專利名稱：：一種獲得轉基因棉花的方法
技術領域：
：本發明屬于植物轉基因
技術領域：
，涉及一種獲得轉基因棉花的方法，具體涉及一種以棉花莖尖為受體、通過農桿菌介導獲得轉基因棉花植株的新方法。
背景技術：
：棉花是一種重要的經濟作物，在國民經濟中占有重要地位。棉花轉基因技術在遺傳改良方面已取得重大進展，成為生物技術在作物遺傳改良中成功應用的范例。目前，轉基因植物的遺傳轉化方法以農桿菌介導轉化法應用最為廣泛。由農桿菌介導基因轉化技術具有不受季節限制、目的基因多為單拷貝或低拷貝、插入邊界多為T-DNA左右邊界，重排率低、容易排除冗余的質粒DNA序列、容易獲得無選擇標記的轉基因植株等優點而倍受青睞。自從1987年Umbeck等首次報道了通過農桿菌介導法將NPTII基因導入棉花，1994年陳志賢等也利用此法獲得導入2，4-D抗性基因的陸地棉植株，隨之Bt基因、CPTI基因也相繼導入棉花，這種由農桿菌介導基因轉化技術迅速發展起來。根據棉花遺傳轉化受體的類型，棉花以農桿菌介導的細胞核遺傳轉化主要技術體系有以胚性愈傷組織為受體的轉化體系、以下胚軸為受體的轉化體系、以莖尖分生組織為受體的轉化體系。以胚性愈傷組織和下胚軸為受體的兩種轉化體系都必須要經過體細胞胚胎發生和植株再生，由于在誘導愈傷組織過程中要經過分化、再分化過程，能產生很多遺傳變異和體細胞變異，植株再生困難，轉化周期長，目前報道最短的植株再生所用的時間在五個月以上；基因型對棉花體細胞胚胎發生和植株再生具有決定性作用，同一棉屬不同棉種之間、同一棉種不同品種之間體細胞胚胎發生和植株再生的能力不同，只有少數品種離體培養的材料可以誘導出胚性愈傷組織，限制了遺傳轉化的品種范圍。以莖尖分生組織為受體的農桿菌轉化法不經過脫分化、再分化過程，遺傳變異和體細胞變異程度低；受棉花基因型限制的影響較小，許多未能實現體細胞胚胎發生和植株再生的棉花品種也可以成功進行遺傳轉化。自從Renfroe等報道利用棉花莖尖分生組織獲得再生植株以來，國內外很多學者都利用莖尖或莖尖分生組織獲得了轉基因再生植株。但通常轉化率低，且由于不定芽起源于多細胞，嵌合體比較多等因素的限制影響再生苗的獲得。
發明內容本發明的目的是提供一種獲得轉基因棉花的方法。本發明提供的獲得轉基因棉花的方法，包括如下步驟(1)切除棉花子葉苗的子葉、葉柄和部分下胚軸，下胚軸保留0.8-3cm的長度(可為0.8-2cm,如0.8-1.5cm,1.5_2cm)，得到待侵染組織；然后25-30°C(如25-28°C，28-30°C)、相對濕度40%-60%(如40%-50%,50%-60%),暗培養2-3天(如2-2.5天，2.5-3天)；所述子葉苗為子葉半展開、下胚軸伸長至4-6cm(如4-5cm，5-6cm)的無菌苗；(2)將暗培養后的待侵染組織雙面劃傷，劃傷范圍為從莖尖頂部至下胚軸基部，傷4口深0.8-1.2mm(如0.8-lmm,1-1.2mm)；(3)將劃傷的待侵染組織在溶液A中浸染15-45分鐘(如15_30分鐘，30-35分鐘)；所述溶液A中含有攜帶外源基因的重組農桿菌；(4)侵染完成后共培養2-4天(如2-3天，3-4天)，然后進行抗性篩選，得到抗性棉花苗；(5)將抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到轉基因棉花。相對濕度，表示空氣中的絕對濕度與同溫度下的飽和絕對濕度的比值，得數是一個百分比(也就是指在一定時間內，某處空氣中所含水汽量與該氣溫下飽和水汽量的百分比)。步驟(3)中，所述溶液A的pH為5.3-5.8(如5.3-5.6,5.6-5.8)，由溶質和水組成；所述溶液A的溶質及其濃度如下乙酰丁香酮40-120illL—1(如40-80u180-120u1I71)，2-N-嗎啉乙烷磺酸(MES)65-85mM(如65_75mM，75_85mM)、葡萄糖2-3%(w/w,質量百分含量)(如2-2.5%，2.5-3%)、激動素(KT)0.08-0.12mgL—1(如0.08-0.lmglAO.1-0.12mgL—1)、含有外源基因的重組農桿菌OD600=0.6-0.8。步驟(4)中，所述抗性篩選可在篩選培養基上進行。所述篩選培養基具體可由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸、激動素(KT)、卡那霉素(Kan)和頭孢霉素(Cef)組成；篩選培養基中，瓊脂的終濃度為7.5g化―1，甘氨酸的終濃度為2mg化―1，激動素的終濃度為0.lmg卡那霉素的終濃度為50-100mgL-1(如50-75mgL-1，75-100mgL-1)，頭孢霉素的終濃度為250-500mgI71(如250_375mgL-1，375_500mg。步驟(4)中，所述共培養可在共培養基上進行。所述共培養基具體可由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸和激動素組成；共培養基中，瓊脂的終濃度為7.5g^―1，甘氨酸的終濃度為2mgL—1，激動素的終濃度為0.lmgL—1。所述MS基本培養液的溶劑是水、具體溶質可如表1所示。表1MS基本培養液的溶質大量元素培養基中濃度(gL—1)nh4no31.65kno31.9kh2po40.17MgS047H200.37CaCl20.44微量元素培養基中濃度(mgL—1)5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>所述外源基因具體可為抗蟲基因Cry2A\AGP啟動子或GFP基因；所述抗蟲基因Cry2A*的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述AGP啟動子的核苷酸序列如序列表的序列2所示；所述GFP基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述重組農桿菌可為用攜帶所述外源基因的重組質粒轉化農桿菌得到的重組農桿菌。所述重組農桿菌具體可為如下(a)或(b)或(c)(a)用重組質粒pTiB0542轉化農桿菌EHA105得到重組農桿菌；(b)用重組質粒pBIa⑶S轉化農桿菌EHA105得到重組農桿菌；所述重組質粒pBIaGUS是將pBI121的HindHI和XbaI酶切識別位點之間的小片段取代為序列2所示的DNA得到的重組質粒；(c)用重組質粒pBIaGFP轉化農桿菌LBA4404得到重組農桿菌；所述重組質粒pBIaGFP是將pBIa⑶S的XbaI和SacI酶切識別位點之間的小片段取代為序列3所示的DNA得到的重組質粒。所述棉花具體可為棉花品種冀豐197或棉花品種鄂抗棉12。以上任一所述方法在可應用于棉花育種。本發明針對目前棉花遺傳轉化中植株再生困難、遺傳變異率高、基因型限制性強和轉化周期長，提出一種以棉花莖尖為受體通過農桿菌介導棉花遺傳轉化的新方法。該方法通過調整莖尖生長狀態、確定農桿菌轉化的莖尖侵染合適深度、加入乙酰丁香酮并調整適宜的PH值，提高轉化效率。利用本發明的方法可以快速獲得轉基因植株且具有較高的轉基因效率。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。實施例1、應用本發明的方法獲得轉基因棉花一、重組農桿菌的獲得重組質粒pTiB0542中國農業大學保證向公眾提供；參考文獻重組質粒詳細MiifMJALChenH^(2005)ife^"Transgenicindicariceplantsharboringasyntheticcry2A*geneofBacillusthuringiensisexhibitenhancedresistanceagainst1印idopteranricepests.”中第1131至1132頁；該重組質粒中攜帶序列表的序列1所示的抗蟲基因Cry2A*。農桿菌EHA105中國農業大學保證向公眾提供；參考文獻TorregrosaL.，et.al.InfluenceofAgrobacteriumStrain,CultureMedium,andCultivarontheTransformationEfficiencyofVitisviniferaL.Am.J.Enol.Vitic,53,3:183-190。用重組質粒pTiB0542轉化農桿菌EHA105，得到重組農桿菌。二、轉基因棉花的獲得鄂抗棉12湖北省種子集團公司，是湖北省農作物品種審定委員會審定品種，品種審定編號為鄂審棉2005010。(一)子葉苗的獲得1、棉花種子脫絨50g棉花(鄂抗棉12)種子加15ml左右濃硫酸，快速攪動2-3min，然后石灰水中和，不斷搓洗，流水沖洗10-12min，獲得干凈的脫絨種子。2、將脫絨種子經20%(體積百分含量)雙氧水溶液消毒并在搖床上以130轉/分搖動5小時，然后用滅菌水清洗種子5-6遍，最后加入150ml滅菌水，放在28°C環境下培養24小時，獲得萌發種子。3、將萌發種子在無菌環境下將種殼剝下，將去種殼的棉花種胚種植在發芽培養基上，黑暗培養，溫度28°C；獲得子葉半展開、下胚軸伸長至4cm的子葉苗。(二)轉基因棉花的獲得71、相關溶液和培養基的配方溶液A由溶質和水組成，PH5.3；溶質及其濃度如下乙酰丁香酮40iU/L、2-N-嗎啉乙烷磺酸65mM、葡萄糖2%(w/w，質量百分含量)、激動素0.08mgL—1、步驟一的重組農桿菌0D6(1(1=0.6-0.8。共培養基由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸和激動素組成；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；共培養基中，瓊脂的終濃度為7.5gL—1，甘氨酸的終濃度為2mgL—1，激動素的終濃度為0.lmgL—1。篩選培養基由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸、激動素(KT)、卡那霉素(Kan)和頭孢霉素(Cef)組成；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；篩選培養基中，瓊脂的終濃度為7.5gL—1，甘氨酸的終濃度為2mgL—1，激動素的終濃度為0.lmgL—1，卡那霉素的終濃度為50mgL—1，頭孢霉素的終濃度為250mgL—1。2、轉基因棉花的獲得(1)培養子葉苗，去除子葉、葉柄和部分下胚軸，保留下胚軸0.8cm左右；25°C、相對濕度40%、暗培養2天(莖尖伸長變直)。(2)用尖銳帶1mm彎鉤的解剖針將莖尖雙面劃傷，劃傷范圍從莖尖的頂部到下胚軸基部，劃出深0.8mm左右的傷口，獲得劃傷莖尖。(3)將劃傷的莖尖在溶液A中浸染15分鐘；用滅菌濾紙吸干莖尖表面菌液，再將莖尖放置在共培養基上培養2天，獲得共培養的侵染莖尖。(4)將侵染莖尖轉移到篩選培養基上，篩選3次，每約四周更換一次新鮮的篩選培養基，獲得抗性棉花幼苗。(5)將抗性幼苗嫁接在棉花砧木上，獲得再生植株(數目為N)。(三)計算轉化效率整個步驟二約3個月時間，將步驟2的(5)得到的再生植株(數目為N)進行PCR驗證，獲得轉基因植株(數目為n)。轉化效率=n/NX100%。PCR驗證所用的引物如下5'-CTCGCTCGTGTCAATGCT-3‘；5'-CTCTGGGTTTGCTGTGGG-3‘。轉化效率達到6.2%。實施例2、應用本發明的方法獲得轉基因棉花一、重組農桿菌的獲得1、合成序列表的序列2所示的種子特異表達啟動子AGP。2、重組質粒(pBIa⑶S)的獲得①用限制性內切酶Hindlll和XbaI雙酶切pBI121(北京拜爾迪生物技術有限公司，產品貨號MP-091)，回收大片段；②用限制性內切酶Hindlll和XbaI雙酶切步驟1的種子特異表達啟動子AGP，回收酶切產物；③將步驟①回收的大片段和步驟②回收的酶切產物連接，得到重組質粒pBIa⑶S(用序列2所示的種子特異表達啟動子AGP取代了pBI121中的組成型表達啟動子CaMV35S)。重組質粒pBIa⑶S中，⑶S基因為種子特異表達。3、重組農桿菌的獲得用重組質粒pBIa⑶S轉化農桿菌EHA105，得到重組農桿菌。二、轉基因棉花的獲得冀豐197購自河北冀豐種業有限公司，為河北省農作物品種審定委員會審定品種，品種審定編號為冀審棉2004007號。(一)子葉苗的獲得1、棉花種子脫絨50g棉花(冀豐197)種子加15ml左右濃硫酸，快速攪動2-3min，然后石灰水中和，不斷搓洗，流水沖洗10-12min，獲得干凈的脫絨種子。2、將脫絨種子經20%(體積百分含量)雙氧水溶液消毒并在搖床上以130轉/分搖動5小時，然后用滅菌水清洗種子5-6遍，最后加入150ml滅菌水，放在28°C環境下培養24小時，獲得萌發種子。3、將萌發種子在無菌環境下將種殼剝下，將去種殼的棉花種胚種植在發芽培養基上，黑暗培養，溫度28°C；獲得子葉半展開、下胚軸伸長至5cm的子葉苗。(二)轉基因棉花的獲得1、相關溶液和培養基的配方溶液A由溶質和水組成，PH5.6；溶質及其濃度如下乙酰丁香酮80iUI71、2-N-嗎啉乙烷磺酸75mM、葡萄糖2.5%(w/w，質量百分含量)、激動素0.lmg化―1、步驟一的重組農桿菌0D6(1(1=0.6-0.8。共培養基由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸和激動素組成；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；共培養基中，瓊脂的終濃度為7.5gL—1，甘氨酸的終濃度為2mgL—1，激動素的終濃度為0.lmgL—1。篩選培養基由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸、激動素、卡那霉素和頭孢霉素組成；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；篩選培養基中，瓊脂的終濃度為7.5gL—1，甘氨酸的終濃度為2mgL—1，激動素的終濃度為0.lmgL—1，卡那霉素的終濃度為75mg頭孢霉素的終濃度為375mgL—1。2、轉基因棉花的獲得(1)培養子葉苗，去除子葉、葉柄和部分下胚軸，保留下胚軸1.5cm左右；28°C、相對濕度50%、暗培養2.5天(莖尖伸長變直)。(2)用尖銳帶1mm彎鉤的解剖針將莖尖雙面劃傷，劃傷范圍從莖尖的頂部到下胚軸基部，劃出深1mm左右的傷口，獲得劃傷莖尖。(3)將劃傷的莖尖在溶液A中浸染30分鐘；用滅菌濾紙吸干莖尖表面菌液，再將莖尖放置在共培養基上培養3天，獲得共培養的侵染莖尖。(4)將侵染莖尖轉移到篩選培養基上，篩選3次，每約四周更換一次新鮮的篩選培養基，獲得抗性棉花幼苗。(5)將抗性幼苗嫁接在棉花砧木上，獲得再生植株(數目為N)。(三)計算轉化效率整個步驟二約3個月時間，將步驟2的(5)得到的再生植株進行PCR驗證，獲得轉基因植株(數目為n)。轉化效率=n/NX100%。PCR驗證所用的引物如下5'-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3‘；5'-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3‘。9將轉基因植株進行⑶S染色，均顯示陽性。轉化效率達到5.9%。實施例3、應用本發明的方法獲得轉基因棉花一、重組農桿菌的獲得1、合成序列3所示的GFP基因。2、重組質粒(pBIaGFP)的獲得①用限制性內切酶XbaI和SacI雙酶切實施例2的步驟二的2得到的ρΒΙα⑶S，回收大片段；②用限制性內切酶XbaI和SacI雙酶切步驟1的GFP基因，回收酶切產物；③將步驟①回收的大片段和步驟②回收的酶切產物連接，得到重組質粒pBIaGFP(用序列3所示的GFP基因取代了ρΒΙα⑶S中的⑶S基因)。3、重組農桿菌的獲得農桿菌LBA4404中國農業大學保證向公眾提供；參考文獻TorregrosaL.，et.al.InfluenceofAgrobacteriumStrain,CultureMedium,andCultivarontheTransformationEfTiciencyofVitisviniferaL.Am.J.Enol.Vitic,53,3:183-190。用重組質粒pBIαGFP轉化農桿菌LBA4404，得到重組農桿菌。二、轉基因棉花的獲得冀豐197購自河北冀豐種業有限公司，為河北省農作物品種審定委員會審定品種，品種審定編號為冀審棉2004007號。(一)子葉苗的獲得1、棉花種子脫絨50g棉花(冀豐197)種子加15ml左右濃硫酸，快速攪動2-3min，然后石灰水中和，不斷搓洗，流水沖洗10-12min，獲得干凈的脫絨種子。2、將脫絨種子經20%(體積百分含量)雙氧水溶液消毒并在搖床上以130轉/分搖動5小時，然后用滅菌水清洗種子5-6遍，最后加入150ml滅菌水，放在28°C環境下培養24小時，獲得萌發種子。3、將萌發種子在無菌環境下將種殼剝下，將去種殼的棉花種胚種植在發芽培養基上，黑暗培養，溫度28°C；獲得子葉半展開、下胚軸伸長至6cm的子葉苗。(二)轉基因棉花的獲得溶液A由溶質和水組成，pH5.8；溶質及其濃度如下乙酰丁香酮120μ1/L、2-Ν-嗎啉乙烷磺酸85mM、葡萄糖3%(w/w，質量百分含量)、激動素0.12mg·L—1、步驟一的重組農桿菌OD6tltl=0.6-0.8。共培養基由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸和激動素組成；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；共培養基中，瓊脂的終濃度為7.5g·L—1，甘氨酸的終濃度為2mg·L—1，激動素的終濃度為0.Img·L—1。篩選培養基由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸、激動素、卡那霉素和頭孢霉素組成；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；篩選培養基中，瓊脂的終濃度為7.5g·L—1，甘氨酸的終濃度為2mg·L—1，激動素的終濃度為0.Img·L—1，卡那霉素的終濃度為IOOmg·L—1，頭孢霉素的終濃度為500mg·IA(1)培養子葉苗，去除子葉、葉柄和部分下胚軸，保留下胚軸2cm左右；30°C、相對濕度60%、暗培養3天(莖尖伸長變直)。(2)用尖銳帶Imm彎鉤的解剖針將莖尖雙面劃傷，劃傷范圍從莖尖的頂部到下胚軸基部，劃出深1.2mm左右的傷口，獲得劃傷莖尖。(3)將劃傷的莖尖在溶液A中浸染45分鐘；用滅菌濾紙吸干莖尖表面菌液，再將莖尖放置在共培養基上培養4天，獲得共培養的侵染莖尖。(4)將侵染莖尖轉移到篩選培養基上，篩選3次，每約四周更換一次新鮮的篩選培養基，獲得抗性棉花幼苗。(5)將抗性幼苗嫁接在棉花砧木上，獲得再生植株(數目為N)。(三)計算轉化效率整個步驟二約3個月時間，將步驟2的(5)得到的再生植株進行PCR驗證，獲得轉基因植株(數目為η)。轉化效率=n/NX100%。PCR驗證所用的引物如下5'-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3‘；5'-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3‘。將轉基因植株進行GFP熒光檢測，均顯示陽性。轉化效率達到5.3%。權利要求一種獲得轉基因棉花的方法，包括如下步驟(1)切除棉花子葉苗的子葉、葉柄和部分下胚軸，下胚軸保留0.8-3cm的長度，得到待侵染組織；然后25-30℃、相對濕度40％-60％、暗培養2-3天；所述子葉苗為子葉半展開、下胚軸伸長至4-6cm的無菌苗；(2)將暗培養后的待侵染組織雙面劃傷，劃傷范圍為從莖尖頂部至下胚軸基部，傷口深0.8-1.2mm；(3)將劃傷的待侵染組織在溶液A中浸染15-45分鐘；所述溶液A中含有攜帶外源基因的重組農桿菌；(4)侵染完成后共培養2-4天，然后進行抗性篩選，得到抗性棉花苗；(5)將抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到轉基因棉花。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述溶液A的pH為5.3-5.8，由溶質和水組成；所述溶液A的溶質及其濃度如下乙酰丁香酮40-120u1廠1，2-N-嗎啉乙烷磺酸65-85mM、葡萄糖2_3%(質量百分含量)、激動素0.08-0.12mgL_\含有外源基因的重組農桿菌0D6(1c1=0.6-0.8。3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述抗性篩選在篩選培養基上進行；所述篩選培養基由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸、激動素、卡那霉素和頭孢霉素組成；篩選培養基中，瓊脂的終濃度為7.5g化―1，甘氨酸的終濃度為2mg化―1，激動素的終濃度為0.lmg.L—1，卡那霉素的終濃度為50-100mg.L—1，頭孢霉素的終濃度為250_500mg.L—1。4.如權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述共培養在共培養基上進行；所述共培養基由MS基本培養液、瓊脂、甘氨酸和激動素組成；共培養基中，瓊脂的終濃度為7.5gL—1，甘氨酸的終濃度為2mgL—1，激動素的終濃度為0.lmgL—1。5.如權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。6.如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述外源基因為抗蟲基因Cry2A*、AGP啟動子或GFP基因；所述抗蟲基因Cry2A*的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述AGP啟動子的核苷酸序列如序列表的序列2所示；所述GFP基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述重組農桿菌為用攜帶所述外源基因的重組質粒轉化農桿菌得到的重組農桿菌。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述重組農桿菌為如下(a)或(b)或(c)(a)用重組質粒pTiB0542轉化農桿菌EHA105得到重組農桿菌；(b)用重組質粒pBIa⑶S轉化農桿菌EHA105得到重組農桿菌；所述重組質粒pBIaGUS是將pBI121的HindHI和XbaI酶切識別位點之間的小片段取代為序列2所示的DNA得到的重組質粒；(c)用重組質粒pBIaGFP轉化農桿菌LBA4404得到重組農桿菌；所述重組質粒pBIaGFP是將pBIa⑶S的XbaI和SacI酶切識別位點之間的小片段取代為序列3所示的DNA得到的重組質粒。9.如權利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述棉花為棉花品種冀豐197或棉花品種鄂抗棉12。10.權利要求1至9中任一所述方法在棉花育種中的應用。全文摘要本發明公開了一種獲得轉基因棉花的方法。本發明的方法包括如下步驟(1)切除棉花子葉苗的子葉、葉柄和部分下胚軸，下胚軸保留1-3cm，得到待侵染組織；25-30℃、相對濕度40％-60％、暗培養2-3天；(2)從莖尖頂部至下胚軸基部雙面劃傷，傷口深0.8-1.2mm；(3)在溶液A中浸染15-45分鐘；溶液A中含攜帶外源基因的重組農桿菌；(4)共培養2-4天，然后進行抗性篩選，得到抗性棉花苗；(5)將抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到轉基因棉花。本發明通過調整莖尖生長狀態、確定農桿菌轉化的莖尖侵染合適深度、加入乙酰丁香酮并調整適宜的pH值，提高轉化效率。利用本發明的方法可以快速獲得轉基因植株且具有較高的轉基因效率。文檔編號A01H5/00GK101831459SQ20101016855公開日2010年9月15日申請日期2010年5月4日優先權日2010年5月4日發明者劉正杰,華金平,熊敏,王彥霞,王玉美申請人:中國農業大學