉風傳雙生病毒。由于氣候變曖和農業種植結構的改變，番茄黃化曲葉病毒的傳毒介體煙粉虱近幾年在北方地區大爆發，使得番茄黃化曲葉病毒近年來在我國各地空前爆發，自南向北迅速擴散和蔓延，給番茄生產
造成嚴重危害。所以，番茄黃化曲葉病毒病的防治已是刻不容緩?？共∑贩N的應用是植物病毒病最有效防治措施之一，不同的番茄品種對病毒病的抗性程度不一，了解品種的抗、耐病程度，對現有品種的利用、抗性材料的篩選和抗病品種的選育都具有重要的意義。而給番茄接種番茄黃化曲葉病毒是鑒定選育番茄抗病品種的前提。

發明內容
本發明的目的是提供一種給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法。本發明所提供的給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法，包括如下步驟將生長至4片真葉的待鑒定番茄植株放入40目網袋內，一個網袋內放入一株所述待鑒定番茄植株，將帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱放入所述網袋內，每個所述網袋內放入6頭所述帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱進行接種傳毒，完成番茄黃化曲葉病毒的接種。其中，所述方法在室內進行。上述方法中，所述室內的溫度可為25_27°C，空氣的相対濕度可為50-60%，光照條件可為每天14小時光照10小時黑暗，所述光照的強度為9千勒克司。實驗證明，本發明給生長至4片真葉的番茄植株以6頭/株的蟲ロ密度單株接種番茄黃化曲葉病毒，對番茄黃化曲葉病毒敏感的植株在接種5-7天就初現發病癥狀，2周后發病率達100%。6頭/株的蟲ロ密度單株接種病毒，可以避免由于粉虱頭數少接種后發病緩慢和發病率偏低以及粉虱頭數多造成蟲害的影響；4片真葉時進行煙粉虱接種病毒，可以避免由于幼苗太小，煙粉虱在植株上繁殖造成植株生長遲緩，影響病毒病的發展和癥狀的觀察。番茄抗病材料的選育及其準確有效的抗性鑒定方法是番茄抗病育種的關鍵，此方法在人工控制的溫濕度及設施條件下，采用煙粉虱接種侵染技術，使用大小均勻一致的番茄植株及單位植株上統ー的蟲ロ密度，應用發病時間、發病率及病情指數三項參數，結合PCR及ELISA兩項檢測指標，對不同番茄品種抗番茄黃化曲葉病毒的抗、耐病水平做了全面科學的評鑒，對抗性材料的篩選和抗病品種的選育具有科學的指導意義。


圖I為各番茄品種中病毒含量的ELISA檢測結果。圖示為每個品種的三次檢測結果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中的基本材料和方法如下I. TYLCV毒原及其保存番茄毒原植株來源于北京房山區韓村河，經PCR檢測鑒定為感染TYLCV。鑒定后的毒原植株移栽于直徑為15cm的塑料盆內，在養苗籠中活體培養保存。(養苗籠長40cmX寬40cmX高70cm的鋼制框架，底層墊塑料板，四周及頂層罩以40目紗網，該養苗籠也作為·養蟲籠用于煙粉風的飼養、同時也用于傳毒后的番爺植株的培養)。該番茄黃化曲葉病毒(周濤等.北京地區番茄黃化曲葉病毒病的鑒定及防治對策.植物保護.2010年第02期)，公眾可從野外采集，也可從北京市農林科學院獲得，以重復本申請實驗。2. Q型煙粉虱的飼養Q型煙粉風均米自房山韓村河，飼養于溫室養蟲籠內的棉花寄主上。飼養溫度26±1°C，相対濕度50% 60%，光照周期每天14小時光照10小時黑暗。該Q型煙粉虱(徐艷霞等.番茄黃化曲葉病毒對B型和Q型煙粉虱雌蟲體長及卵大小的影響.中國蔬菜.2012年第10期)，公眾可從野外采集，也可從北京市農林科學院獲得，以重復本申請實驗。3.帶毒煙粉虱的獲得將棉花上飼養的Q型煙粉風用捕蟲器轉移到保存有毒原植株的養苗籠內。在26°C、相対濕度50% 60%，每天16小時光照8小時黑暗的條件下培養3天，使原先不帶毒的Q型煙粉虱感染TYLCV，同時經PCR檢測鑒定確定Q型煙粉虱感染TYLCV，成為帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱。4.番茄黃化曲葉病毒病的調查番茄黃化曲葉病毒病的發病癥狀按嚴重程度劃分為0、0. 5、1、3、5、7、9共7個等級，分級標準為0級不發病，無癥狀；0. 5級新葉葉緣輕微黃化或輕花葉；I級新葉葉緣明顯黃化，約1/3葉片黃化，葉變小；3級1/3-1/2葉片黃化，頂稍葉片進ー步變小(約1/2正常葉)，病株比健株矮約1/3 ；5級1/2-2/3葉片黃化，頂稍葉片變得更小(約1/3正常葉)，病株比健株矮約1/2 ；7級整個植株葉片黃化、變小，病株比健株矮約1/2 — 3/4 ；9級植株枯死或接近枯死；發病率及病情指數公式發病率=發病的植株數/調查總植株數X 100% ；
病情指數=E (各級病株數X該病級值)/ (調查總株數X最高級數)X 100。5. PCR檢測鑒定為感染TYLCV的方法如下首先提取番茄基因組總DNA或Q型煙粉虱的基因組總DNA作為PCR反應體系的模板；PCR 引物序列為TYLCV-R :5，-CCAATAAGG CGT AAG CGT GTA GAC-3’(序列 1)；TYLCV-F 5’-ACG CAT GCC TCT AAT CCA GTG TA-3’(序列2)，根據TYLCV基因組特異性保守序列設計；PCR 反應程序94で 2min ；94°C 30sec,55°C 45sec,72°C 30sec，共 32 個循環；72で10min，4°C保存。反應完畢后，從PCR產物中取5 yl，以I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統上觀察結果，擴增的目標序列大小應為543bp，如得到543bp的條帶，該番茄植株感染TYLCV。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、煙粉虱傳毒時間(幼苗苗齡)的優化以對番爺黃化曲葉病毒敏感的番爺品種仙客6號作為測試品種來確定煙粉風傳毒的最佳時間，具體的實驗方法如下番爺種子播種于直徑25cm的花盆中，待番爺第I片真葉長出時,移栽于直徑約IOcm的塑料杯內，并將其置于防蟲網室內培養，以避免受煙粉虱或病毒的侵染，待生長至2片、3片、4片真葉時分別用于煙粉虱傳毒實驗。將番茄小苗移栽于直徑約IOcm的塑料杯，緩苗5天左右，生長至2片、3片、4片真葉片時，每個處理挑選出20 30株生長狀況良好，株高一致的植株，放入用于煙粉虱傳毒的微型紗籠內(傳毒微型紗籠由40目尼龍紗網、皮筋等材料制作而成，做成袋子的形狀，以罩住番茄幼苗，粉虱可以從袋子下部吹入，再通過皮筋扎緊)，每個微型紗籠放入I株幼苗，再用捕蟲器捕捉6頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱吹入微型籠內，進行單株接種傳毒，然后將傳毒后的番茄幼苗放入養苗籠內用常規方法培養。詳細觀察和記錄番茄幼苗的蟲害癥狀及番茄黃化曲葉病毒病癥狀的出現時間和病情發展情況。同時設20株未經傳毒處理的對照。其中，整個傳毒過程均在室內進行，室內的溫度為25_27°C，空氣的相対濕度為50-60%，光照條件為每天14小時光照10小時黑暗，光照的強度為9千勒克司。結果表明，煙粉虱傳毒給2片真葉的仙客6號幼苗吋，2周后，仙客6號的發病率為100%，但有明顯的蟲害癥狀，植株生長不良；煙粉虱傳毒給仙客6號3片真葉幼苗吋，2周后，仙客6號的發病率為100%,但有輕微蟲害癥狀,植株生長及病毒病癥狀部分受到蟲害影響；煙粉虱傳毒給仙客6號4片真葉幼苗吋，2周后，仙客6號的發病率為100%，沒有發現明顯的蟲害癥狀，呈現典型的番茄黃化曲葉病毒病癥狀。未經傳毒處理的對照均生長正常，無蟲害癥狀也無番茄黃化曲葉病毒病癥狀。實施例2、煙粉虱傳毒蟲ロ密度的優化以對番爺黃化曲葉病毒敏感的番爺品種仙客6號作為測試品種來確定煙粉風傳毒的最佳蟲ロ密度，具體的實驗方法如下I、人工接種帶毒煙粉虱于番茄幼苗番茄種子播種于直徑25cm的花盆中，待番茄第I片真葉張出吋，按品種劃分，分別移栽于直徑約IOcm的塑料杯內，并將其置于防蟲網室內培養，以避免受煙粉虱或病毒的侵染，待生長至4片真葉時用于煙粉虱傳毒實驗。
將番茄小苗移栽于直徑約IOcm的塑料杯，緩苗5天左右，生長至4片真葉片時，挑選出100株生長狀況良好,株高一致的植株,放入用于煙粉風傳毒的微型紗籠內(傳毒微型紗籠由40目尼龍紗網、皮筋等材料制作而成，做成袋子的形狀，以罩住番茄幼苗，粉虱可以從袋子下部吹入，再通過皮筋扎緊)，每個微型紗籠放入I株幼苗，再用捕蟲器捕捉帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱吹入微型籠內，進行單株接種傳毒。將這100株幼苗(每株幼苗的總葉面積為8平方厘米)分為5個處理，每個處理均為25株。處理I中，每個微型紗籠均分別吹入2頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱；處理2中，每個微型紗籠均分別吹入4頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱；處理3中，每個微型紗籠均分別吹入6頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱；處理4中，每個微型紗籠均分別吹入8頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱；處理5為未經傳毒處理的對照，每個微型紗籠均不吹入煙粉虱。傳毒后，將番茄幼苗放入養苗籠內用常規方法培養。詳細觀察和記錄番茄幼苗的煙粉虱蟲害癥狀和番茄黃化曲葉病毒病癥狀的出現時間和病情發展情況。其中，整個傳毒過程均在室內進行，室內的溫度為25_27°C，空氣的相対濕度為50-60%，光照條件為每天14小時光照10小時黑暗，光照的強度為9千勒克司?！そY果表明，處理1，當使用2頭煙粉虱傳毒給4片真葉的仙客6號幼苗吋，2周后，仙客6號的發病率較低，僅為50%，沒有可見的蟲害癥狀；處理2，當使用4頭煙粉虱傳毒給4片真葉的仙客6號幼苗吋，2周后，仙客6號的發病率也較低，僅為75%，沒有明顯的蟲害癥狀；處理3，當使用6頭煙粉虱傳毒給4片真葉的仙客6號幼苗吋，2周后，仙客6號的發病率為100%，沒有發現明顯的蟲害癥狀，不影響病毒病病級的判斷；處理4，當使用8頭煙粉虱傳毒給4片真葉的仙客6號幼苗吋，2周后，仙客6號的發病率為100%，但有較明顯的蟲害癥狀發生，此時蟲害癥狀已經可以影響到病毒病病級的判斷。未經傳毒處理的對照均生長正常，無蟲害癥狀也無番茄黃化曲葉病毒病癥狀。實施例3、給番茄接種番茄黃化曲葉病毒鑒定番茄對番茄黃化曲葉病毒的抗性I.基本材料和方法I. I番茄品種及其幼苗培育如表I所示，包括仙客6號、金棚I號等13個番茄品種，番茄品種來自北京市農林科學院蔬菜研究中心；番茄種子播種于直徑25cm的花盆中，待番茄第I片真葉張出吋，按品種劃分，分別移栽于直徑約IOcm的塑料杯內，并將其置于防蟲網室內培養，以避免受煙粉虱或病毒的侵染，待生長至4片真葉時用于煙粉虱傳毒實驗。I. 2煙粉虱傳毒(人工接種帶毒煙粉虱于番茄幼苗)每個番茄品種挑選出30株生長狀況良好，株高一致的4片真葉植株，放入用于煙粉虱傳毒的微型紗籠內(傳毒微型紗籠由40目尼龍紗網、皮筋等材料制作而成，做成袋子的形狀，以罩住番茄幼苗，粉虱可以從袋子下部吹入，再通過皮筋扎緊)，每個微型紗籠放入I株幼苗，再用捕蟲器捕捉6頭帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱吹入微型籠內，進行單株接種傳毒。然后將傳毒后的番茄幼苗按品種分類，放入養苗籠內用常規方法培養。詳細觀察和記錄番茄幼苗病毒病癥狀的出現時間和病情發展情況，同時定期進行番茄黃化曲葉病毒的PCR檢測。其中，整個傳毒過程均在室內進行，室內的溫度為25_27°C，空氣的相対濕度為50-60%，光照條件為每天14小時光照10小時黑暗，光照的強度為9千勒克司。I. 3番爺病毒病的調查與分析番茄傳毒后，定期觀察不同番茄品種的初發病時間及病情發展情況，人工接種傳毒較田間自然傳毒發病快，感病品種在傳毒I周后個別植株表現出極其輕微發病癥狀。分別在傳毒I、2、3周后進行PCR檢測，并在2周、3周后調查發病率及癥狀病級，計算其病情指數，同時在3周后對番茄各品種進行病毒含量水平的ELISA檢測，確定TYLCV在不同品種中增值情況的差異。I. 4番茄黃化曲葉病毒病的PCR檢測煙粉虱接種傳毒I周后，感病品種通常已經開始顯現很輕微的發病癥狀。所以，分別在傳韋I、2、3周后，各品種中隨機選擇5株，進打PCR檢測，確定病韋對不冋品種感染時間的相對差距，以此判斷不同品種對TYLCV的易感性。 I. 5ELISA對番茄黃化曲葉病毒的定量檢測煙粉虱傳毒3周后，番茄開始開花坐果，株高已接近養苗籠頂部，不同番茄品種的病情發展及差異已經十分明顯，這時對不同番茄品種進行病毒含量水平的ELISA檢測，確定TYLCV在不同品種中增值的差異，作為判斷番茄抗、耐病程度的指標之一。ELISA采用三抗體夾心檢測法(TAS-ELISA)。檢測的具體步驟參照安德珍生物技術(北京)有限公司ELISA試劑盒提供的步驟進行。結果使用酶聯檢測儀在405nm光度下讀取吸光值0D405，吸光值0D405的大小可反映不同品種的病毒含量水平(見圖I)。2結果與分析2. I病毒的PCR檢測及番茄病情發展調查對13個番茄品種進行了煙粉虱室內人工接種傳毒試驗，傳毒時間是番茄幼苗4片真葉時，煙粉風接種6頭/株。人工接種后感病品種在傳韋I周后就表現出輕微發病癥狀。采用定期觀察的方式，對各番茄品種的發病時間和發病病級進行了詳細記錄，計算其發病率及病情指數。同時采集各品種樣品，針對番茄黃化曲葉病毒進行PCR分子鑒定，傳毒后不同時間進行的PCR檢測及病情調查綜合結果見表I。表I不同番茄品種病情調查及PCR檢測結果
權利要求
1.給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法，包括如下步驟將生長至4片真葉的待鑒定番爺植株放入40目網袋內，一個網袋內放入一株所述待鑒定番爺植株,將帶番爺黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱放入所述網袋內，每個所述網袋內放入6頭所述帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱進行接種傳毒，完成番茄黃化曲葉病毒的接種。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法在室內進行。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述室內的溫度為25-27°C，空氣的相對濕度為50-60%，光照條件為每天14小時光照10小時黑暗，所述光照的強度為9千勒克司。
4.權利要求1-3中任一所述的方法在鑒定番茄對番茄黃化曲葉病毒的抗性中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法。本發明的給番茄接種番茄黃化曲葉病毒的方法，包括如下步驟將生長至4片真葉的待鑒定番茄植株放入40目網袋內，一個網袋內放入一株所述待鑒定番茄植株，將帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱放入所述網袋內，每個所述網袋內放入6頭所述帶番茄黃化曲葉病毒的Q型煙粉虱進行接種傳毒，完成番茄黃化曲葉病毒的接種。本發明給生長至4片真葉的番茄植株以6頭/株的蟲口密度單株接種番茄黃化曲葉病毒，對番茄黃化曲葉病毒敏感的植株在接種1周后就發病，2周后發病率達100%。
文檔編號A01G7/06GK102948336SQ20121045098
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月12日 優先權日2012年11月12日
發明者羅晨, 田兆豐, 劉偉成, 張帆, 盧向陽, 吳慧玲, 劉德文 申請人:北京市農林科學院