專利名稱：一種大批量培養網紋藤壺金星幼蟲的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種大批量培養網紋藤壺金星幼蟲的方法。
背景技術：
海洋污損生物(Marine fouling organisms)是海洋環境中棲息或附著在船舶 和各種水下人工設施上,對人類經濟活動產生不利影響，給投資者帶來負效益的 動物、植物和微生物的總稱。污損生物在船舶上的附著會降低艦船航速，縮小 管道內徑，改變金屬腐蝕過程，甚至引發航標移位；在養殖設施上的附著會占 據某些水產養殖對象的有效附著面，妨礙網箱內外水體交換，影響養殖對象的 生長發育；而且某些種類(如藤壺)的附著能力很強， 一旦附著則難以清除。 因此，海洋污損生物的防除工作一直是國內外研究的重點，而該方面的研究工 作需要有大量的污損生物幼蟲作為測試對象。
網紋藤壺5a/m ^ ^"cw/a^y Utinomi作為世界性熱帶和亞熱帶廣布種，也 是我國華南沿海污損生物的優勢種，同時具有很強的附著能力，因此，是海洋 污損生物防除研究的理想實驗材料。藤壺的生活史可分為兩個階段首先為營
浮游生活階段從無節幼蟲脫出卵膜到金星幼蟲時斷時續地探索和選擇適宜附 著物體期間；其后為營固著生活階段從金星幼蟲選好附著基，在其表面附著、
變態發育為藤壺幼體直至成體的階段。從污損的角度來說，藤壺的危害始于其 幼蟲附著變態之后。基于藤壺的生物學特性及其附著機制，金星幼蟲是開展海 洋污損生物防除研究的理想實驗材料，而且也可應用于生物附著機理和海洋環 境保護等領域的研究工作。
自2008年以來，有機錫防污涂料已在全球范圍禁用，研究開發新型環保 防污涂料更為迫切，而相關防污劑篩選和防除測試工作的前提就是解決實驗材 半ij——金星幼蟲的來源問題。因此，網紋藤壺金星幼蟲的培養具有重大的現實 意義和良好的應用前景。
但是，目前在網紋藤壺金星幼蟲的培養方面僅停留在小規模培養階段，雖 然有研究已成功地培養出網紋藤壺金星幼蟲，但其培養僅能為藤壺幼蟲個體發
3育研究提供材料，培養數量不大。對于人工大量培養網紋藤壺金星幼蟲的方法 和技術，迄今國內外均尚未見有關的研究與報道。
此外，由于金星幼蟲短時間內就會附著變態發育成為藤壺幼體，因此，如 何在小水體中獲得大量藤壺金星幼蟲并將其妥善儲存，有效延長其浮游階段的 時間，提高其附著的同步性以滿足測試工作需要，也是確保研制開發新型環保 辨洋防污技術的關鍵。
現有技術公開過關于紋藤壺的培養方法，但(1)該種類生物與網紋藤壺 不同，其主要是北方海區污損生物優勢種，而網紋藤壺是熱帶亞熱帶暖水種、
為華南沿岸海區代表性污損生物優勢種；(2)培養紋藤壺過程中每24小時需 更換新鮮海水一次，增加了額外工作量；(3)紋藤壺培養的餌料為青島大扁藻
(尸/a/^mowos /ze/go/a"d/ca Kylin var. a/"g^3oe"s^ Tseng et T. J. Chang var. nov.);
(4)培養是在無光的環境條件下進行，容易導致作為餌料的藻類沉底，妨礙
幼蟲攝食；(5)該方法未探討金星幼蟲儲存備用的方法，獲得的金星幼蟲需及 時用于研究測試，否則，金星幼蟲很快出現附著變態；(6) 20世紀70 80年 代開展幼蟲培養與防除測試研究時均未進行生物統計分析，通常只設2個平行 重復樣；而目前廣泛采用的生物統計分析方法要求各組(包括空白組、對照組、 實驗處理組)均需設置3 5個平行重復樣，每個平行樣中的幼蟲數量為30個 左右，從而導致測試工作所需幼蟲數量比過去大幅增加， 一個批次培養所獲得 的幼蟲數可能滿足不了測試實驗所需數量。因此已有技術沒有解決網紋藤壺培 養和儲存的技術方案，而且網紋藤壺與紋藤壺是不同的兩個物種，培養紋藤壺 幼蟲的方法也不適合于網紋藤壺幼蟲的培養。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種通過人工生物培養技術， 能在小水體中短時間內獲得大量健康活躍的網紋藤壺金星幼蟲的方法。 本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種大批量培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，包括以下步驟 (1)待網紋藤壺的卵孵化為無節幼蟲后，將無節幼蟲置于有館料的培養 介質中在黑暗環境中恒溫培養；
(2 )恒溫培養過程中對無節幼蟲進行間歇性光照； (3)金星幼蟲出現后即將其冷藏儲存。所述恒溫培養的溫度為29~3 1 °C 。
所述恒溫培養幼蟲時幼蟲的培養密度為1 2個/ml。
所述恒溫培養是在培養箱中進行。 _ 所述間歇性光照的最佳方案是利用早晨或傍晚的自然光，光照時長為
0.5 1小時，具體光照時間的長短取決于作為餌料的扁藻浮起狀況。
所述培養介質為天然海水，但為更好地實現為本發明，海水需經過濾、煮
沸消毒、冷卻至室溫后，放置于經高溫消毒的器皿中備用。 所述冷藏的溫度為2 10°C 。
所述餌料為亞心開鄉扁藻(尸/o^mo"as ^6co/^/orm^ (Wille) Hazen )，扁藻 的投放量是2.5 3.0xl05個扁藻細胞/ml。
本發明所述培養網紋藤壺金星幼蟲的方法的培養水體為1000ml左右，是 一種在小水體中培養網紋藤壺金星幼蟲的方法。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果本發明為本技術領域提供了 一種完全可行的在小水體中大量培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，填充了這一技 術領域中的空白，而且本發明方法網紋藤壺金星幼蟲培養過程的死亡率低、收 獲率高、保存期長、附著同步性強，在克服網紋藤壺金星幼蟲培養過程中死亡 率高、收獲率小、金星幼蟲浮游階段時間短、不可儲存備用的缺點同時，大幅 度提高金星幼蟲的收獲率，延長其浮游時間，促進幼蟲附著的同步性，為篩選 海洋污損生物防污劑和環境毒理學研究提供所需實驗材料，滿足新型防污技術 研究和環保工作發展中有關幼蟲附著測試和毒理試驗的需要。
本發明在小水體環境中，短時間內培育出大批量的供實驗測試所需的網紋 藤壺金星幼蟲，解決了防除測試實驗中需大量具有附著能力的藤壺金星幼蟲的 難題，確保了測試樣本數量得以符合生物統計的要求，為開展各種研究測試工 作提供充足的實驗對象，在防污劑篩選、涂料測試及環境毒理學研究等方面具 有廣闊的應用前景。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案。本發明的實施例由 于實驗設備的性能所限，恒溫是在29 3TC波動，室溫是在25 28'C波動，但 均未超出上述范圍。 實施例1培養介質為天然海水，海水經過濾、煮沸消毒、冷卻至室溫后，放置于經 高溫消毒的器皿中備用。
采集網紋藤壺成熟個體，采樣時挑選較大的個體，且外表完好無損。
解剖成體藤壺，選取成熟受精卵塊放入裝有消毒海水的500 ml燒杯中孵化 (本實施例選用的500ml的燒杯是指采集藤壺卵塊和孵化無節幼蟲時采用的燒 杯，因為燒杯太大不好操作，而燒杯太小水體也少，不利于將未孵化的卵塊和 孵化出的無節幼蟲分開，下同)，再將采集的無節幼蟲移入1000ml的燒杯中按 以下步驟進行培養
(1) 待網紋藤壺的卵孵化為無節幼蟲后，以1000ml海水為培養介質，亞 心形扁藻為餌料(投放量控制在2.5 3.0xlOS個細胞/ml之內)，置于燒杯中再 放入培養箱在黑暗環境中于29 3rC的恒溫條件下培養；海水中幼蟲密度約 1 2個/ml;
(2) 每天早晨和傍晚取出盛有藤壺幼蟲的燒杯接受自然光照0.5小時；
(3) 金星幼蟲大量(目測觀察)出現后，采集發育良好健康活潑的金星 幼蟲個體，開展2 1(TC環境中冷藏儲存試驗。
將采集的幼蟲分為4組，A組為對照組，直接放置于29 3rC恒溫培養箱 中培養；B組在2'C條件下存放48小時后，置于29 3rC恒溫培養箱中培養； C組在4'C條件下存放48小時后，放置于29 3rC恒溫培養箱中培養；而D組 在10。C條件下存放48小時后，放置于29 3rC恒溫培養箱中培養；對照組和 各溫度處理實驗組均設3個以上平行樣以便進行統計分析。
實驗結果顯示，在培養4天后，對照組金星幼蟲的平均附著率為60.1。/。，B 組為84.2%， C組為81.3。/。， D組為80.5。/。。可見，溫度處理組的幼蟲附著率 顯著高于對照組(PO.05),表明金星幼蟲在低溫環境(2~10°C)中保存2天， 不僅沒對其附著能力產生不利影響，而且幼蟲附著的同步性有所提高。
培養介質為天然海水，海水經過濾、煮沸消毒、冷卻至室溫后，放置于經
高溫消毒的器皿中備用。
采集網紋藤壺成熟個體，采樣時挑選較大的個體，且外表完好無損。 解剖成體藤壺，選取成熟受精卵塊放入裝有消毒海水的500 ml燒杯中孵
化，再將采集的無節幼蟲按以下步驟進行培養
6(1) 待網紋藤壺的卵孵化為無節幼蟲后，以海水為培養介質(lOOOml)，
亞心形扁藻為餌料(2.5 3.0xl0S個細胞/ml)，于室溫(25~28°C)黑暗環境中 培養；海水中幼蟲密度為l 2個/ml;
(2) 每天早晨和傍晚將盛有藤壺幼蟲的燒杯接受自然光照1小時； 本實施例中每天定時取樣觀察幼蟲發育狀況并添加適量餌料；
(3) 金星幼蟲開始出現后，采集發育良好健康活潑的幼蟲個體迅速置于 l(TC以下環境中冷藏儲存，并統計金星幼蟲的收獲率。。
實驗結果表明，在室溫(25 28'C波動)的黑暗環境中培養網紋藤壺幼蟲， 其無節幼蟲發育的同步性很差(培養過程中取樣鏡檢時發現第IV、 V、 VI期 的無節幼蟲同時存在)，且金星幼蟲的收獲率低于10%。 實施例3
培養介質為天然海水，海水經過濾、煮沸消毒、冷卻至室溫后，放置于經
高溫消毒的器皿中備用。
采集網紋藤壺成熟個體，采樣時挑選較大的個體，且外表完好無損。 解剖成體藤壺，選取成熟受精卵塊放入裝有消毒海水的500 ml燒杯中孵
化，再將采集的無節幼蟲按以下步驟進行分組培養
(1) 分為四組進行實施，前期均待網紋藤壺的卵孵化為無節幼蟲后，以 1000ml海水為培養介質，亞心形扁藻為與料，將無節幼蟲放入培養箱中在黑 暗環境中恒溫29 3TC培養；海水中幼蟲密度為2個/ml;
四個實驗組的差別在于，亞心形扁藻的投餌量按濃度梯度分別為1.0xl05 個細胞/ml、 2.5xlOS個細胞/ml、 3.0x105個細胞/ml和5.0x105個細胞/ml，進行 對照實驗；其他實驗方法均相同；
(2) 每天早晨和傍晚將盛有藤壺幼蟲的燒杯接受自然光照l小時；期間， 培養幼蟲4天后更換1次海水并添加適量餌料繼續培養；
(3) 金星幼蟲出現后，采集發育良好健康活潑的幼蟲個體，并統計金星 幼蟲的收獲率。
實驗結果表明，扁藻量為1.0xlOS個細胞/ml時，幼蟲一般發育至無節幼蟲 第IV—V期的階段就出現大量死亡，可能與餌料不足、無節幼蟲沒有吃飽有 關；投餌量為2.5 3.0xlOS個細胞/ml時，幼蟲發育快而且整齊，金星幼蟲的收 獲率高于90%;投餌量增至5.0xlOS個細胞/ml時，金星幼蟲的收獲率有所下
7降，可能與藻類密度過高、影響了水質有關。
實施例4
培養介質為天然海水，海水經過濾、煮沸消毒、冷卻至室溫后，放置于經
高溫消毒的器皿中備用。
采集網紋藤壺成熟個體，采樣時挑選較大的個體，且外表完好無損。 解剖成體藤壺，選取成熟受精卵塊放入裝有消毒海水的500ml燒杯中孵
化，再將采集的無節幼蟲按以下步驟進行培養
(1) 待網紋藤壺的卵孵化為無節幼蟲后，以海水為培養介質(1000ml)， 亞心形扁藻為餌料，投餌量為2.5 3.0xlOS個細胞/ml，將無節幼蟲放入培養箱 中在黑暗環境中恒溫29 3TC培養；海水中幼蟲密度為1 2個/ml;
(2) 每天早晨和傍晚將盛有藤壺幼蟲的燒杯接受自然光照0.5小時；
(3) 金星幼蟲大量出現后，采集發育良好健康活潑的幼蟲個體用于下述
冷藏實驗
將采集的幼蟲分為5組，其中A組為對照組，直接放置于29 3TC恒溫培 養箱中；B組在4"條件下存放48小時后，放置于29 3TC恒溫培養箱中；C 組在4。C條件下存放96小時后，放置于29 3TC恒溫培養箱中；而D組在4。C 條件下存放144小時后，放置于29 3rC恒溫培養箱中；E組在4'C條件下存 放20天后，放置于29 3rC恒溫培養箱中進行附著測試；對照組和各冷藏實 驗組均設3個以上平行樣以便進行統計分析。
實驗結果顯示，在恒溫培養箱中培養4天后，對照組平均附著率為60.1%，B 組為81.3%， C組為90.6。/。， D組為85.5。/。。經檢驗，各冷藏處理組幼蟲附著 率均高于對照組(P<0.05)，表明幼蟲的附著率和同步性均有所提高。然而， 如果將冷藏儲存時間延長至20天之后，金星幼蟲不再具備附著變態能力，而 且出現大量死亡。因此，采用本發明的培養方法，金星幼蟲在低溫環境中保存 IO天以內，不會對其附著能力產生不利影響。
權利要求
1.一種大批量培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其特征在于包括以下步驟(1)待網紋藤壺的卵孵化為無節幼蟲后，將無節幼蟲置于有餌料的培養介質中在黑暗環境中恒溫培養；(2)恒溫培養過程中對無節幼蟲進行間歇性光照；(3)金星幼蟲出現后即將其冷藏儲存。
2. 如權利要求1所述的培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其特征在于所述 恒溫培養的溫度為29 31°C 。
3. 如權利要求1所述的培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其特征在于所述 恒溫培養幼蟲時幼蟲的培養密度為1~2個/ml。
4. 如權利要求1所述的培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其特征在于所述 恒溫培養是在培養箱中進行。
5. 如權利要求1所述的培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其特征在于步驟(2) 中所述間歇性光照的是利用早晨和傍晚的自然光進行光照，光照時長為 0.5~1小時。
6. 如權利要求1所述的培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其特征在于所述 培養介質為海水。
7. 如權利要求6所述的培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其特征在于所述 海水經過過濾、煮沸消毒后冷卻至室溫。
8. 如權利要求1所述的培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其特征在于步驟(3) 中所述冷藏的溫度為2 1(TC。
9. 如權利要求1所述的培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其特征在于所述 餌料為亞心形扁藻，投放量為2.5 3.0x105個細胞/ml。
全文摘要
本發明公開了一種大批量培養網紋藤壺金星幼蟲的方法，其包括以下步驟待網紋藤壺的卵孵化為無節幼蟲后，將無節幼蟲置于有餌料的培養介質中在黑暗環境中恒溫培養；恒溫培養過程中對無節幼蟲進行間歇性光照；金星幼蟲出現后即將其冷藏儲存。本發明所提供述的方法可克服金星幼蟲孵化過程中死亡率高、收獲率小且不穩定、附著變態過程迅速而不能進行儲存積累等缺點，大幅度提高金星幼蟲的收獲率，有效延長金星幼蟲浮游階段的時間，促進其附著的同步性，為篩選海洋污損生物防污劑和環境毒理學研究提供所需實驗材料，應用前景廣泛。
文檔編號A01K67/00GK101578967SQ20091004028
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月16日 優先權日2009年6月16日
發明者濤 嚴, 嚴文俠, 曹文浩, 鈺 董 申請人:中國科學院南海海洋研究所