專利名稱：一種用于防治植物病毒病的組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于防治植物病毒病的組合物，具體地說，涉及一種由虎杖提取液及植物源表面活性劑組成的具有抑制植物病毒作用的植物源組合物。

背景技術：
植物病毒病是一種極為嚴重的植物病害，且防治困難，素有“植物癌癥”之稱。植物病毒病害的爆發流行十分廣泛，災害嚴重，幾乎所有蔬菜、糧食作物、果木等都能感染病毒病，進而降低產品品質，甚至能導致其它植物生理性病害的發生，使得農業生產受到巨大的損失。據統計，全世界每年因植物病毒病危害造成的直接損失達150億美元以上。我國每年有許多重要的經濟作物，如煙草、花卉和多種蔬菜作物等感染植物病毒，因病毒病造成的直接經濟損失高達10億美元以上。
植物的病毒危害與其它病原物有著顯著的差異病毒粒體借助其它因素(如昆蟲、人為或自然因素)造成的傷口等進入植物體內，利用植物細胞的信息、能量和酶系統，在寄主細胞中進行核酸(RNA或DNA)和蛋白質外殼的復制，組成新的病毒粒體，完成病毒自身的復制與增殖，還能夠在維管束中隨植物的營養流動方向迅速轉移，使植物周身發病，植物病毒的這種增殖機制給病毒病的防治帶來了極大的困難。植物病毒除奪取受侵染植物營養外，其主要危害在于能夠改變寄主植物的正常代謝過程，干擾或破壞其呼吸作用、光合作用、酶的活性，以及生長素和其他激素的代謝等。
目前，植物病毒病的防治主要有以下幾種措施 1、利用已有的抗源材料植物產生的能抵御某些病原物的特殊性狀，將其穩定并遺傳給子代，然后直接利用這些抗病特性，培育出符合實際生產需要的抗病毒品種。但是該方法育種周期長，而且抗性與產量、品質等性狀很難協調統一。
2、利用化學藥劑控制植物病毒病，如利用殺蟲劑殺死傳毒昆蟲介體，對防治某些病毒病有一定的效果；或者用某些抗生素(如寧南霉素等)作為植物病毒抑制劑抑制病毒。但前者耗費大量人力、物力和時間，而且對非持久性傳播的病毒防治效果較差；而目前有效的植物病毒抑制劑實用化品種很少，具有特效的治療性藥劑更少，此外化學藥劑還存在毒性較高、易產生藥害，對環境污染嚴重等缺點。
3、通過組織脫毒法獲得無病毒病種植材料，即，將未被病毒侵染的植物組織材料(如莖尖，芽尖等)，通過組織培養獲得大量無病毒的健康苗，而后再移栽到大田。該方法主要適用于無性繁殖的農作物，但是其成本高，工作量大，而且易發生田間的再侵染，使得植株的無毒期不長，二三年后就會“舊病復發”，具有一定的局限性。
4、抗病毒植物基因工程，即利用植物抗病毒基因，經過一定的修飾改造后轉入植物細胞，使其獲得抗病毒性，并培育成完整植株，即轉基因植物。但該方法成本高，過程復雜，可操作性差，因此實施較少。
此外，我國自20世紀80年代初開始，陸續研制開發出了高脂膜、NS-83增抗劑、病毒A、植病靈和菌毒清等產品。但是，上述產品雖然在植物病毒防治上取得了一定的效果，但也存在活性較低、毒性高、易產生藥害、開發技術不成熟、成本高等缺點，其應用受到了限制。
為了解決上述問題，本發明人以虎杖提取液為活性組分，配以植物源表面活性劑，組成具有抗病毒活性高、低毒、低殘留且對環境友好的植物源組合物。
虎杖(Polygonum cuspidatum)，蓼科蓼屬，是一種常用的中草藥，用于治療霉菌感染、多種皮膚炎癥，心血管疾病和肝臟疾病等，其具有消腫止痛、清熱去濕、祛毒祛痰、抗微生物等作用。但是將虎杖提取物作為植物病毒抑制劑，用于抑制植物病毒則未見報道。


發明內容
本發明的目的在于提供一種用于防治植物病毒病的植物源組合物，該組合物活性高，且低毒、低殘留、對環境友好。
本發明的另一目的在于提供所述組合物的應用。
為了實現本發明的目的，本發明的一種用于防治植物病毒病的組合物，其由重量比為1～6∶2～9的A、B兩種組分組成； 其中，所述組分A為虎杖提取液；所述組分B為植物源表面活性劑，其由如下重量百分數的原料組成植物蛋白氨基酸液10％～40％、皂角提取液20％～50％、茶皂素補至100％。
優選的是，所述組合物由重量比為5∶2～3的A、B兩種組分組成； 其中，所述組分A為虎杖提取液，所述組分B為植物源表面活性劑，其由如下重量百分數的原料組成植物蛋白氨基酸液25％、皂角提取液30％～45％、茶皂素補至100％。
本發明所述的虎杖提取液通過如下步驟制備將虎杖用乙醇浸泡后，超聲提取，離心取上清液，去除溶劑后，用乙醇定容至虎杖重量的2倍。
具體地說，虎杖與乙醇的重量比為1～5∶5～10，浸泡時間為1～5h，在45℃溫度下超聲提取1～5h，所述乙醇優選為70％乙醇。此外，去除溶劑時的溫度應不高于45℃。
本發明所述的植物蛋白氨基酸液是將植物蛋白在堿性條件(pH＝10～12)下水解制得的氨基酸液，其重量百分比濃度為1％～90％。
所述植物蛋白優選為大豆蛋白。
本發明所述的皂角提取液為水提液，通過市售得到，其重量百分比濃度為1％～90％。
本發明組合物以虎杖提取液為活性組分，該提取液中主要含有大黃素、白藜蘆醇、蒽醌甙、3，4′，5-三羥基芪-3-β-D-葡萄糖甙、鞣質及多種多糖等多種成分，其中，主要功能成分有大黃素和白藜蘆醇。大黃素能抑制植物體內煙草花葉病毒病(TMV)、黃瓜花葉病毒病(CMV)或馬鈴薯Y病毒(PVY)等多種病毒的增殖，同時還能顯著提高煙草植株體內過氧化物酶的活性，增強植物對病毒的抵抗力；白藜蘆醇對植物病毒具有良好的化學預防能力，因此虎杖提取液具有較好的預防和治療植物病毒病的作用。
進一步地，本發明將上述虎杖提取液按一定比例與植物源表面活性劑相配合，所述植物源表面活性劑是由植物蛋白氨基酸液、皂角提取液、茶皂素按一定配比組成。其中，所述植物蛋白氨基酸液為大豆等植物蛋白水解后的水解液，其主要成分包括賴氨酸、丙氨酸、甘氨酸等多種游離氨基酸及部分小肽，這些成分以游離態存在于溶液中，更易被植物細胞吸收，能夠增強植物細胞的耐病力；所述皂角提取液是一種植物表面活性劑，具有降低藥液的表面張力、提高藥劑在受藥表面的附著性和沉積量的作用，從而提高有效成分在有水分條件下的釋放速度和擴展面積，提高防病、治病效果；所述茶皂素具有提高藥液在植物體表的附著力，起到對藥物的協同增效作用。
本發明的組合物在預防、治療植物病毒病方面的應用。
所述應用為虎杖提取液與植物源表面活性劑的組合物與制劑用載體制成植物病毒抑制劑。
所述植物病毒抑制劑為水劑，其按重量百分數的組成為組分A10％～60％、組分B 20％～30％、水補至100％。
優選組成為組分A 50％、組分B 20％～30％、水補至100％。
特別地，在使用本發明組合物制備植物病毒抑制劑時，優選制成水劑。這是因為在制備顆粒劑、散劑等劑型的過程中，需要經過干燥步驟，而干燥時的高溫會破壞虎杖提取液、植物源表面活性劑中的有效成分，從而降低其對植物病毒病的防治效果。
本發明的優點在于，本發明的用于防治植物病毒病的組合物，其組分均來源于植物，能在自然界中降解，不會污染環境及農產品，難以在環境和人體中積累毒性，對人和牲畜相對安全，具有低毒、低殘留的特點，且能夠保持農產品的高品質；通過虎杖提取液與植物源表面活性劑復配，使得組合物具有良好的協同增效作用，活性高、效果顯著，使用方便，能夠高效預防和治療多種植物病毒病。

具體實施例方式 以下實施例用來說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1植物病毒抑制劑水劑(KBD水劑)的制備 1、組分A的制備取2.5公斤虎杖，粉碎至60目加入12.5公斤70％乙醇，浸泡2h后，在45℃溫度下超聲提取2h，離心取上清液，在45℃溫度下去除溶劑，用70％乙醇定容至5公斤，制得虎杖提取液(組分A)，備用。
2、組分B的制備取2公斤大豆在pH＝11的堿性條件下水解，得到4公斤植物蛋白水解液，即植物蛋白氨基酸液，然后加入5公斤皂角提取液及1公斤茶皂素(注皂角提取液及茶皂素均為浙江東方茶業科技有限公司生產)，混合均勻，制得植物源表面活性劑(組分B)。
3、植物病毒抑制劑的制備將5份組分A、3份組分B、2份水混合，制成10公斤水劑KBD。
實施例2 1、組分A的制備取1公斤虎杖，粉碎至60目加入10公斤70％乙醇，浸泡1h后，在45℃溫度下超聲提取5h，離心取上清液，在45℃溫度下去除溶劑，用70％乙醇定容至2公斤，制得虎杖提取液(組分A)，備用。
2、組分B的制備取2公斤大豆在pH＝10的堿性條件下水解，得到5公斤植物蛋白水解液，即植物蛋白氨基酸液，然后加入6公斤皂角提取液及9公斤茶皂素(注皂角提取液及茶皂素均為浙江東方茶業科技有限公司生產)，混合均勻，制得植物源表面活性劑(組分B)。
3、植物病毒抑制劑的制備將1份組分A、3份組分B、6份水混合，制成10公斤水劑KBD。
實施例3 1、組分A的制備取1公斤虎杖，粉碎至60目加入5公斤70％乙醇，浸泡5h后，在45℃溫度下超聲提取2h，離心取上清液，在45℃溫度下去除溶劑，用70％乙醇定容至2公斤，制得虎杖提取液(組分A)，備用。
2、組分B的制備取2公斤大豆在pH＝12的堿性條件下水解，得到4公斤植物蛋白水解液，即植物蛋白氨基酸液，然后加入2公斤皂角提取液及4公斤茶皂素(注皂角提取液及茶皂素均為浙江東方茶業科技有限公司生產)，混合均勻，制得植物源表面活性劑(組分B)。
3、植物病毒抑制劑的制備將6份組分A、2份組分B、2份水混合，制成10公斤水劑KBD。
以下通過實驗來進一步說明本發明。
實驗例1虎杖提取液單劑與組合物水劑抑制TMV病毒的對比試驗1試驗材料 按實施例1方法制備的虎杖提取液(組分A單劑)、實施例1的植物病毒抑制劑水劑(KBD水劑)、新葉煙苗(Nicotiana glutinosa)、煙草花葉病毒病(TMV)。
2防治TMV病毒藥效實驗 2.1試驗方法 1、將新葉煙苗用摩擦接種法接種TMV病毒，待其發病后選擇病毒病害顯癥同等級別的煙苗，隨機分為虎杖提取液200倍組、虎杖提取液500倍組、KBD水劑200倍組、KBD水劑500倍組及對照組，每組30株煙苗。
2、將虎杖提取液、KBD水劑分別用清水稀釋200倍、500倍(按重量比稀釋)，按組別均勻噴灑發病煙苗葉面，對照組噴灑清水，24小時后測定煙苗葉片內病毒濃度。
3、用間接酶聯免疫吸附法測定煙苗葉片內TMV病毒濃度 用0.04M，pH＝9.5的碳酸鹽包被緩沖液(Na2CO3及NaHCO3)，封閉液為0.2％(體積分數)血清蛋白抗血清，工作濃度為1∶1200倍，用磷酸酶標記A蛋白檢測TMV與TMV抗血清的特異性免疫反應，以硝基苯磷酸作底物，在25℃培養箱恒溫放置3小時，顯色后，用DG-3021A敏聯免疫吸附儀(南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司)測定并記錄OD值，結果如表1所示。
表1 防治TMV病毒藥效實驗結果
2.2結果分析 從表1可以看出，KBD水劑200倍組的病毒濃度下降77.88％，虎杖提取液200倍組的病毒濃度下降47.85％，KBD水劑(組合物)比虎杖提取液單劑的防效高1.6倍；結果表明，本發明的虎杖提取液與植物源表面活性劑按一定比例復配后，植物源表面活性劑起到極大的增效作用，與虎杖提取液單劑相比，本發明的組合物對防治TMV病毒的活性顯著提高。
實驗例2溫室生測藥效試驗 1、試驗條件 供試病毒煙草花葉病毒病(TMV)、黃瓜花葉病毒病(CMV) 供試作物辣椒(茄門) 2、分組方法和藥劑用量 在溫室中，將生長至3葉期的辣椒植株隨機分為空白對照組、藥劑對照組及5個不同濃度處理組共7組，每組10株苗，重復3次。空白對照組噴施水、藥劑對照組噴施2％寧南霉素水劑(菌克毒克，黑龍江強爾生化技術開發有限公司)、處理組噴施實施例1的植物病毒抑制劑水劑(KBD水劑)，各組于2009年11月11日進行噴霧處理，施藥4小時后摩擦接種病毒，各組施藥劑量如表2所示。
表2 各組施藥劑量
3、調查方法及分級標準 接種病毒后按常規管理培養，于2009年12月5日調查接種株發病情況，記載病情級別，估算其嚴重度，計算出病情指數(DI)。病情分級標準如表3所示。
表3 病情分級標準 4、結果與分析 KBD水劑對TMV、CMV的防治效果如表4所示。
表4 KBD防治TMV、CMV試驗結果
注防效＝(對照處理平均病情指數-藥劑處理平均病情指數)/對照處理平均病情指數×100％；表中同列數據后標有相同字母者，表示在0.05水平下差異不顯著(LSD法) 由表4可以看出，不同濃度的KBD水劑均可防治由TMV、CMV侵染辣椒引起的病毒病，特別是在稀釋濃度小于400倍時，KBD水劑的防治效果接近50％，顯著優于對照藥劑寧南霉素。
實驗例3 田間藥效試驗 1、試驗條件 試驗地點中國農業科學院煙草研究所即墨試驗站。
試驗作物云煙85(煙草)。
防治對象煙草花葉病毒病(TMV)。
環境條件土壤類型為淋溶褐土，肥力中等；試驗期間氣象條件為多云轉晴。2009年4月22日播種，2009年5月24日移栽前人工接種病毒，2009年6月2日移栽時施藥，株距為50cm，行距為100cm，田間歷年煙草病毒病的發生危害嚴重。
2、試驗安排與設計 分組安排隨機分為5個小區，每小區50株煙苗，3次重復。
噴施藥劑、藥量3個不同濃度處理組噴施實施例1的植物病毒抑制劑水劑(KBD水劑)，分別按重量比稀釋200倍、400倍和600倍；藥劑對照組噴施按重量比稀釋200倍的2％寧南霉素水劑(黑龍江強爾生化技術開發有限公司)；空白對照組噴施水。
噴施時間在病害始發期，于2009年6月2日進行第一次葉面噴霧施藥，每隔7天施藥1次，施藥3次。
調查方法與病情分級標準于2009年6月30日調查接種株發病情況，記載病情級別，估算出嚴重度并計算出病情指數(DI)。病情分級標準如表5所示。
表5 病情分級標準 3、試驗結果與分析 3次施藥后14天，煙草病毒病的病情指數及KBD水劑對TMV的防治效果如表6所示。
表6 3次施藥后煙草病毒病的病情指數及KBD水劑的防治效果

注表中同列數據后標有相同字母者，表示在0.05水平下差異不顯著(LSD法) 由表6可以看出，不同濃度的KBD水劑均可防治煙草病毒病TMV，其中以稀釋200倍對煙草病毒病TMV的防治效果最好，防治效果達48％以上，顯著優于其他濃度的KBD水劑，并且在相同的使用稀釋倍數下，KBD水劑防治效果明顯優于已得到市場承認的2％寧南霉素水劑，KBD水劑稀釋200～500倍后使用對作物無不良影響，安全無藥害。
雖然，上文中已經用一般性說明、具體實施方案及藥效實驗對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種用于防治植物病毒病的組合物，其特征在于，其由重量比為1～6∶2～9的A、B兩種組分組成；
其中，所述組分A為虎杖提取液；所述組分B為植物源表面活性劑，其由如下重量百分數的原料組成植物蛋白氨基酸液10％～40％、皂角提取液20％～50％、茶皂素補至100％。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，其由重量比為5∶2～3的A、B兩種組分組成；
其中，所述組分A為虎杖提取液，所述組分B為植物源表面活性劑，其由如下重量百分數的原料組成植物蛋白氨基酸液25％、皂角提取液30％～45％、茶皂素補至100％。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述虎杖提取液通過如下步驟制備將虎杖用乙醇浸泡后，超聲提取，離心取上清液，去除溶劑后，用乙醇定容至虎杖重量的2倍。
4.根據權利要求3所述的組合物，其特征在于，虎杖與乙醇的重量比為1～5∶5～10，浸泡時間為1～5h，在45℃溫度下超聲提取1～5h，所述乙醇為70％乙醇。
5.根據權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述植物蛋白氨基酸液是將植物蛋白在堿性條件下水解制得的氨基酸液，其重量百分比濃度為1％～90％。
6.根據權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述植物蛋白為大豆蛋白。
7.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述皂角提取液為水提液，其重量百分比濃度為1％～90％。
8.權利要求1-7任意一項所述組合物在預防、治療植物病毒病方面的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，其為與制劑用載體制成植物病毒抑制劑。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述植物病毒抑制劑為水劑，其按重量百分數的組成為組分A 10％～60％、組分B20％～30％、水補至100％。
全文摘要
本發明提供了一種用于防治植物病毒病的組合物，其由重量比1～6∶2～9的A、B兩種組分組成；其中，所述組分A為虎杖提取液；所述組分B為植物源表面活性劑，其由如下重量百分數的原料組成植物蛋白氨基酸液10％～40％、皂角提取液20％～50％、茶皂素補至100％。本發明的用于防治植物病毒病的組合物，其組分均來源于植物，能在自然界中降解，不會污染環境及農產品，同時難以在環境和人體中積累毒性，對人和牲畜相對安全，具有低毒、低殘留的特點，能夠保持農產品的高品質；且活性高、效果顯著，使用方便，能夠高效預防和治療多種植物病毒病。
文檔編號A01P1/00GK101766195SQ20101010382
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月29日 優先權日2010年1月29日
發明者邢福銘, 馬玉海, 朱健偉, 徐向榮 申請人:北京清源保生物科技有限公司