專利名稱：生殖器皰疹重組腺病毒載體二價活疫苗的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種抗2型單純皰疹病毒感染所致生殖 器皰疹的新型重組腺病毒載體二價活疫苗。
背景技術：
生殖器皰疹是僅次于艾滋病的病毒性性傳播疾病，其病原體主要是2型單純皰疹 病毒，占原發感染的90%以上。II單純皰疹病毒人類后主要引起生殖系統原發性和復發性 皰疹，可以終生潛伏在神經節內，在機體感染免疫力降低時復發。孕婦感染HSV-II型病毒 后易發生流產，也可致胎兒先天畸形或智力低下。新生兒在分娩時感染可導致高熱、呼吸困 難或中樞神經系統病變，其中60% -70%的新生兒可能死亡。此外，有研究表明，生殖器皰 疹可將艾滋病感染風險增加2-3倍，并促進艾滋病病毒的傳播。目前并無生殖器皰疹，尤其 是復發性生殖器皰疹特效治療方法，也有研究表明，安全套不能有效預防皰疹病毒感染，所 以，世界范圍內生殖器皰疹發病率逐年上升，美國最新統計數據顯示，美國成人生殖器皰疹 患病率已經上升到了 25%，可以說每四個成人中就有一人罹患生殖器皰疹，因此迫切需要 開發能有效防治生殖器皰疹的疫苗。過去幾十年來世界各國HSV疫苗的研究結果表明，傳統的滅活疫苗和亞單位疫苗 免疫原性弱，僅能誘導體液免疫應答，細胞免疫誘導效果較差；減毒活疫苗存在安全隱患， 具有致癌風險；新型DNA疫苗雖能同時誘導體液和細胞免疫，但是其轉染效率較低，經粘 膜免疫誘導有效的粘膜免疫應答能力更低。而在單純皰疹病毒的免疫應答過程中，細胞免 疫和粘膜免疫發揮著更大的作用，但上述幾類疫苗均不能有效誘導細胞免疫和粘膜免疫應 答，因此，到目前為止，尚無可以在臨床上應用的疫苗上市。近年來，病毒載體活疫苗逐漸引起了疫苗研究者的重視，其中的腺病毒載體更是 以其獨特的優勢博得了研究者的青睞。首先，腺病毒載體的安全性已經在臨床上得到了實 踐的檢驗，世界上有關腺病毒載體的臨床實驗達數百項，而中國已經有兩種腺病毒載體抗 腫瘤藥物上市。其次，國內外諸多研究證明，腺病毒載體疫苗可以經粘膜途徑免疫，可以模 擬野生型病毒的感染過程，有效地誘導粘膜免疫和細胞免疫應答，是新型疫苗的優良載體。 此外，腺病毒載體構建和生產工藝已經成熟，工業化生產不存在任何問題。近年來的研究發現，HSV膜表面的糖蛋白B和糖蛋白D是其感染必需糖蛋白，在 HSV的感染過程中發揮著根本性的作用，缺一不可，同時二者也是誘發免疫應答最強的兩種 糖蛋白，目前大多數皰疹亞單位糖蛋白疫苗都是選擇這兩種糖蛋白作為研究對象。目前一 些DNA疫苗的研究發現細胞因子如白介素-2 (IL-2)、白介素-12 (IL-12)、粒細胞-巨噬細 胞集落刺激因子(GM-CSF)等等可以起到免疫佐劑的作用，被稱為是分子佐劑，可顯著地增 強疫苗的免疫效果。本發明利用現代分子生物學技術，首次制備了攜帶HSV-II型保護性抗 原-糖蛋白D和糖蛋白B，同時能夠表達分子佐劑IL-2的二價重組腺病毒載體活疫苗。

發明內容
本發明的目的是提供一種可防治HSV-2感染所致生殖器皰疹的重組腺病毒載體 二價活疫苗的制備及應用方法。本發明涉及一種重組腺病毒載體二價活疫苗，由攜帶HSV-2糖蛋白B和糖蛋白D 基因的全長序列的表達盒和攜帶細胞因子白介素2表達盒的重組腺病毒載體構成。具體來 說就是通過同源重組將IL-2表達盒插入腺病毒載體質粒pAdeasy-Ι中，構建表達IL-2的 腺病毒載體，再從野生型2型單純皰疹病毒中用PCR技術將其糖蛋白B和糖蛋白D的全長 序列擴增出來，再通過同源重組插入到表達IL-2的腺病毒載體中，疫苗質粒即構建成功， 將疫苗質粒用I^acI酶切后轉化到293細胞中，待293細胞出現細胞病變效應時收獲病毒即 成功制備可防治生殖器皰疹的重組腺病毒載體二價活疫苗JSA01BD。本發明用以構建重組腺病毒所需的質粒購自Stragene公司，序列和物理圖譜見 該公司的產品目錄。插入的糖蛋白B基因來源于野生型2型單純皰疹病毒基因組的UL27基因的全部 編碼序列。插入的糖蛋白D基因來源于野生型2型單純皰疹病毒基因組的US6基因的全部編 碼序列。本發明中的IL-2是以genebank中的人類白介素2的參考序列為依據，經密碼子 優化后合成而得到的，由SV40啟動子和PolyA共同構成IL-2表達盒。本發明的有益效果相比傳統疫苗而言，1、本疫苗是復制缺陷型腺病毒載體活疫 苗，進入人體后僅能表達保護性抗原而無致病作用，安全性高。2、本疫苗屬于活疫苗，可以 模擬野生型皰疹病毒感染特性，具有較高的感染能力和較高的免疫原性。3、能有效地誘導 的機體粘膜和體液免疫應答，構建機體抵抗皰疹感染的第一道防線，降低人群發病率。4、可 以有效地激發細胞免疫應答，構建機體的第二道防線，并有可能清除已感染病毒，控制皰疹 的復發和傳播。


圖1重組腺病毒載體JSAOIBD酶切鑒定圖譜圖2重組腺病毒載體JSAOIBD結構圖
具體實施例方式實施例1重組腺病毒載體二價活疫苗JSA01BD的制備1.分離野生型HSV-2(1).取臨床HSV感染的病人皰疹液和分泌物，加入ImlPBS緩沖液后用0. 45微米
濾器過濾ο(2).取一六孔板，每孔傳2 X IO5個Vero細胞，在5個孔內每孔加入200微升病毒 過濾液，一孔留作對照。(3).放入37°C二氧化碳培養箱中培72小時后觀察發現孔內出現細胞病變(CPE)。(4).待六孔板孔內細胞出現完全CPE后將培養基和細胞一起收入離心管中。(5).將離心管在37°C -負80°C下凍融3次，5000轉離心10分鐘后將上清轉入 2ml EP管中，放入負80°C冰箱中備用。
(6).自EP管中取200微升病毒液，利用HSV分型鑒定引物分型，分離得一株 HSV-2.2.提取HSV-2基因組(1)感染前一天，胰酶消化并計數vero細胞，每個IOcm平皿接種3 X 106細胞，補 足IOmL含血清正常細胞生長培養液。(2)感染當天，確認細胞達到80-90%融合。加原始HSV-2病毒粗體液100微升 (如果已知滴度則按MOI 10)到細胞中，蝸旋平皿輕輕混勻。(3)在37°C C02培養箱培養，允許感染繼續至細胞80-90%圓縮漂期(一般感染后 2-3 天)。(4)收獲細胞于無菌的帶蓋子15mL離心管中(可選擇小心棄去原培養基，僅 收取細胞，可以起到濃縮病毒的效果，但會丟失單上清液中許多病毒顆粒)，置離心管 于-80°C 30分鐘，然后在37°C水浴15分鐘解凍。重復此步驟三次，3000轉離心15min。(5)收集上清-80°C保存。(7)0. 45微米過濾后加保護劑保存于_80°C。若需要長期保存，則加入10%甘油， 置于-80°C。HSV-2在4°C保存時滴度下降比較快，所以HSV-2應該分裝保存在一 80°C，每 次使用時取出實驗所需量，一次用完，無需反復凍溶，既能保證每次使用的滴度，又能大大 降低HSV-2被污染的機率。(8)取300微升病毒液加入700微升高純水，加入10微升蛋白酶K、10%的SDS50微 升(使終濃度分別稀釋為蛋白酶K的100倍稀釋、SDS的50倍稀釋)混勻。37°C水浴過夜。(9)加入同體積的酚12000rpm離心5min。收集上層液體。一般情況下抽提2_3
次，至無蛋白析出。(10)加入同體積的酚氯仿異戊醇(即500微升氯仿異戊醇、500微升酚)12000rpm 離心5min抽提2-3次，收集上層液體。(11)加入4°C預冷的十分之一體積的乙酸鈉、2. 5倍體積的_20°C預冷的無水乙 醇，-20°C沉淀30min或過夜。(12) 12000rpm4°C離心 15min。棄上清。(13) lml70% 4°C預冷的乙醇洗 1-2 遍，12000rpm4°C離心 5min。(14)棄上清，自然干燥或37°C干燥。3.擴增HSV-2糖蛋白B和糖蛋白D基因(1).糖蛋白B cDNA的克隆(1. 1)以NCBI上登錄的HSVII基因組序列，分上下兩段設計gBcDNA的擴增引物。(1.2)gB上段的克隆(1.2. l)gB上段引物設計上游加EcoRI和KpnI位點，下游包含sphl位點，擴增1797bp片段。擴增條件為 950C 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 2min ；72°C 7min ；30Cycles。gB 上段上游 tttttGAATTCGGTACC5，ATGCGCGGGGGGGGCTTGATTTG 3，gB 上段下游(1)5，ACCAGGGGGCGGCTGTAGCACGTCC 3，(1.2.2)gB上段的克隆DEcoRI 和 sphl 酶切，能切下 120bp。
2)Pmd-ggl 載體用 EcoRI 和 sphl 酶切，切下 450bp 片段。3)連接載體pMD和片段，構建成pMD-gB上質粒。4)鑒定用EcoRI和MluI雙切，能切下約1. 8k片段。(1.3)gB下段的克隆(1.3. l)gB下段引物設計包含sphl位點，下游加HindIII位點，下段擴增1093bp。擴增條件同上。gB 下段上游 5，GCTCAACCCCAACGCCATCGCCT 3，(綠色突出顯示)gB 下段下游 tttttAAGCTT5，TTAGAGCTCGTCTTCGTCTCCGGCC 3，(綠色突出顯示)(1.3.2)gB下段的克隆1) sphl和HindIII酶切后切下約60bp片段。2)T-27II載體也用sphl和HindIII酶切，反接無切出條帶。3)連接，構建成T-gB下質粒。4)鑒定用SphI和MluI雙切，能切下約1. 6k和270bp片段。(1. 4) pshuttle-CMV-gB 載體構建1) pMD-gB 上用 KpnI 和 SphI 酶切(1. 8k)。2)T-gB 下用 SphI 和 HindIII 酶切(IK)。3)pshuttle-CMV(7. 5k)載體用KpnI和HindIII酶切后與1)，2)中的片段進行連 接，構建成 pshuttle-CMV-gB。4)用NdeI和MluI酶切鑒定，能切出1. 8k，500bp和4. 3k和3. 5k片段。(載體上 571 和 4552NdeI, gB 上 1457 和 1949MluI)。5)用設計的gB鑒定引物，進行PCR鑒定，能擴增約430bp片段。(2).糖蛋白D cDNA的克隆(2. 1)提取 HSVII 基因組(2. 2)設計引物擴增gD基因1) gD上段引物加KpnI位點上游5，ttttt ggtacc ATGGGGCGTTTGACCTCCGGCGT 3，下游5，TTTTCGGGGATAAAGCGGGGTAGCA 3，2) gD下段加XhoI位點上游5，GTGAAGATAAACGACTGGACGGAGA 3，下游5，aaaaa ctcgagCTAGTAAAACAATGGCTGGTGCGAG 3，GTCGAC為序列本身的SalI位點(3) PCR擴增gD cDNA上段及下段序列擴增條件:95V5min，94°C 30S，62°C 30S，72°C lmin，72°C 3min，30 個循環。上段 擴增755bp，下段擴增606bp(1.3)gD上段的克隆1) gD上段PCR產物用KpnI和Ml I切，PMD-截短ggl也用相同的酶切后連接構 建成pMD-gD上。2)pMD-gD上用Bgl2與Mil雙切鑒定，出現700多的條帶。(1.4)gD下段的克隆
1) gD下PCR產物用M11和Bio I切，pGEx-gg2也用相同的酶切后連接，構建成 pGEx-gD 下。2)pGEx-gD下用AatII酶切鑒定，能切下500bp左右的片段。(1. 5)pshuttle-CMV_gD 的構建Dpshuttle-CMV 用 SalI 切回收，用 KpnI 切。2)PmD-gD上用用Mil切回收，用KpnI切，回收片段。3)連接 1. 2 得 pshuttle-CMV-gD 上。4)pGEX-gD下用BioI酶切，補平，回收再用Mil切，回收片段，約460bp.5)pshuttle-CMV-gD上先用XhoI酶切，補平，回收再用Mil切。6)連接 4. 5 得 pshuttle-CMV-gD。7) BamHI單切鑒定，能切下4K片段。(1. 6)構建表達IL-2的腺病毒載體pAd-IL-21)自Genebank中獲取人類IL_2cDNA序列，利用Jcat將其序列進行密碼子優化后
人工合成。2)自pIRES質粒上擴增獲得SV40啟動子，構建SV40_IL_2表達盒3)將SV40-IL-2表達盒克隆到含有腺病毒E3區兩側同源臂的pE3載體上，將之 和padeasy-Ι共轉化大腸桿菌BJ5183，利用recA重組系統將之重組到腺病毒的E3區，得 pAd-IL-2。(1. 7)構建同時表達GB和⑶的腺病毒載體JSA01BD。DPIRES 用 BglII 和 NotI 切，回收約 1. 8K 片段。2)Pshuttle-CMV用BglII和NotI切，回收載體。用SnaBI酶切后，回收載體，自連。3)將步驟1. 2中載體和片段連接，構建成PShuttle-IRES0用bglll和XhoI酶 切鑒定，切下lkb, 1. 8kb和2. 5kb片段。PShuttle-IRES用SnaBI切，回收載體進行自連。 Pshuttle-IRES平用NdeI鑒定能切下4. 8kb和3. 5kb兩條帶。4)PShuttle-IRES用Mil切開補平，去磷酸化。5) Pshuttle-CMV-gD用BglII和EcoRV切，回收片段，補平。鑒定正反接。 PShuttle-IRES-gD 用 BamHI 切，能切下 5. 6kb，3. 4kb 和 950bp 片段。用 XhoI 切下 2kb 條
市ο6)Paiuttle-IRES_gD 用 MluII 切，補平后去磷酸化。7)Pshuttle-CMV-gB 用 BglII 和 EcoRV 切，回收片段，補平，與 PShuttle-IRES-gD 連接，構建成 PShuttle-IRES-B-D0 用 XhoI 酶切鑒定切下 8. 5kb，2. 6kb，1. 8kb 片段。NheI 和 XbaI 切下 2. 7kb, 700bp 片段。8) PShuttle-IRES-B-D載體，pmel酶切后用CIAP處理和，轉化到含pAd-IL-2質粒 的BJ5183感受態細胞。9)挑取單克隆分別用XhoI酶切鑒定(圖1)。10)挑出酶切鑒定正確的克隆，擴增后提取質粒。11)用I^acI酶切Ad-b-d后用PCR清潔試劑盒回收JSA01BD，JSAOIBD由GB和⑶ 表達盒與IL-2表達盒構成(圖2)。
12)利用脂質體2000，按照其說明書將JSA01BD轉染293細胞。13)轉染8天后可見細胞病變出現見圖M，完全CPE后收獲病毒，凍融三次后作為 原始種了保存。14)擴增JSA01BD并測定其滴度。14. 1)利用IOcm培養皿生產擴增腺病毒，收獲JSAOIBD病毒10ml，分裝至10個EP 管內，-80度冰箱保存。14. 2)利用TCID50法測定滴度實驗操作14. 2. 1)收集一瓶四3八細胞，計數。14. 2. 2)用 DMEM 2%準備 20ml 105/ml 細胞。14. 2. 3)用12道排槍在2塊96孔板中每孔加入IOOul細胞懸液。14. 2. 4)稀釋病毒液，在第1管中加入0. 9ml DMEM 2%，其余加入1. 8ml。14. 2. 5)在第1管中再加入0. Iml病毒保存液。14. 2. 6)換用新槍頭，上下吸打5次混勻。14. 2. 7)從第1管中吸取0. 2ml加入第2管中。14.2.8)反復稀釋至最高稀釋度。14. 2. 9)用同一管病毒保存液進行第2輪稀釋。14.2. 10)最后8個稀釋液加入96孔板，每孔0. 1ml，每個稀釋度10孔，2孔為陰性 對照。陰性對照孔中加入0. Iml DMEM 2%監測細胞存活情況。加樣時從最高稀釋度開始。14. 2. 11)37°C培養 10 天。14. 2. 12) 10天后倒置顯微鏡下觀察，計算每一排中出現CPE的孔數。只要有一小 點或是一些細胞出現CPE即為陽性，如果無法確定，可與陰性對照比較。14. 2. 13)計算每一排中出現陽性的孔數。如果陰性對照中無任何CPE且細胞生長 良好，最低稀釋度100%陽性而最高稀釋度100%陰性，則本測試即為有效。按照下述公式 計算滴度τ = 101+d(S-0. 5) IU/ml，其中d = LoglO稀釋倍數，S =從第一次稀釋起的陽性 比率之和，2次平行實驗得到的滴度值應相差彡10°_7。測得JSA01BD滴度是IX 109IU/ml。實施例2活疫苗JSA01BD對豚鼠生殖器皰疹的免疫保護實驗1.實驗材料野生型單純皰疹病毒II型用Vero細胞擴增HSV-2后測定滴 度，滴度約為1 X 107IU/ml ；重組腺病毒padred和JSAOIBD,滴度分別是2X109IU/ml和 IX 109IU/ml ；普通級別實驗豚鼠，30只，雌性，體重275士25g，每一只都在其身體的不同部 位做好標記，在將相應標記轉化為1-30共10個阿拉伯數字，按隨機化原則分為10只/組， 分為空白對照組、陰性對照組和陽性組共三組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量108TCID50重組腺病毒；途徑鼻腔滴注，在0周實施初次免疫，2周 (dl4)以后進行加強免疫一次，再過兩周以后，即第4周(d28)用野生型HSV-2進行攻擊試 驗，計算豚鼠外陰皮損累計積分，確定保護效果。3.操作步驟(1).第0周，初次免疫豚鼠隨機分組后陰性對照組經鼻腔滴注途徑給于50微升 重組腺病毒padred ；陽性組同樣方法給于50微升重組腺病毒JSA01BD，空白組給予50微升生理鹽水，觀察豚鼠情況。O).第2周，加強免疫陰性對照組經鼻腔滴注途徑給于100微升重組腺病毒 padred ；陽性組同樣方法給于100微升重組腺病毒JSA01BD，空白組給予50微升生理鹽水， 觀察豚鼠情況。(3).第4周，攻毒實驗；1).用棉簽蘸生理鹽水擦洗豚鼠外陰。2).用ImL注射器配上灌胃針頭吸取0. 2mlHSV-2病毒(含IO6IU)。3).將針頭伸入陰道內陰道穹隆后將病毒液注入，緩慢退出。4).用明膠海棉塞住陰道維持病毒液體Mh。豚鼠出現癥狀紅腫、起皰、潰瘍、結痂。評分標準0無癥狀0.5，僅輕微紅腫；1.0，紅腫明顯，無水皰；1. 5，單個小水皰((2mm)；2. 0，單個大水皰(> 2mm)；2. 5，多個小水皰和/或陰道潰瘍(出血)；3.0，多個大水皰；3. 5，嚴重外陰腫脹；4.0，多個小/大疤融合；4. 5，后肢癱瘓；5.0，外陰潰瘍，后肢癱瘓(4).實驗結果:攻毒后陰性對照組發病情況攻毒后3d全部出現初發感染癥狀，大約6-7d，豚鼠 皮損程度最嚴重，逐漸減輕，第10天后基本消失。中間偶有豚鼠病重死亡。初次發病后13d 后出現復發感染情況，21天累計評分為80. 5 ；攻毒后空白對照組發病情況攻毒后3d全部 出現初發感染癥狀，大約6-7d，豚鼠皮損程度最嚴重，逐漸減輕，第10天后基本消失。中間 偶有豚鼠病重死亡。初次發病后13d后出現復發感染情況，21天累計評分為98 ；而陽性組 僅有一只出現輕微紅腫癥狀，其它的未見明顯癥狀，21天累計評分為5. 5。陽性組和陰性組 和空白組差別顯著，疫苗可預防生殖器皰疹。實施例3活疫苗JSA01BD對小鼠的免疫保護實驗1.實驗材料野生型單純皰疹病毒II型用Vero細胞擴增HSV-2后測定滴 度，滴度約為1 X 107IU/ml ；重組腺病毒padred和JSAOIBD,滴度分別是2X109IU/ml和 IX 109IU/ml ；普通級別實驗小白鼠，30只，雌性，體重20士2g，每一只都在其身體的不同部 位做好標記，在將相應標記轉化為1-30共10個阿拉伯數字，按隨機化原則分為10只/組， 分為空白對照組、陰性對照組和陽性組共三組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量108TCID50重組腺病毒；途徑鼻腔滴注，在0周實施初次免疫，2周 (dl4)以后進行加強免疫一次，再過兩周以后，即第4周(d28)用野生型HSV-2進行攻擊試驗，計算小鼠死亡率，確定保護效果。3.操作步驟(1).第0周，初次免疫小鼠隨機分組后陰性對照組經鼻腔滴注途徑給于50微升 重組腺病毒padred ；陽性組同樣方法給于50微升重組腺病毒JSA01BD，空白組給予50微升 生理鹽水，觀察小鼠情況。O).第2周，加強免疫陰性對照組經鼻腔滴注途徑給于100微升重組腺病毒 padred ；陽性組同樣方法給于100微升重組腺病毒JSA01BD，空白組給予50微升生理鹽水， 觀察小鼠情況。(3).第4周，攻毒實驗；1) ·用 ImL 注射器吸取 0. 2ml HSV-2 病毒(含 IO6IU)。2).小鼠腹腔內注射HSV-2 0. 2mL·3).觀察小鼠情況小鼠攻毒后空白對照組死亡情況攻毒后第5d開始出現死亡情況，第13后全部死 亡，死亡率100% ；陰性對照組情況攻毒后5d全部出現初發感染癥狀，至觀察結束后共有 9只小鼠死亡，死亡率90% ；陽性組僅在第8天和第10天各有一只死亡以外其它的全部存 活，死亡率20%。陽性組和陰性組和空白組差別顯著，疫苗可抵抗致死量病毒攻擊。實施例4活疫苗JSA01BD對豚鼠生殖器皰疹的免疫治療實驗實驗材料同實施例2:實驗方法用HSV-2病毒攻擊豚鼠后第5天，將豚鼠隨機分為3組，分別經鼻腔途 徑給予生理鹽水、padred和JSA01BD各50微升；第一次免疫治療后的14d，同途徑和劑量進 行第二次免疫治療。觀察豚鼠發病情況及復發情況。計算皮損指數實驗結果給藥后各組初發感染無明顯差別，中間各組均偶有豚鼠死亡，第15天 后空白對照組全部出現復發感染，累計積分為50. 5 ；陰性對照組復發感染積分為40，陽 性組除了一只豚鼠外陰出現紅腫外，其它各只均未見復發感染癥狀，復發感染累計評分為 10. 5。陽性組和陰性組和空白組差別顯著，本疫苗在豚鼠身上對生殖器皰疹有一定的治療 作用，可以減輕復發癥狀。
權利要求
1.一種單純皰疹病毒II型重組腺病毒載體二價活疫苗，其特征在于重組腺病毒載體 攜帶糖蛋白B基因和糖蛋白D基因表達盒和人白介素2基因表達盒。
2.根據權利要求1所述的單純皰疹病毒II型重組腺病毒載體二價活疫苗，其特征在于 所攜帶糖蛋白B基因和糖蛋白D基因表達盒位于腺病毒載體的El區。
3.根據權利要求1所述的單純皰疹病毒II型重組腺病毒載體二價活疫苗，其特征在于 所攜帶糖蛋白B基因和糖蛋白D基因來源于野生型單純皰疹病毒II型。
4.根據權利要求1所述的單純皰疹病毒II型重組腺病毒載體二價活疫苗，其特征在 于所攜帶糖蛋白B基因和糖蛋白D基因表達盒是糖蛋白B編碼序列和糖蛋白D編碼序列由 IRES連接，由CMV啟動子轉錄。
5.根據權利要求1所述的單純皰疹病毒II型重組腺病毒載體二價活疫苗，其特征在于 所攜帶人白介素2表達盒位于腺病毒載體的E3區。
6.根據權利要求1所述的單純皰疹病毒II型重組腺病毒載體二價活疫苗，其特征在于 所攜帶人白介素2表達盒由SV40啟動子轉錄。
7.根據權利要求1所述的單純皰疹病毒II型重組腺病毒載體二價活疫苗，其特征在于 所攜帶人白介素2表達盒中白介素2編碼序列是經過了密碼子優化后的序列。
8.根據權利要求1所述的單純皰疹病毒II型重組腺病毒載體二價活疫苗，其特征在于 所述的腺病毒載體來源于pAdeasy-Ι質粒。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種抗單純皰疹病毒2型感染所致生殖器皰疹的新型重組腺病毒載體二價活疫苗。本發明利用分子生物學技術將含單純皰疹病毒2型糖蛋白B和糖蛋白D基因的全長序列的表達盒和細胞因子白介素2表達盒克隆至腺病毒載體上構成。該疫苗是復制缺陷型腺病毒載體活疫苗，進入人體后僅能表達保護性抗原而無致病作用，安全性高，可以模擬野生型皰疹病毒感染特性，有效地誘導的機體粘膜和體液免疫應答和細胞免疫應答，降低人群發病率，清除已感染病毒，控制皰疹的復發和傳播。
文檔編號A61P31/22GK102078607SQ20101020121
公開日2011年6月1日 申請日期2010年6月17日 優先權日2010年6月17日
發明者劉景偉, 張利娟, 胡軍 申請人:鄭州金森生物科技工程有限公司