本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種植物抗病毒相關(guān)蛋白GmSN1及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物病毒是可以感染高等植物的病毒，目前已知3700多種，分屬于7個(gè)目、111科。不同種類的植物病毒可以感染不同的宿主植物，使被侵染植物出現(xiàn)不同的癥狀。多數(shù)植物病毒是單鏈RNA（ssRNA）病毒，也有的核酸成分為單鏈DNA、雙鏈DNA和雙鏈RNA。大豆花葉病毒病是一種常見的大豆病害，是由大豆花葉病毒（Potyviridae,SoybeanMosaicVirus,SMV）引起的，該病毒為馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯病毒屬的一個(gè)種。大豆花葉病毒與其它馬鈴薯病毒屬成員的共同點(diǎn)是種子帶毒，蚜蟲為主要傳毒介體。大豆花葉病毒的體外保毒期在環(huán)境為室溫、4℃和0℃以下分別為4-5天、15天和120天左右，其致死溫度為58-66℃，稀釋限點(diǎn)為10-5。大豆花葉病毒可以通過種子在上下代和不同地域之間傳播，在田間又可通過汁液摩擦接種及蚜蟲進(jìn)行非持久性傳播。大豆花葉病毒病危害重、流行廣，難以控制。該病于1899年首次在中國(guó)東北發(fā)現(xiàn)，相繼又在美國(guó)、朝鮮、德國(guó)、蘇聯(lián)等國(guó)家發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已成為世界性病害，嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來該病在中國(guó)東北地區(qū)發(fā)生越來越嚴(yán)重，一般流行年造成減產(chǎn)25%-60%，大流行年可造成絕產(chǎn)。例如1978年中國(guó)皖北阜陽地區(qū)大豆花葉病猖獗，造成150萬畝大豆絕產(chǎn)。大豆花葉病毒在植株上的癥狀主要分花葉和壞死兩大類。花葉類癥狀表現(xiàn)為感染初期嫩葉上出現(xiàn)明脈，隨著病程的發(fā)展，陸續(xù)出現(xiàn)輕花葉、花葉、黃斑花葉、葉片向下反卷，有些還出現(xiàn)皰葉、畸形葉、皺縮、矮化、增厚發(fā)脆，莖桿和豆莢上的茸毛消失，產(chǎn)生“光莢”。壞死型癥狀主要表現(xiàn)為感染初期葉片上出現(xiàn)褐色小枯斑或葉脈壞死，隨后壞死部分?jǐn)U大甚至連成一片，嚴(yán)重者導(dǎo)致葉片脫落。某些品種感染特定株系后，主莖生長(zhǎng)點(diǎn)壞死，形成所謂的“頂枯”。大豆花葉病毒病不但影響大豆的產(chǎn)量，還影響大豆的種子質(zhì)量，可造成病株籽粒出現(xiàn)褐斑，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)病籽粒率高達(dá)50%以上，嚴(yán)重降低大豆的商品價(jià)值。斑紋的發(fā)生受大豆品種和發(fā)病程度的影響。大豆花葉病毒病在籽粒上形成的斑紋顏色與臍色一致或稍深，有時(shí)斑紋會(huì)遍布整個(gè)籽粒表面，多數(shù)呈現(xiàn)放射狀或帶狀。吳宗璞將斑駁按顏色劃分為淡褐斑、深褐斑、赤褐斑、紫褐斑、黑色斑、灰蘭斑和雙色斑7種；按形狀分為河川狀、輪紋狀、放射狀、不規(guī)則斑塊狀、花斑和臍一側(cè)雙條帶斑6種。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種植物抗病毒相關(guān)蛋白GmSN1及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，來自大豆，命名為GmSN1蛋白，是如下（1）或（2）：（1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（2）將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病毒病相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使（1）中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6（通常為5個(gè)）RRRRRPoly-His2-10（通常為6個(gè)）HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述（2）中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述（2）中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述GmSN1蛋白的基因（命名為GmSN1基因）也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因具體可為如下（1）或（2）或（3）或（4）的DNA分子：（1）編碼區(qū)如序列表的序列2所示的DNA分子（開放閱讀框）；（2）序列表的序列3所示的DNA分子（基因組DNA）；（3）在嚴(yán)格條件下與（1）或（2）限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病毒病相關(guān)蛋白的DNA分子；（4）與（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同一性且編碼植物抗病毒病相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗。上述嚴(yán)格條件也可為：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。含有所述GmSN1基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3′端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所述重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述GmSN1基因插入pB7FWG2載體的重組位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1。所述重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1的構(gòu)建方法具體如下：①合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子；②以步驟①合成的雙鏈DNA分子為模板，采用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；③步驟②的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pDONOR221載體發(fā)生BP重組反應(yīng)，得到中間質(zhì)粒；④中間質(zhì)粒與PB7FWG2載體發(fā)生LR重組反應(yīng)，得到重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1，重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1中，attB1位點(diǎn)和attB2位點(diǎn)之間為序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子；F1：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGAAGCTCGAGTTCGCAAA-3′；R1：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAGGGCATTTGTCCTTGCC-3′。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述GmSN1基因?qū)肽康闹参镏校玫綄?duì)植物病毒病的抗性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述GmSN1基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。所述方法中，所述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述GmSN1基因具體可通過所述重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1導(dǎo)入所述目的植物中。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為大豆，如大豆栽培品種P03-8-23。所述植物病毒病具體可為由大豆花葉病毒強(qiáng)毒3號(hào)株系引起的植物病毒病。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述GmSN1基因?qū)肽康闹参镏校玫綄?duì)植物病毒的抗性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述GmSN1基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。所述方法中，所述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述GmSN1基因具體可通過所述重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1導(dǎo)入所述目的植物中。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為大豆，如大豆栽培品種P03-8-23。所述植物病毒具體可為由大豆花葉病毒強(qiáng)毒3號(hào)株系。本發(fā)明還保護(hù)所述GmSN1蛋白、所述GmSN1基因或所述重組載體在培育對(duì)植物病毒病的抗性增高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為大豆，如大豆栽培品種P03-8-23。所述植物病毒病具體可為由大豆花葉病毒強(qiáng)毒3號(hào)株系引起的植物病毒病。本發(fā)明還保護(hù)所述GmSN1蛋白、所述GmSN1基因或所述重組載體在培育對(duì)植物病毒的抗性增高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為大豆，如大豆栽培品種P03-8-23。所述植物病毒具體可為大豆花葉病毒強(qiáng)毒3號(hào)株系。本發(fā)明對(duì)于培育抗植物病毒病的轉(zhuǎn)基因植物具有重大的應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（B6F7015和B6F7016）的T2代植株進(jìn)行PCR鑒定的部分結(jié)果。圖2GmSN1的表達(dá)水平檢測(cè)。圖3轉(zhuǎn)基因植株的southernblot鑒定。圖4T1代轉(zhuǎn)基因大豆的抗病鑒定結(jié)果，A為苗期，B為花期。圖5為T2代轉(zhuǎn)基因大豆的抗病鑒定結(jié)果（花期）。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。pDONOR221載體：Invitrogen公司“MultisiteGateway?ProPlusKitfor2-,3-or4-fragmentrecombination”試劑盒中的組件，Cat.#12537-100，公眾可以從商業(yè)途徑獲得。pB7FWG2載體：Plantsystembiology公司產(chǎn)品，http://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pB7FWG2/search/index/，公眾可以從商業(yè)途徑獲得。農(nóng)桿菌EHA101：參考文獻(xiàn)：RegenerationStudyofSoybeanCultivarsandTheirSusceptibilitytoAgrobacteriumtumifaciensEHA101.ActaAgronSin,2003,29(5):664-669.大豆栽培品種P03-8-23，中黃35和九農(nóng)9號(hào)：P03-8-23由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所利用栽培九農(nóng)27和平安1008雜交選育獲得的大豆品系；以上品種公眾可以從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所獲得。大豆花葉病毒強(qiáng)毒3號(hào)株系（SMVSC-3）：參考文獻(xiàn)：鄭翠明，常汝鎮(zhèn)，邱麗娟，吳宗璞，高鳳蘭。大豆種質(zhì)資源對(duì)SMV3號(hào)株系的抗性鑒定。大豆科學(xué)，2000，19(4)：299-306，公眾可以從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所獲得。實(shí)施例中所用到的各個(gè)培養(yǎng)基的配方見表2。MS合成鹽購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)為M5524。B5合成鹽購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)為G5768。表2培養(yǎng)基配方GMCCMSIMSEMRMMS合成鹽MSsaltmixture–––1×1/2×B5合成鹽B5saltmixture1×1/10×1×––2-(4-嗎啉)乙磺酸MES/g·L–1–3.900.590.590.596-芐基腺嘌呤6-BAP/mg·L–1–1.671.67––赤霉素GA3/mg·L–1–0.25–0.50–乙酰丁香酮AS/mM–0.20–––L半胱氨酸L-Cys/mg·L–1400.00二硫蘇糖醇DTT/mg·L–1154.20替卡西林Tic/mg·L–1250.00250.00250.00頭孢霉素Cef/mg·L–1––100.00100.00100.00L-天冬酰胺L-Asp/mg·L–1–––50.0050.00谷氨酰胺Glu/mg·L–1–––50.0050.00草丁膦Glufosinate/mg·L–1––5.005.00–吲哚乙酸IAA/mg·L–1–––0.10–玉米素ZR/mg·L–1–––1–吲哚丁酸IBA/mg·L–1––––1蔗糖Sucrose（w/v）2.003.003.003.002.00瓊脂Agar/g·L–14.508.008.00植物凝膠Phytagar/g·L–13.003.00pH5.805.405.705.705.60實(shí)施例1、GmSN1蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)將中黃35（大豆花葉病毒病抗病品種）和九農(nóng)9號(hào)（大豆花葉病毒病感病品種）分別播種于裝有滅菌土的紙杯中，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí)，溫度25℃。每個(gè)品種分為兩組——實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組在第一片三出復(fù)葉摩擦接種大豆花葉病毒，對(duì)照組不接種大豆花葉病毒。感病品種實(shí)驗(yàn)組葉片出現(xiàn)輕微花葉時(shí)，進(jìn)行取材，取材部位為剛發(fā)病的葉片，對(duì)照組取與其對(duì)應(yīng)位置的葉片。這樣共得到四個(gè)樣本。從各個(gè)樣本中提取RNA并進(jìn)行Affymetrix芯片（Affymetrix公司大豆芯片#900525，可從美國(guó)Affymetrix公司購(gòu)得）雜交，篩選出各組合比較表達(dá)差異在2倍以上的基因片段一批。在此基礎(chǔ)上依次獲取全長(zhǎng)基因并驗(yàn)證抗病毒功能。進(jìn)行大量驗(yàn)證試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)一種蛋白，如序列表的序列1所示，將其命名為GmSN1蛋白。將編碼GmSN1蛋白的基因命名為GmSN1基因，其開放閱讀框如序列表的序列2所示，其基因組DNA如序列表的序列3所示(序列表的序列3中，自5’末端第265-346位核苷酸和第484-668位核苷酸為外顯子)。實(shí)施例2、應(yīng)用GmSN1基因培育抗病大豆一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。2、以步驟1合成的雙鏈DNA分子為模板，采用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。F1：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGAAGCTCGAGTTCGCAAA-3′；（序列表序列4）R1：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAGGGCATTTGTCCTTGCC-3′。（序列表序列5）F1中的下劃線標(biāo)注attB1位點(diǎn)，R1中的下劃線標(biāo)注attB2位點(diǎn)。3、步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pDONOR221載體發(fā)生BP重組反應(yīng)，得到中間質(zhì)粒。4、中間質(zhì)粒與pB7FWG2載體發(fā)生LR重組反應(yīng)，得到重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1。重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1中，attB1位點(diǎn)和attB2位點(diǎn)之間為序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、將重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA101，得到重組農(nóng)桿菌。2、用CCM液體培養(yǎng)基懸浮重組農(nóng)桿菌，得到OD600nm=0.5～0.8的菌懸液。3、取大豆栽培品種P03-8-23的種子，在含有氯氣的密閉容器中滅菌12-16個(gè)小時(shí)。4、完成步驟3后，取種子，種臍朝下置于GM培養(yǎng)基平板上，23℃暗培養(yǎng)24小時(shí)。5、完成步驟4后，取種子，用無菌解剖刀沿種臍切開，并去掉腋芽，在腋芽上方凹槽處平行于中軸劃3～4個(gè)切口，然后置于步驟2得到的菌懸液中浸泡30～40分鐘。6、完成步驟5后，將種子移至鋪有無菌濾紙的CCM培養(yǎng)基平板上，23℃暗培養(yǎng)4～5天。7、完成步驟6后，將種子轉(zhuǎn)移至SIM培養(yǎng)基平板上，25℃、16h（光）/8h（暗）培養(yǎng)，每2～3周繼代1次,共繼代培養(yǎng)3～5次。8、完成步驟7后，將誘導(dǎo)出叢生芽的外植體上的子葉切去，置于SEM培養(yǎng)基平板上，25℃、16h（光）/8h（暗）培養(yǎng)，每2～3周繼代1次，共繼代培養(yǎng)2～3次，繼代時(shí)去掉褐化的愈傷組織。9、完成步驟8后，當(dāng)再生芽生長(zhǎng)至4～8cm時(shí)，將再生芽切下后轉(zhuǎn)移至RM培養(yǎng)基平板上，25℃、16h（光）/8h（暗）培養(yǎng)。10、完成步驟9后，當(dāng)再生植株長(zhǎng)出2條以上的根，移至煉苗室馴化3～5天，然后轉(zhuǎn)移至溫室中生長(zhǎng)，得到T0代植株。11、T0代植株單株自交，獲得T1代植株。12、將T0代植株和T1代植株分別進(jìn)行PCR鑒定，方法如下：提取基因組DNA，將基因組DNA作為模板，采用F2和R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果同時(shí)得到264bp和403bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定結(jié)果為陽性；如果只得到了403bp大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，則鑒定結(jié)果為陰性。F2：5’-ATGAAGCTCGAGTTCGCAAA-3’；（序列表序列6）R2：5’-AGGGCATTTGTCCTTGCC-3’。（序列表序列7）13、T1代植株單株自交，獲得T2代植株。14、取T2代植株，按照步驟12的方法進(jìn)行PCR鑒定。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(B6F7015和B6F7016)的T2代植株進(jìn)行PCR鑒定的部分結(jié)果見圖1。圖1.部分轉(zhuǎn)基因株系PCR鑒定的結(jié)果。（1、2為B6F7015株系的兩個(gè)單株擴(kuò)增產(chǎn)物，3、4為B6F7016株系的兩個(gè)單株擴(kuò)增產(chǎn)物）15、轉(zhuǎn)基因植株外源基因表達(dá)水平檢測(cè)：（1）采用Trizol試劑（Ambion，15596-026），按照說明書方法，分別提取受體植株、轉(zhuǎn)基因植株和陰性植株的總RNA；（2）反轉(zhuǎn)錄：采用SuperScript?（Invitrogen，11754-050）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書方法得到cDNA。(3)檢測(cè)基因表達(dá)水平：采用TOYOBO實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Toyobo,QPK-212)，以cDNA為模板，F(xiàn)2和R2為引物，PCR儀器為AbiStepOnePlus，按照說明書方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GmSN1在各株系中的表達(dá)水平。從圖2中可見在兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中GmSN1比受體植株和陰性轉(zhuǎn)基因植株分別高672和100倍。圖2.GmSN1的表達(dá)水平檢測(cè)16、轉(zhuǎn)基因植株的southernblot鑒定。Southern雜交方法如下：(1)酶切基因組DNA：分別提取兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系各3個(gè)單株、受體植株和轉(zhuǎn)基因陰性植株的基因組DNA，各取20μg基因組DNA加入20μlPromegabufferH，3μlEcoRI(Promega），2μl100XBSA，ddH2O補(bǔ)足到200μl，37℃酶切24小時(shí)。然后凍干機(jī)凍干酶切樣品，加入50μlddH2O溶解。(2)標(biāo)記雜交探針：在0.2mlPCR管中加入需要標(biāo)記的DNA(一般使用1ug標(biāo)記后分幾次使用)，用雙蒸餾水將體積稀釋到15μl,放入沸水中變性10分鐘，快速放于冰上。加入HexanucleotideMix（10×）2μl，dNTPLabelingMix2μl，Klenowenzymelabelinggrade1μl；混合后瞬時(shí)離心，37℃反應(yīng)24小時(shí)，加入0.2MEDTA（pH8.0）2μl，終止反應(yīng)，或者65℃加熱10分鐘終止反應(yīng)。(3)電泳：1%瓊脂糖凝膠電泳酶切的大豆基因組DNA，電壓13V電泳36h。分離后的瓊脂糖凝膠在紫外燈下切膠，切除膠孔，留下溴酚藍(lán)指示劑，大概膠孔至溴酚藍(lán)指示劑留下位置長(zhǎng)度不超過10cm，否則無法裝入雜交管。在凝膠右上角切掉一個(gè)角作為標(biāo)記。記錄凝膠尺寸。使用脫嘌呤試劑（1.1%HCl）處理凝膠8~10min，保持凝膠晃動(dòng)，直至溴酚藍(lán)從藍(lán)色變?yōu)辄S色。用去離子水清洗兩次，進(jìn)行下一步。使用變性液（NaCl8.766%，NaOH2%）處理脫嘌呤后的凝膠30min，保持凝膠晃動(dòng)，可發(fā)現(xiàn)溴酚藍(lán)又變回藍(lán)色。用去離子水清洗兩次，使用中和液（Trizmabase0.0605%，NaCl0.08766%，用濃HCl調(diào)pH至7.5），處理變性后的凝膠30min，保持凝膠晃動(dòng)。用去離子水清洗兩次。(4)轉(zhuǎn)膜：裁取兩張濾紙，使用大膠板搭橋，尺寸33cm×26cm。再裁取比凝膠尺寸稍大一點(diǎn)濾紙3—4張（最好橫豎紋與搭橋時(shí)濾紙橫豎紋方向一致），尼龍膜1張。在尼龍膜的一面右下角標(biāo)注好樣品、酶切及時(shí)間，并在右上角剪掉一角做標(biāo)記，與凝膠匹配。此時(shí)，有標(biāo)注的一面則是背面，另一面上有DNA。裁取大量與尼龍膜大小相同或稍大的吸水紙。利用虹吸作用，從下到上依次是：兩張搭橋用濾紙、凝膠、尼龍膜、3—4張濾紙、吸水紙、玻璃板、重物。每張濾紙或凝膠或膜之間不能有氣泡，用玻璃棒趕平，加入轉(zhuǎn)移液（氯化鈉17.532%，檸檬酸鈉0.0882%，用固體NaOH調(diào)pH至7.0），再用保鮮膜將凝膠四周包圍，并覆蓋托盤，減少轉(zhuǎn)移液揮發(fā)，確保轉(zhuǎn)移液只能通過凝膠、尼龍膜、濾紙等向上吸。注意更換吸水紙。(5)雜交：雜交：使用紫外交聯(lián)儀固定轉(zhuǎn)移到尼龍膜上的DNA，設(shè)定70000uJ/cm2。膜正面有DNA一面朝上進(jìn)行紫外交聯(lián)。使用25ml空白雜交液（SDS7%,formamide(deionize)50%,5×SSC,Blockingsolution2%,N-lauroylsarcosine0.1%,SodiumPhosphate,pH7.0,50mM）42℃預(yù)雜交大于2小時(shí)。含有探針的雜交液從冰箱中拿出，沸水煮10min，立即放于冰上冷卻，進(jìn)行變性。加1μl標(biāo)記好的Marker混入雜交液中。回收空白雜交液，凍入冰箱，換成含有探針的雜交液雜交過夜。次日將含探針雜交液回收，凍入冰箱，加入洗液I（1×SSC,0.1%SDS），65℃15min，洗膜一次。加入洗液II（0.5×SSC,0.1%SDS），65℃20min，洗膜兩次。以上兩步洗去多余探針。以下步驟在常溫下進(jìn)行，加入Washingbuffer（馬來酸buffer：馬來酸0.1M，NaCl0.15M，用NaOH調(diào)pH至7.5；加3μl/mlTween-20）適量，輕度漂洗1~5分鐘。加入Blockingsolution（blockingreagent1%溶于100ml馬來酸buffer），雜交管中反應(yīng)，兩次30分鐘/次，封閉蛋白。將Antibody（即離心檢測(cè)試劑盒中3號(hào)試劑）10000rpm離心5min，每次使用前都需要離心，吸取上清1μl加入Blockingsolution，配制成Antibodysolution。將上步中Blockingsolution倒出，加入Antibodysolution，雜交管中反應(yīng)60分鐘。換管，將膜從Antibodysolution中拿出，換入Washingbuffer（洗液I：1×SSC，0.1%SDS；洗液II：0.5×SSC，0.1%SDS）中漂洗2次，每次15分鐘。(6)檢測(cè)：洗掉多余抗體，將Washingbuffer倒出，加入Detectionbuffer(Tris-HCl0.1M，NaCl0.1M，用HCl調(diào)pH至9.5)，2～5分鐘。提前配制好CSPDsolution，取10μlCSPD原液，用Detectionbuffer稀釋至1.5ml，鋪好保鮮膜，將雜交膜帶有DNA的一面朝上放置，加入1mlCSPDsolution，通過左右上下調(diào)節(jié)保鮮膜快速將CSPDsolution均勻涂滿整張膜，充分反應(yīng)5分鐘后，除去多余的CSPDsolution，回收用過一次的CSPDsolution。將雜交膜置于37℃反應(yīng)15分鐘。以增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)，要將膜裸露正面向上放置。將膜正面朝下放在保鮮膜上，用保鮮膜包裹住尼龍膜，用酒精棉擦平膜的正反面，確保保鮮膜與尼龍膜間無氣泡產(chǎn)生，之后于暗室中置于X-ray底片曝光30分鐘以上。將壓好的片子依次放入顯影液、停影液(低濃度醋酸溶液，取2ml左右溶于自來水中即可)、定影液。之后用水沖洗，掛著晾干。可見2個(gè)轉(zhuǎn)基因植株系的植株中各帶有1個(gè)拷貝的外源基因(southernblot結(jié)果見圖3)。將雜交過的雜交膜放在雙蒸水中漂洗2～5min，用洗膜液(0.1％SDS，0.2MNaOH)在37℃中漂洗兩次，每次15分鐘，再用2×SSC漂洗5分鐘，保鮮膜包好，-20℃保存以備下次雜交或可以直接預(yù)雜交。圖3.轉(zhuǎn)基因植株的southernblot鑒定。B6F7015和B6F7016株系的各選3個(gè)單株，質(zhì)粒載體為陽性對(duì)照，P03-8-23為轉(zhuǎn)化受體陰性對(duì)照，Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)于某一T1代植株來說，如果該植株與其T2代植株均為鑒定陽性，該T1代植株為純合的轉(zhuǎn)基因植株，該植株及其自交后代為轉(zhuǎn)基因株系。利用純合的轉(zhuǎn)基因基因株系開展后續(xù)研究。三、空載體質(zhì)粒的獲得：pB7FWG2載體中有自殺基因ccdB，它在普通原核細(xì)菌（包括大腸桿菌和農(nóng)桿菌）中表達(dá)出致死蛋白殺死宿主，只有在特殊菌株才能正常存活，所以不能將它導(dǎo)入農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化植物，而是必須去掉ccdB基因之后才可以作為空載體質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶Bsp1407I（FastDigest?，F(xiàn)ermentas）酶切pB7FWG2載體，回收大片段，用T4DNA連接酶連接，得到空載體質(zhì)粒。四、轉(zhuǎn)空載體植物的獲得：用空載體質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒pB7FWG2-GmSN1，其它同步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體植株。五、轉(zhuǎn)基因植物的抗花葉病毒病鑒定：分別將兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（B6F7015和B6F7016）的T1代植株和T2代植株，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的T1代植株和T2代植株，及大豆栽培品種P03-8-23，進(jìn)行大豆花葉病毒抗性鑒定，每個(gè)株系對(duì)20株T1代植株進(jìn)行鑒定，每個(gè)株系對(duì)60株T2代植株進(jìn)行鑒定，方法如下：在大豆苗期（第一片復(fù)葉展開），采用汁液摩擦接種法接種大豆花葉病毒強(qiáng)毒3號(hào)株系（SMVSC-3），于開花前后進(jìn)行抗性調(diào)查，大豆抗花葉病毒病鑒定植株病情級(jí)別劃分標(biāo)準(zhǔn)見表3，大豆抗花葉病毒病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表4，抗性調(diào)查的結(jié)果見表5。T1代和T2代B6F7015、B6F7016和轉(zhuǎn)化受體品種P03-8-23接種大豆花葉病毒強(qiáng)毒3號(hào)株系后的照片分別見圖4及圖5。表3大豆抗花葉病毒病鑒定植株病情級(jí)別劃分病情級(jí)別癥狀描述0無癥狀反應(yīng)。1輕花葉型，植株生長(zhǎng)正常，葉片平展不皺，有黃綠與暗綠相間的輕花葉。3重花葉型，植株生長(zhǎng)基本正常，葉片明脈微皺，有明顯黃綠相間的斑駁。5皺花葉型，植株生長(zhǎng)接近正常，不矮化，葉片有波狀斑或沿葉緣曲葉或泡狀突起，黃化型葉片有黃斑。7皺縮型，植株生長(zhǎng)不正常，略矮化及黃化，葉片明顯皺縮，呈泡狀畸形卷曲。9矮化型：植株極端矮化，葉片僵化狹窄、畸形卷曲，嚴(yán)重的出現(xiàn)頂端壞死，芽枯或黃萎。病情指數(shù)（DI）=∑(發(fā)病級(jí)別代表值×該級(jí)別病株數(shù))/（調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級(jí)別代表值）×100表4大豆抗花葉病毒病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)病情指數(shù)抗性評(píng)價(jià)0免疫（IM）0.1～20.0高抗（HR）20.1～35.0中抗（MR）35.1～50.0中感（MS）50.1～70.0感（S）70.1～100.0高感（HS）表5抗性調(diào)查的結(jié)果株系T1世代病情指數(shù)T2世代病情指數(shù)抗性評(píng)價(jià)B6F70154.99±0.780.79±0.12HR/HRB6F70165.56±0.00.41±0.71HR/HR轉(zhuǎn)空載體植株20.99±6.988.81±5.26R/HR大豆栽培品種P03-8-2324.14±3.516.19±2.16R/HR連續(xù)2代接種鑒定結(jié)果表明：在鑒定的2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，轉(zhuǎn)基因大豆株系B6F7015病情指數(shù)為0.79-4.99%，B6F7016病情指數(shù)為0.41-5.56%。盡管不同年份間鑒定結(jié)果存在顯著性差異，但在同一年份中，其病情指數(shù)均極顯著低于對(duì)照品種P03-8-23（病情指數(shù)為6.19-24.14），表現(xiàn)為高抗（HR）或接近免疫（IM）。本研究結(jié)果表明，GmSN1在大豆中的過量表達(dá)可以顯著提高其抗病毒水平。圖4.T1代GmSN1轉(zhuǎn)基因植株抗花葉病毒病鑒定圖5.T2代GmSN1轉(zhuǎn)基因植株抗花葉病毒病鑒定——接種大豆花葉病毒15天之后。可見轉(zhuǎn)GmSN1基因的植株沒有出現(xiàn)任何感染大豆花葉病毒的病癥。而受體和空載體轉(zhuǎn)化植株都出現(xiàn)了葉片皺縮的大豆花葉病毒侵染病癥。當(dāng)前第1頁1 2 3