專利名稱：：南美水仙組織培養(yǎng)的一組培養(yǎng)基及其標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及南美水仙組織培養(yǎng)的一組培養(yǎng)基配方和標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法。
背景技術(shù)：
：南美水仙(Eucharisgrandiflora)別名大花油加律、亞馬遜百合，屬石蒜科油加律屬多年生常綠鱗莖植物。其株型姿態(tài)優(yōu)雅，其葉片基生寬大，寬橢圓形，花朵碩大，頂生傘形花序，著生5-7朵小花，潔白無(wú)瑕，清香四溢，且一年可多次開(kāi)花，不開(kāi)花時(shí)可作觀葉盆栽，既可點(diǎn)綴庭院，又可盆載布置室內(nèi)，同時(shí)也是鮮切花的好材料，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景廣闊，可作為新興花卉產(chǎn)業(yè)化種類。南美水仙常規(guī)采用分球或播種2種傳統(tǒng)方法進(jìn)行繁殖，繁育速度慢，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，且整齊度差，不能滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求。因此利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，不僅可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量整齊一致的優(yōu)質(zhì)種苗，實(shí)現(xiàn)種苗的標(biāo)準(zhǔn)化、工廠化與規(guī)?；a(chǎn)，而且還可為脫毒研究、新育株系快速擴(kuò)繁及種質(zhì)資源離體保存等工作的開(kāi)展奠定良好的研究基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外在南美水仙優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方面的研究比較欠缺，國(guó)內(nèi)外均無(wú)南美水仙通過(guò)成熟組織培養(yǎng)體系快速繁殖優(yōu)質(zhì)種苗的相關(guān)報(bào)道。僅瞿素萍等報(bào)道過(guò)"南美水仙組培外植體再生體系建立中的關(guān)鍵技術(shù)研究"(《種子》2004年第10期16-17頁(yè))，報(bào)道了通過(guò)對(duì)南美水仙不同外植體類型對(duì)再生體系的影響研究，初步摸索出適宜的處植體類型。但該報(bào)道未公開(kāi)本發(fā)明的內(nèi)容。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的旨在提供一種針對(duì)性強(qiáng)，適用性好，操作簡(jiǎn)單易行，能實(shí)現(xiàn)種苗的標(biāo)準(zhǔn)化控制、工廠化與規(guī)?；a(chǎn)的南美水仙組織培養(yǎng)的一組培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法。本發(fā)明建立起的組織培養(yǎng)體系還能應(yīng)用于南美水仙種質(zhì)資源的保存，在較小空間下實(shí)現(xiàn)大量種質(zhì)資源的離體保存。因此，本發(fā)明對(duì)于南美水仙的可持續(xù)利用及產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，以及種質(zhì)資源保存等方面均具有積極作用和現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明的技術(shù)方案如下1、一組南美水仙組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于，該組培養(yǎng)基由以下五個(gè)培養(yǎng)基組成(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.03.0mg/L萘乙酸(NAA)1.02.0mg/L水解酷蛋白(CH)200300mg/L蔗糖2535g/L瓊月旨5.0~6.0g/LpH5.66.0(2)增殖培養(yǎng)基-MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.02.0mg/L萘乙酸(NAA)0.21.0mg/L蔗糖2535g/L瓊脂5.06.5g/LpH5.66.0g/L(3)繼代增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.02.0mg/L萘乙酸(NAA)0.21.0mg/L蔗糖2535g/L瓊月旨5.06.5g/LpH5.66.0g/L(4)壯苗培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.51.0mg/L萘乙酸(NAA)0.51.0mg/L蔗糖2025g/L瓊月旨5.57.0g/LpH5.66.0g/L(5)生根培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液吲哚乙酸(IAA)0.10.5mg/L萘乙酸(NAA)0.10.5mg/L蔗糖2025g/L瓊脂5.57.0g/LpH5.66.0g/L2、本發(fā)明提供另一組比較優(yōu)選的南美水仙組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的培養(yǎng)基由以下五個(gè)培養(yǎng)基組成(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)2.0mg/L萘乙酸(NAA)1.5mg/L水解酷蛋白(CH)250mg/L蔗糖'30g/L瓊脂5.5g/LpH5.8(2)增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L萘乙酸(NAA)0.5mg/L蔗糖30g/L瓊脂5.5g/LpH5.8(3)繼代增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L萘乙酸(NAA)0.5mg/L蔗糖30g/L瓊脂5.5g/LpH5.8(4)壯苗培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.8mg/L萘乙酸(NAA)0.8mg/L蔗糖20g/L瓊脂6.0g/LpH5.8(5)生根培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液吲哚乙酸(IAA)0.3mg/L萘乙酸(NAA)0.3mg/L蔗糖20g/L瓊脂6.Og/LpH5.83、、本發(fā)明提供的一種南美水仙(Eucharisgrandiflora)組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法，按以下次序的幾個(gè)步驟進(jìn)行(1)、外植體的選擇與滅菌選擇無(wú)病蟲(chóng)危害、生長(zhǎng)健壯、無(wú)病毒癥狀表現(xiàn)、且種植2年以上的南美水仙鱗莖，將其外層12層鱗片剝?nèi)ズ?，用自?lái)水沖洗干凈后，按常規(guī)放入洗衣粉水浸泡幾分鐘，自來(lái)水流水沖洗至無(wú)泡沫，在質(zhì)量百分比為0.10.2。/。的升汞(Hgcl2)溶液中處理1525分鐘，2°/。的次氯酸鈉溶液中處理2025分鐘，無(wú)菌水洗34次后，將帶鱗片的鱗莖基盤(pán)進(jìn)行切塊接種；(2)、誘導(dǎo)培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，將滅菌鱗莖切除約1/41/3的上部鱗片，獲得帶部分鱗片的鱗莖基盤(pán)，將上述獲得的鱗莖基盤(pán)切塊接種到下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在溫度為22土2°C,光照時(shí)間1012h/d，光照強(qiáng)度2000~3000Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)40~60d，可見(jiàn)不定芽或小鱗莖自切口處生成；MS基本培養(yǎng)液6-節(jié)基氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)水解酷蛋白(CH)蔗糖瓊脂pH(3)、增殖培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，一叢，轉(zhuǎn)入下列的增殖培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)蔗糖瓊脂1.03.0mg/L1.02.0mg/L200300mg/L2535g/L5.06.0g/L5.66.0將步驟(2)獲得的不定叢生芽或小鱗莖切分成231.02.0mg/L0.21.0mg/L2535g/L5.06.5g/LpH5.66.0g/L在溫度為25土2'C，光照時(shí)間1012h/d，光照強(qiáng)度15002000Lx的條件下，培養(yǎng)3045d，可使不定芽或鱗莖大量增殖，增殖率可達(dá)45倍；(4)、繼代增殖將第(3)步驟增殖所獲得的不定芽或小鱗莖在無(wú)菌條件下分切為單芽或23個(gè)一叢，接入與第(3)步驟同樣的增殖培養(yǎng)基中，在與第(3)步驟相同的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，可得到大量的無(wú)根不定芽，增殖苗通常無(wú)葉或有葉1片，有葉片的葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯；(5)、壯苗培養(yǎng)將第(4)步驟增殖所獲得的無(wú)葉不定芽或小鱗莖再進(jìn)行重復(fù)繼代，獲得大量繁殖材料；而將帶葉片的不定芽分切為單芽或2芽一叢，轉(zhuǎn)入下列的壯苗培養(yǎng)基中-MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.51.0mg/L萘乙酸(NAA)0.51.0mg/L蔗糖2025g/L瓊脂5.57.0g/LpH5.66.0g/L在溫度為23士2。C，光照時(shí)間1012小時(shí)/天，光照強(qiáng)度15002000Lx的條件下，培養(yǎng)2535d，可使不定芽的植株快速長(zhǎng)高，株高達(dá)1.01.5cm，12片葉，葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯，且基部膨大成鱗莖形；(6)、生根培養(yǎng)將第(5)步驟通過(guò)壯苗培養(yǎng)獲得的苗高約為1.01.5cm，具葉12片的無(wú)根健壯不定芽分切成單芽，轉(zhuǎn)入下列的生根培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液U引哚乙酸(IAA)0.10.5mg/L萘乙酸(NAA)0.10.5mg/L蔗糖2025g/L瓊脂5.57.0g/LpH5.66.0g/L在溫度為22士2'C，光照時(shí)間1012小時(shí)/天，光照強(qiáng)度15002000Lx的條件下，培養(yǎng)2030d，可使不定芽基部或小鱗莖上長(zhǎng)出根25條，根白色，基部具根毛，生根率高達(dá)90%以上，生根苗苗高約為2.03.0cm，23片葉，葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯；(7)、移栽成活將第(6)步驟獲得的南美水仙生根苗從瓶?jī)?nèi)取出，洗凈培養(yǎng)基，移入腐質(zhì)土珍珠巖為1:1的混合基質(zhì)內(nèi)，移栽時(shí)應(yīng)避免將小鱗莖埋入基質(zhì)內(nèi)，但需將根埋入基質(zhì)內(nèi)。栽后澆足水，適當(dāng)保濕，移栽1周內(nèi)相對(duì)濕度應(yīng)保持在80%以上，4050d即移栽成活，成活率可達(dá)95%以上。4、本發(fā)明提供一種比較優(yōu)選的標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法，除以下特征區(qū)別外，其余方法與上述南美水仙組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法相同，其特征區(qū)別在于第(2)步驟的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為權(quán)利要求2(1)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L+CH250mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.8)，光照時(shí)間11h/d，光照強(qiáng)度2500Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)50d;第G)步驟的增殖培養(yǎng)基為權(quán)利要求2(2)中的增殖培養(yǎng)基(MS+6-BAl.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.8)，光照時(shí)間11h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)40d;第(4)步驟的繼代增殖培養(yǎng)基為權(quán)利要求2(3)中的繼代增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+庶糖30g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.8);第(5)步驟的壯苗培養(yǎng)基為權(quán)利要求2(4)中的壯苗培養(yǎng)基(MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.8mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0g/L，pH5.8)，，光照時(shí)間11h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)30d，第(6)步驟的生根培養(yǎng)基為權(quán)利要求2(5)生根培養(yǎng)基(MS+IAA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0g/L，pH5.8)，光照時(shí)間11h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)30d。本發(fā)明提供的各培養(yǎng)基的配制方法均按常規(guī)植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制方法配制，無(wú)特殊要求，操作簡(jiǎn)易。本發(fā)明的有益效果1、常規(guī)的南美水仙繁殖是采用分球或播種2種傳統(tǒng)方法進(jìn)行繁殖，繁育速度慢，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，且整齊度差，不能滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求。本發(fā)明在前期初步探明南美水仙適宜外植體類型的基礎(chǔ)上，針對(duì)上述南美水仙的傳統(tǒng)方法繁育種苗的技術(shù)難點(diǎn)和缺陷，首次提供了一組配套的南美水仙離體組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其配套的標(biāo)準(zhǔn)化快繁技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)模化與標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。通過(guò)組織培養(yǎng)體系的成功構(gòu)建，完成了外植體的選取、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗、生根、移栽等關(guān)鍵技術(shù)的研究，重點(diǎn)通過(guò)"誘導(dǎo)"、"增殖"與"生根"三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的研究，使本發(fā)明優(yōu)化的組織培養(yǎng)基及其標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法針對(duì)性強(qiáng)，適用性好，操作簡(jiǎn)單易行，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，使增殖率達(dá)45倍，生根率達(dá)90%以上，移栽成活率達(dá)95%以上。2、本發(fā)明的體系化極大地提高了種苗的繁殖速度，縮短了生產(chǎn)周期，有效地提高了種苗的品質(zhì)與整齊性，降低了生產(chǎn)成本。3、本發(fā)明采用南美水仙鱗莖盤(pán)等無(wú)性器官作為初始外植體，不僅提高外植體的誘導(dǎo)率，同時(shí)易于固定和保持其無(wú)性系的優(yōu)良種性。4、本發(fā)明還能應(yīng)用于南美水仙種質(zhì)資源的保存，在較小空間下實(shí)現(xiàn)大量種質(zhì)資源的保存。5、本發(fā)明通過(guò)不同外植體類型篩選的研究，推薦選擇帶部分鱗片的鱗莖盤(pán)作為外植體，產(chǎn)生最佳效果。6、本發(fā)明的體系化設(shè)計(jì)，體現(xiàn)在考慮了增殖率與變異率的協(xié)調(diào)、增殖、壯苗、生根效果、生根率和移栽成活率、培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控等諸多因素。特針對(duì)不同的培養(yǎng)階段，根據(jù)不同的培養(yǎng)目的，對(duì)培養(yǎng)基、激素配比、蔗糖濃度以及培養(yǎng)條件等關(guān)鍵因子進(jìn)行調(diào)控，既達(dá)到高效增殖，又保證了不定芽的質(zhì)量。如不同階段的培養(yǎng)基中BA的濃度范圍隨著下調(diào)；在增殖與生根兩個(gè)步驟之間增加了壯苗的環(huán)節(jié)；根據(jù)南美水仙的生長(zhǎng)溫度偏冷涼，但不耐霜凍的習(xí)性，在不同培養(yǎng)階段設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度的調(diào)控，使外植體盡早萌動(dòng)、提高增殖、種苗質(zhì)量和移栽成活率等等。這些從培養(yǎng)基的體系化設(shè)計(jì)到標(biāo)準(zhǔn)化快繁體系化的設(shè)計(jì)，使得用本發(fā)明的培養(yǎng)基和快繁方法能使生根率均達(dá)到90%以上，且移栽成活率高達(dá)95%以上。本發(fā)明的一組培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法中各步驟可單獨(dú)使用，也可一起使用，推薦一組培養(yǎng)基成套使用和標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法一體化采用。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案及其有益效果。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，而這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。以下實(shí)施例所采用的南美水仙(Eucharisgrandiflora)，取南美水仙的健壯鱗莖作為供試材料。以下實(shí)施例所用植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的配制方法均按常規(guī)植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制方法培植，無(wú)特殊要求。實(shí)施例1南美水仙組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法，按以下次序的幾個(gè)步驟進(jìn)行-1、外植體的選擇與滅菌優(yōu)選生長(zhǎng)健壯、開(kāi)花性狀好、無(wú)病蟲(chóng)危害、無(wú)病毒癥狀表現(xiàn)及約2年生以上的南美水仙鱗莖作為外植體，剝?nèi)ネ鈱?層鱗片后，用自來(lái)水沖洗干凈后，按常規(guī)放入洗衣粉水浸泡，浸泡三分鐘后，自來(lái)水流水沖洗至無(wú)泡沫，在O.1%(質(zhì)量百分比)的升汞(Hgcl2)溶液中處理15分鐘，2%的次氯酸鈉溶液中處理20分鐘，無(wú)菌水洗3次后，將帶鱗片的鱗莖基盤(pán)進(jìn)行切塊接種。2、誘導(dǎo)培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，切去滅菌鱗莖約l/4的上部鱗片，將獲得的鱗莖基盤(pán)切塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+CH200mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂5.Og/L，pH5.6)中進(jìn)行培養(yǎng)，在溫度為22士2。C，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)40d，可見(jiàn)大量不定芽或小鱗莖自基盤(pán)切口處生成，每個(gè)基盤(pán)切塊切口處平均可誘導(dǎo)出5.3個(gè)不定芽或小鱗莖，同時(shí)在不定芽與小鱗莖2種誘導(dǎo)類型中，該培養(yǎng)基誘導(dǎo)生成的不定芽所占比例更高。3、增殖培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，將誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的不定叢生芽或小鱗莖切分成23個(gè)一叢，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基((MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂5.Og/L，pH5.6)中進(jìn)行增殖。培養(yǎng)溫度為25士2。C,光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度為1500Lx的條件下，培養(yǎng)30d后，可使不定芽或鱗莖大量增殖，增殖率達(dá)4.8倍。4、繼代增殖將第3步驟增殖培養(yǎng)所獲得的不定芽或小鱗莖在無(wú)菌條件下分切為單芽或23個(gè)一叢，接入與第3步驟同樣的增殖培養(yǎng)基中，在與第3步驟相同的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，可得到大量的無(wú)根不定芽，增殖苗通常無(wú)葉或有葉l片，有葉片的葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯。5、壯苗培養(yǎng)將第3步驟或第4步驟所獲得的無(wú)葉不定芽或小鱗莖再進(jìn)行重復(fù)繼代，獲得大量繁殖材料；而將帶葉片的不定芽分切為單芽或2芽一叢，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中((MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5.5g/L，PH5.6)中進(jìn)行壯苗。在溫度為23士2'C，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度1500Lx的條件下，培養(yǎng)25d后，可使不定芽的植株快速長(zhǎng)高，株高平均達(dá)1.5cm，平均2.l片葉，葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯，且基部膨大成鱗莖形。6、生根培養(yǎng)將第5步驟壯苗培養(yǎng)獲得的苗高平均為l.Ocrn，具l片葉以上的無(wú)根健壯不定芽分切成單芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中((MS+IAA0.1mg/L+NM0.1mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.6)中進(jìn)行生根培養(yǎng)。在溫度為22士2'C，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度1500Lx的條件下，培養(yǎng)20d，可使不定芽基部或小鱗莖上長(zhǎng)出根平均達(dá)2.5條，根白色，基部具根毛，生根率高達(dá)90%以上，生根苗苗高約為2.0cm，平均達(dá)2.1片葉，葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯。7、移栽成活將第6步驟獲得的南美水仙生根苗從瓶?jī)?nèi)取出，洗凈培養(yǎng)基，移入腐質(zhì)土珍珠巖為1:1的混合基質(zhì)內(nèi)，移栽時(shí)應(yīng)避免將小鱗莖埋入基質(zhì)內(nèi)，但需將根埋入基質(zhì)內(nèi)。栽后澆足水，適當(dāng)保濕，移栽1周內(nèi)相對(duì)濕度應(yīng)保持在80%以上，4050d即移栽成活，成活率可達(dá)95%以上。實(shí)施例2南美水仙組織培養(yǎng)的的培養(yǎng)基及其標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法，除以下步驟的條件不同外，其余實(shí)施步驟、順序、方法和條件均與實(shí)施例l相同，不再累述。1、外植體的選擇與滅菌(1)將外植體如前處理后按常規(guī)放入洗衣粉水浸泡，浸泡5分鐘；(2)自來(lái)水流水沖洗至無(wú)泡沫，在0.2。/。的升汞(Hgcl2)溶液中處理25分鐘；(3)2%的次氯酸鈉溶液中處理25分鐘，無(wú)菌水洗4次后，將帶鱗片的鱗莖基盤(pán)進(jìn)行切塊接種。2、誘導(dǎo)培養(yǎng)(1)切去滅菌鱗莖約1/3的上部鱗片；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+CH300mg/L+蔗糖35g/L+瓊脂6.0g/L，pH6.0;(3)光照時(shí)間12h/d;(4)光照強(qiáng)度3000Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)60d，可見(jiàn)大量不定芽或小鱗莖自基盤(pán)切口處生成，每個(gè)基盤(pán)切塊切口處平均可誘導(dǎo)出8.1個(gè)不定芽或小鱗莖。3、增殖培養(yǎng)(1)轉(zhuǎn)入的增殖培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L+庶糖35g/L+瓊脂6.5g/L，pH6.0;(2)光照時(shí)間12h/d;增殖率可達(dá)5.2倍。5、壯苗培養(yǎng)(1)轉(zhuǎn)入的壯苗培養(yǎng)基是MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7.0g/L，pH6.0;(2)光照時(shí)間12h/d;(3)光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)35d后，可使不定芽的植株快速長(zhǎng)高，株高達(dá)1.0cm，平均1.2片葉，葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯，且基部膨大成鱗莖形。6、生根培養(yǎng)(1)將壯苗培養(yǎng)獲得的苗高約為1.5cm，具1片葉以上的無(wú)根健壯不定芽分切成單芽，轉(zhuǎn)入的生根培養(yǎng)基是MS+IAA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7.0g/L，pH6.0;(2)光照時(shí)間12h/d;(3)光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)30d，可使不定芽基部或小鱗莖上長(zhǎng)出根平均達(dá)5.1條，根白色，基部具根毛，生根率高達(dá)90%以上，生根苗苗高約為3.2cm，平均達(dá)2.8片葉，葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯。采用實(shí)施例2的技術(shù)方案實(shí)施，成活率也可達(dá)95%以上。實(shí)施例3南美水仙組織培養(yǎng)的的培養(yǎng)基及其標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法，除以下步驟的條件不同外，其余實(shí)施步驟、順序、方法和條件均與實(shí)施例1相同，不再累述。1、外植體的選擇與滅菌(1)將外植體如前處理后放入洗衣粉水浸泡5分鐘；(2)自來(lái)水清洗干凈，在0.15e/。的升汞(Hgcl2)溶液中處理20分鐘；(3)2%的次氯酸鈉溶液中處理20分鐘，無(wú)菌水洗4次后，將帶鱗片的鱗莖基盤(pán)進(jìn)行切塊接種。2、誘導(dǎo)培養(yǎng)(1)切去滅菌鱗莖約1/3的上部鱗片；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L+CH250mg/L+庶糖30g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.8;(3)光照時(shí)間11h/d;(4)光照強(qiáng)度2500Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)50d，可見(jiàn)大量不定芽或小鱗莖自基盤(pán)切口處生成，每個(gè)基盤(pán)切塊切口處平均可誘導(dǎo)出6.6個(gè)不定芽或小鱗莖。3、增殖培養(yǎng)(1)轉(zhuǎn)入的增殖培養(yǎng)基MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.8;(2)光照時(shí)間11h/d;增殖率可達(dá)5.0倍。5、壯苗培養(yǎng)-(1)轉(zhuǎn)入的壯苗培養(yǎng)基是MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.8mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0g/L，pH5.8;(2)光照時(shí)間11h/d;(3)光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)30d后，可使不定芽的植株快速長(zhǎng)高，株高達(dá)l.Ocm，平均1.3片葉，葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯，且基部膨大成鱗莖形。6、生根培養(yǎng)(1)將壯苗培養(yǎng)獲得的苗高約為1.2cm，具l片葉以上的無(wú)根健壯不定芽分切成單芽，轉(zhuǎn)入的生根培養(yǎng)基是MS+IAA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0g/L，pH5.8;(2)光照時(shí)間llh/d;(3)光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)30d，可使不定芽基部或小鱗莖上長(zhǎng)出根平均達(dá)3.5條，根白色，基部具根毛，生根率達(dá)91%，生根苗苗高約為3.5crn，平均達(dá)2.5片葉，葉色濃綠，生長(zhǎng)健壯。采用實(shí)施例3的技術(shù)方案實(shí)施，成活率也可達(dá)95%以上。實(shí)施例4不同外植體類型的篩選外植體選取了帶部分鱗片的鱗莖盤(pán)、不帶鱗片的鱗莖盤(pán)、內(nèi)層鱗片下部、外層鱗片下部、內(nèi)層鱗片上部、外層鱗片上部、葉片和葉柄8種類型。誘導(dǎo)培養(yǎng)基經(jīng)優(yōu)化篩選，統(tǒng)一使用MS+6-BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+CH300mg/L+蔗糖35g/L+瓊脂6.Og/L，pH6.0為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件統(tǒng)一為在溫度為22±2°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度3000Lx。以上5種外植體類型約取30個(gè)試驗(yàn)材料左右，重復(fù)3次，60d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率及小鱗莖誘導(dǎo)率等平均值，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表l。表l:不同外植體類型的誘導(dǎo)情況比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>通過(guò)以上的比較試驗(yàn)，得出在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基下，以鱗莖盤(pán)的誘導(dǎo)率最高，每塊外植體所誘導(dǎo)的不定芽或小鱗莖的數(shù)量也最多，并且不象葉片或鱗片一樣需先形成愈傷組織，而是直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽或小鱗莖，使成功構(gòu)建組織培養(yǎng)體系的時(shí)間縮短，有效縮短了誘導(dǎo)培養(yǎng)的周期。因此，在本發(fā)明的組織培養(yǎng)技術(shù)體系快速繁殖南美水仙優(yōu)質(zhì)種苗的方法中，外植體的選擇以帶部分鱗片的鱗莖盤(pán)為最佳。實(shí)施例5增殖培養(yǎng)基的篩選表2不同激素濃度及配比對(duì)南美水仙增殖繼代的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>從表2可以看出，隨BA濃度增加，增殖率逐步提高，但變異率也隨之提高，尤其是隨著培養(yǎng)物繼代次數(shù)的增加，變異明顯增加，主要表現(xiàn)為不定芽矮化、葉片不展開(kāi)，皺縮及黃化，再生的小鱗莖變扁，矮化皺縮，有時(shí)幾個(gè)連在一起，無(wú)法分切。因此，在兼顧增殖率與變異率的前提下，BA適宜的濃度范圍應(yīng)為1.02.0mg/L，NAA對(duì)增殖率和變異率的影響不大，范圍可設(shè)置為0.21.0mg/L。值得注意的是，在培養(yǎng)物的前期繼代過(guò)程中，由于激素累積較少，BA可選擇適宜范圍內(nèi)的較高濃度，隨著培養(yǎng)物繼代次數(shù)的增多，激素累積較多時(shí)，激素尤其是BA等細(xì)胞分裂素類的濃度要適當(dāng)下調(diào)，可選擇較低濃度進(jìn)行繼代，這樣交替使用，才能在獲得較高增殖倍數(shù)的前提下，降低變異率，從而提高種苗質(zhì)量，獲得高品質(zhì)的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。同樣根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，為進(jìn)一步提高種苗的質(zhì)量，特在增殖與生根兩個(gè)步驟之間增加了壯苗的環(huán)節(jié)，可獲得品質(zhì)更優(yōu)的不定芽，進(jìn)一步提高了生根率和移栽成活率。實(shí)施例6生根的調(diào)控從表3可見(jiàn)，單獨(dú)使用NAA或IAA，以及NAA和IAA配合使用，均能使南美水仙的不定芽長(zhǎng)根，但生根率和移栽成活率差距較大，以卩引哚乙酸(IAA)O.10.5mg/L配合萘乙酸(NAA)0.10.5mg/L的生根效果較好，30d時(shí)統(tǒng)計(jì)的生根率均達(dá)到90%以上，且移栽成活的情況也比較好，成活率高達(dá)95%以上。表3不同生長(zhǎng)素對(duì)南美水仙生根和成活的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例7培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控從本發(fā)明可看出，對(duì)不同步驟的培養(yǎng)環(huán)境也進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)控，主要表現(xiàn)在培養(yǎng)溫度的調(diào)節(jié)上，如在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，由于外植體才進(jìn)入組培階段，而南美水仙的生長(zhǎng)溫度偏冷涼，但不耐霜凍，生長(zhǎng)適宜溫度為20'C25。C，因此在初始誘導(dǎo)的培養(yǎng)溫度盡量調(diào)節(jié)至南美水仙生長(zhǎng)適宜溫度，設(shè)置為22士2。C,以使初始外植體在與其原生長(zhǎng)相似的培養(yǎng)溫度下盡早萌動(dòng)形成不定芽或小鱗莖。而在增殖階段，由于南美水仙的生長(zhǎng)習(xí)性決定其組培苗生長(zhǎng)較慢，所需繼代時(shí)間較長(zhǎng)，因此將繼代增殖的培養(yǎng)溫度適當(dāng)調(diào)高，設(shè)置為25±2°C，在保證增殖率的前提下，促進(jìn)組培苗的生長(zhǎng)，縮短繼代周期。在壯苗與生根階段，為提高種苗的內(nèi)在品質(zhì)及生根率，特別將培養(yǎng)溫度再調(diào)整至南美水仙的適宜生長(zhǎng)溫度，分別設(shè)置為23土2'C與22±2°C，使壯苗階段能兼顧適當(dāng)增殖與壯苗，而較冷涼培養(yǎng)溫度能促進(jìn)不定芽生根，且能有效提高其移栽成活率。權(quán)利要求1、南美水仙組織培養(yǎng)的一組培養(yǎng)基，其特征在于該組培養(yǎng)基由以下五個(gè)培養(yǎng)基組成。(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.0～3.0mg/L萘乙酸(NAA)1.0～2.0mg/L水解酷蛋白(CH)200～300mg/L蔗糖25～35g/L瓊脂5.0～6.0g/LpH5.6～6.0(2)增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA)0.2～1.0mg/L蔗糖25～35g/L瓊脂5.0～6.5g/LpH5.6～6.0(3)繼代增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA)0.2～1.0mg/L蔗糖25～35g/L瓊脂5.0～6.5g/LpH5.6～6.0(4)壯苗培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.5～1.0mg/L萘乙酸(NAA)0.5～1.0mg/L蔗糖20～25g/L瓊脂5.5～7.0g/LpH5.6～6.0(5)生根培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液吲哚乙酸(IAA)0.1～0.5mg/L萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg/L蔗糖20～25g/L瓊脂5.5～7.0g/LpH5.6～6.02、權(quán)利要求1所述的南美水仙組織培養(yǎng)的一組培養(yǎng)基，其特征在于所述的一組培養(yǎng)基由以下五個(gè)培養(yǎng)基組成。(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)水解酷蛋白(CH)蔗糖瓊脂pH(2)增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)蔗糖瓊脂pH(3)繼代增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)蔗糖瓊脂pH(4)壯苗培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)蔗糖瓊脂PH(5)生根培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液2.01.5250305.81.50.530mg/Lmg/Lmg/Lg/Lg/Lmg/Lmg/Lg/Lg/L1mg/L0.5mg/L30g/L5.5g/L5.80.8mg/L0.8mg/L20g/L6.0g/L5.8口引哚乙酸(IAA)萘乙酸(NAA)0.3mg/L0.3mg/L20g/L瓊脂6.0g/LpH5.83、一種南美水仙組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法，按以下次序的幾個(gè)步驟進(jìn)行(1)、外植體的選擇與滅菌選擇無(wú)病蟲(chóng)危害、生長(zhǎng)健壯、無(wú)病毒癥狀表現(xiàn)、且種植2年以上的南美水仙鱗莖，將其外層12層鱗片剝?nèi)ズ螅米詠?lái)水沖洗干凈后，按常規(guī)放入洗衣粉水浸泡幾分鐘，自來(lái)水流水沖洗至無(wú)泡沫，在質(zhì)量百分比為0.10.2。/。的升汞(Hgc12)溶液中處理1525分鐘，2%的次氯酸鈉溶液中處理2025分鐘，無(wú)菌水洗34次后，將帶鱗片的鱗莖基盤(pán)進(jìn)行切塊接種；(2)、誘導(dǎo)培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，將滅菌鱗莖切除約1/41/3的上部鱗片，獲得帶部分鱗片的鱗莖基盤(pán)，將上述獲得的鱗莖基盤(pán)切塊接種到下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在溫度為22±2°C，光照時(shí)間10~12h/d，光照強(qiáng)度20003000Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)4060d，使不定芽或小鱗莖自切口處生成；MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)水解酷蛋白(CH)蔗糖瓊脂pH(3)、增殖培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，個(gè)一叢，轉(zhuǎn)入下列的增殖培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.02.0mg/L萘乙酸(NAA)0.21.0mg/L蔗糖2535g/L瓊脂5.06.5g/LpH5.66.0g/L在溫度為25±2°C，光照時(shí)間1012h/d，光照強(qiáng)度15002000Lx的條件下，培養(yǎng)3045d，使不定芽或鱗莖大量增殖；(4)、繼代增殖將第3步驟增殖所獲得的不定芽或小鱗莖在無(wú)菌條件下分切為單芽或23個(gè)一叢，接入與第(3)步驟同樣的增殖培養(yǎng)基中，在與第(3)步驟相同的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，得到大量的無(wú)根不定芽，增殖苗通常無(wú)葉或有葉l片，有葉片的葉色濃綠，1.0~3.0mg/L1.02.0mg/L200300mg/L2535g/L5.06.0g/L5.66.0將步驟(2)獲得的不定叢生芽或小鱗莖切分成23生長(zhǎng)健壯；(5)、壯苗培養(yǎng)將第(4)步驟增殖所獲得的無(wú)葉不定芽或小鱗莖再進(jìn)行重復(fù)繼代，獲得大量繁殖材料；而將帶葉片的不定芽分切為單芽或2芽一叢，轉(zhuǎn)入下列的壯苗培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.51.0mg/L萘乙酸(NAA)0.51.0mg/L蔗糖2025g/L瓊月旨5.57.0g/LpH5.66.0g/L在溫度為23±2°C，光照時(shí)間1012h/d，光照強(qiáng)度15002000Lx的條件下，培養(yǎng)2535d，使不定芽的植株快速長(zhǎng)高；(6)、生根培養(yǎng)將第(5)步驟通過(guò)壯苗培養(yǎng)獲得的苗高約為1.01.5on，具葉12片的無(wú)根健壯不定芽分切成單芽，轉(zhuǎn)入下列的生根培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液吲哚乙酸(IAA)0.10.5mg/L萘乙酸(NAA)0.10.5mg/L蔗糖20~25g/L瓊脂5.57.0g/LpH5.66.0g/L在溫度為22±2°C，光照時(shí)間1012h/d，光照強(qiáng)度15002000Lx的條件下，培養(yǎng)2030d，可使不定芽基部或小鱗莖上長(zhǎng)出根；(7)、移栽成活將第(6)步驟獲得的南美水仙生根苗從瓶?jī)?nèi)取出，洗凈培養(yǎng)基，移入腐質(zhì)土珍珠巖為i:l的混合基質(zhì)內(nèi)，移栽時(shí)應(yīng)避免將小鱗莖埋入基質(zhì)內(nèi)，但需將根埋入基質(zhì)內(nèi)。栽后澆足水，適當(dāng)保濕，移栽l周內(nèi)相對(duì)濕度應(yīng)保持在80%以上，4050d即移栽成活。4、權(quán)利要求3所述的標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法，其特征在于第(2)步驟的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為權(quán)利要求2(1)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L+CH250mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.8)，光照時(shí)間11h/d，光照強(qiáng)度2500Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)50d;第(3)步驟的增殖培養(yǎng)基為權(quán)利要求2(2)中的增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.8)，光照時(shí)間11h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)40d;第(4)步驟的繼代增殖培養(yǎng)基為權(quán)利要求2(3)中的繼代增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L，pH5.8);第(5)步驟的壯苗培養(yǎng)S為權(quán)利要求2(4)中的壯苗培養(yǎng)基(MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.8mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0g/L，pH5.8)，，光照時(shí)間11h7d，光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)30d，第(6)步驟的生根培養(yǎng)基為權(quán)利要求2(5)生根培養(yǎng)基(MS+IAA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0g/L，pH5.8)，光照時(shí)間11h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的條件下，培養(yǎng)30d。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了南美水仙組織培養(yǎng)的一組培養(yǎng)基及其標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法，屬植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的南美水仙組織培養(yǎng)的一組培養(yǎng)基由誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、繼代增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基組成。本發(fā)明公開(kāi)的南美水仙組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法分七個(gè)步驟，構(gòu)成南美水仙組織培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化體系。本發(fā)明完成了外植體的選取、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗、生根、移栽等關(guān)鍵技術(shù)的研究，重點(diǎn)通過(guò)“誘導(dǎo)”、“增殖”與“生根”三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的研究，使本發(fā)明優(yōu)化的組織培養(yǎng)基及其標(biāo)準(zhǔn)化快繁方法針對(duì)性強(qiáng)，適用性好，操作簡(jiǎn)單易行，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，使增殖率達(dá)4～5倍，生根率達(dá)90％以上，移栽成活率達(dá)95％以上。文檔編號(hào)A01G31/00GK101238793SQ20081005813公開(kāi)日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年3月4日優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日發(fā)明者張麗芳,彭綠春,曾黎瓊,楊秀梅,段玉云,王麗花,瞿素萍,程在全,艷蘇,琳陸申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院