專利名稱：植物雄性不育系及其恢復系的培育方法
技術領域：
本發明涉及植物雄性不育系及其恢復系的培育方法。
背景技術：
從上世紀70年代以來，雜種優勢利用為我國水稻生產做出了重大的貢獻。面臨我 國經濟發展對農業生產所提出“高產、優質、高效、安全、生態”的新的重大需求，能否進一步 發掘雜種優勢的應用潛力以應對，就成為擺在當代科學家面前的一個嚴峻挑戰。雜種優勢的形成基于兩個不同親本的組合。要在現有應用的基礎上進一步發掘其 潛力，除了需要加強雜種優勢形成機制的研究之外，還急需建立有效的方法來創造雄性不 育性狀，以便有效擴大雜交組合的篩選和優秀組合在生產上的應用。目前，在育種工作和生產上廣泛應用的雄性不育性狀多來自于自然突變及其性狀 轉育株系。雄性不育性狀的來源十分有限，是擴大雜交組合篩選特別是應用的嚴重制約因 子。雖然在20世紀90年代初美國科學家就已經證明通過生物技術的方法可以創制人工控 制的雄性不育性狀，但是，按照目前國際通行的規則，所有具有應用潛力的創新都受到知識 產權保護。因此，尋找新的、具有自主知識產權的創制人工控制雄性不育性狀的思路和方 法，已經成為希望把握發掘雜種優勢應用潛力主動權的國家和地區所面臨的無法回避、亟 待解決的關鍵問題之一。長期以來，人們一直利用常規育種的方法選育不育系，或者把不育性從一個品種 轉育到另一個品種中，這些方法周期長、見效慢，不能滿足生產發展的迫切需要。目前，也有 許多控制植物雄性不育性的基因被克隆，但是由于植物的不育性受核基因、線粒體基因、葉 綠體基因和環境因素的影響，作用機理比較復雜，人們對其認識還不足，所以難在短期內獲 得明顯的效果，基因工程雄性不育與用常規方法選育雄性不育相比具有一些特點選育周 期縮短，育性相對穩定，受環境影響小，對基因型依賴少，環境污染少。Mariani等人在1990 年開創了一個創造植物雄性不育的新途徑。他們應用來自于煙草的花藥絨氈層特異啟動子 (TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)嵌合后轉化煙草和油菜，由于核糖核酸酶的作用，轉 基因煙草和油菜的花藥絨氈層被破壞，形成花粉敗育，而轉基因煙草的其他器官發育正常。 目前除了 Barnase基因以外，還有許多其他功能基因被應用于基因工程雄性不育的研究。

發明內容
本發明的目的在于提供一種培育雄性不育系植物的方法。本發明提供的培育雄性不育系植物的方法，是將含有如下表達盒的重組表達載體 導入目的植物中得到所述雄性不育系植物從上游至下游依次包括loxp位點、花藥或雄 蕊器官原基特異啟動子、乙烯受體ETRl蛋白的編碼基因的反向互補基因、終止子和Ioxp位
點ο進一步，上述表達盒中，Ioxp位點的核苷酸序列如序列表中序列3的第7-40位所 示、花藥或雄蕊器官原基特異啟動子的核苷酸序列如序列表中序列1所示、乙烯受體ETRl
3蛋白的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。更進一步，上述重組表達載體的構建方法是將所述啟動子和所述乙烯受體ETRl蛋白的編碼基因的反向互補基因插入一中間 載體的多克隆位點間(具體是啟動子插入EcoRI和SacI位點間；乙烯受體ETRl蛋白的編 碼基因的反向互補基因插入BglII和SpeI位點間)，得到所述重組表達載體； 所述中間載體是將序列表中序列3所示的片段插入PCAMB2300質粒的多克隆位點 間(如pvsl sta和SmaI酶切位點間)，得到所述中間載體。上述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，優選是擬南芥。本發明另一目的在于提供一種培育上述方法得到的不育系的恢復系的方法。本發明提供的培育上述恢復系的方法是，是將Cre基因導入上述目的植物中，得 到所述恢復系，所述Cre基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。具體地講，上述Cre基因是通過一表達載體導入植物中的所述表達載體是將序 列表中序列4所示的Cre基因片段插入pCAMBIA2300的多克隆位點間(如XbaI和BamHI 酶切位點間)，得到所述表達載體。本發明利用CRE/loxP位點特異性重組系統，在IoxP位點的兩端連接器官特異性 啟動子AP3介導的反義ETR1，成功構建轉基因擬南芥雄性不育系；將構建的帶有35S啟動 子介導的CRE基因的擬南芥恢復系與上述轉基因雄性不育系雜交，刪除擬南芥Fl代中的不 育基因，恢復擬南芥Fl代的育性(表4)。本發明對構建的轉基因擬南芥不育系花器官的形態觀察，亞歷山大染色鏡檢花 粉，花粉萌發實驗發現轉基因擬南芥不育系花絲明顯縮短，花藥萎縮，可育花粉大量減少， 花粉無法正常萌發(萌發率僅為2. 67% )，結實率相對于對照植株明顯降低，育性表現為半 不育或全不育。而Fl代表現為育性恢復。這樣，利用CRE/loxP系統，我們可以人工構建雄性不育系和恢復系，形成利用雄 性不育，創建新的種質資源的方法。本發明是將基礎研究的發現(器官特異性ETRl表達下調可導致雄性不育)轉換 為應用領域具有源頭創新性的新思路和新方法，為發掘雜種優勢應用潛力和今后的精確育 種積累了新的經驗。


圖1為AP3啟動子的電泳圖；M為Marker 15000 ；1 以野生型擬南芥總基因組DNA 為模版擴增的AP3啟動子片段。圖2為aETRl基因(簡稱ETR1)的獲得，M =Marker 2000plus ；1 以野生型擬南芥 總RNA反轉錄后的cDNA為模板擴增的ETRl片段。圖 3 為中間載體 IoxP-MCS-IoxP (pCAMBIA2300)的驗證，M =Marker 15000 ；1 IoxP-MCS-IoxP(pCAMBIA2300)質粒為模版擴增的 loxP-MCS-loxP 片段(156bp)。圖 4 為重組表達載體 loxP-PAP3 :antiETRl_loxP(pCAMBIA2300)圖譜。圖 5 為 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP(pCAMBIA2300)載體驗證 M :Marker 2000plus ；1 以1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP質粒為模版擴增的AP3啟動子片段 (727bp)2 :1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP 質粒為模版擴增的 AtETRl 片段(2217bp)3 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP質粒為對象，雙酶切得到AP3啟動子酶切產物；4 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP質粒電泳圖；5 以 1οχΡ_ΡΑΡ3: antiETRl_loxP質粒為對象，雙 酶切得到PAP3 :antiETRl片段；6 以1οχΡ_ΡΑΡ3: antiETRl-loxP質粒為對象，雙酶切得到 ETRl基因片段。圖6為陽性轉1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因擬南芥苗潮霉素抗性篩選圖片。圖7為陽性轉1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因擬南芥基因組鑒定，M Marker2000plus ； 1-9 具不育表型的陽性轉基因擬南芥的基因組為模板PCR擴增；10-13 無不育表型的轉基因陽性擬南芥的基因組PCR擴增；14 以野生型擬南芥基因組為模板PCR 擴增(對照)。圖8為陽性轉1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP擬南芥的表型觀察，A，E 擬南芥花序 上花；(左野生型。右轉基因擬南芥)B，F 花序下第一朵花；(左野生型。右轉基因擬 南芥)C，G 花序下第三朵花；(左野生型。右轉基因擬南芥)D，H 野生型的角果和轉基 因植株角果；I 野生型擬南芥和陽性轉loxP-PAP3: :antiETRl-loXP擬南芥全株水平比較。圖9為陽性轉1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP植株與野生型植株花粉活力與花粉萌 發比較，A 野生型擬南芥花粉亞歷山大染色，野生型花粉有活性，呈現紫紅色，外形為圓形， 顆粒飽滿，整個花藥飽滿；B 陽性轉PAP3 :antiETRl基因擬南芥的花粉亞歷山大染色，轉基 因擬南芥花粉沒有活性，呈現綠色，而且花粉外形不規則，同時發現花藥呈萎縮狀。圖10為陽性轉1οχΡ-ΡΑΡ3: antiAtETRl-loxP植株與野生型植株花粉萌發比較， A是野生型；B是轉基因型。圖11為轉基因雄性不育擬南芥心皮及雄蕊育性檢測，A 陽性轉 loxP-PAP3: :antiETRl-loXP基因擬南芥雌蕊授野生型花粉；B 圖A局部放大圖，圖中顯示， 轉基因擬南芥授粉后得到正常角果；C 野生型植株心皮授轉基因雄性不育株系花粉(箭頭 所指的為授粉后所發育的角果)；D 圖C局部放大圖；野生型擬南芥授不育擬南芥花粉后 未得到正常角果；E 陽性轉loxP-PAP3: :antiETRl-loXP不育植株授自身花粉；F 圖E局部 放大圖；圖F顯示不育植株授自身花粉未得到正常角果。圖12為Cre基因的獲得，M =Marker 15000 ；1 以ρ匪23質粒為模版擴增的Cre片段。圖 13 為 35S =CRE 載體鑒定 M =Marker 2000plus ；1 以 pMM23 質粒為模版，XbaI/ BamHI雙酶切35S =CRE得到CRE酶切產物；2 以ρ匪23質粒為模版擴增的Cre片段。圖14為轉基因雄性不育系X野生型雜交后代插入片段檢測，M=Marker 2000plUsl-30 以轉基因雄性不育系X野生型雜交Fl代基因組為模板進行基因組PCR.檢 測目標為loxP-PAP3 :antiETRl-l0XP片段(3500bp)，圖中可以看出，Fl代中，該片段依然存 在。圖15為陽性轉1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因雄性不育擬南芥和陽性轉35S Cre基因恢復系雜交后代基因組檢測，A 陽性轉1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP出現雄性不 育表型擬南芥的與陽性轉35S:Cre基因恢復系雜交后代得基因組為模板PCR擴增(檢 測Cre基因)，圖中顯示，在Fl代基因組中Cre片段依然存在(箭頭所指)；B 陽性轉 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP出現雄性不育表型擬南芥的與陽性轉35S =Cre基因恢復系雜 交后代得基因組為模板PCR擴增(檢測AP3ETR1序列檢測IoxP之間插入片段)圖中顯示，在Fl代基因組中loxP-PAP3: :antiETRl-loxP片段已經被刪除(箭頭所指)。圖16為陽性轉1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP雄性不育植株分別授35S CRE花粉和野生型擬南芥花粉后得到的Fl代生長情況，圖A中的圖A-I植株為 loxP-PAP3: :antiETRl-loxPX35S =CRE Fl代圖中可以看到轉基因不育植株與恢復系雜交 后代育性與預期結果相同，即轉基因不育系X恢復雜交后代可以正常生長，得到下一代； 圖A-2植株為loxP-PAP3: :antiETRl-loxPXWT Fl代圖中可以看到轉基因不育植株與野生 型雜交后代育性與預期結果相同，即轉基因不育系X恢復雜交后代為不育系植株；圖B為 圖A部分放大圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。本發明中，IoxP-MCS-IoxP(pCAMBIA2300)與pCAMBIA2300-loxP-MCS_loxP 的 含義相同；loxP-PAP3 :antiETRl-loxP(pCAMBIA2300)與 pCAMBIA2300-loxP_PAP3 antiETRl-loxP的含義相同。實施例1、不育系的獲得及其驗證一、不育系的獲得(一)重組載體的構建1、AP3啟動子克隆利用NCBI上的擬南芥AP3啟動子序列，設計一對引物如下AP3F 5' -AACCATGGAACTTGTGATTCCTTCTTAAAC-3，；AP3R 5' -AA GGATCC ATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC-3，。U M ^ (Arabidopsis ecotype Col-O ； _ 自 Arabidopsis Biological ResourceCenter,USA)的基因組DNA為模板，采用上述引物對，通過PCR方法獲得有AP3啟 動子功能的部分序列，PCR產物(717bp)的電泳圖見圖1。經測序鑒定正確。除去引入的酶 切位點，PCR產物的核苷酸序列見序列表的序列1，命名為AP3。2、乙烯受體atETRl基因的獲得利用NCBI上檢索到擬南芥的ETRl基因(Atlg66340)，設計特異引物如下atETRIF 5' -CCTTAATTAAATGGAAGTCTGCAATTGTATT-3'；atETRlR :5’ -ACCATGGTTACATGCCCTCGTACAG-3，。將擬南芥Col-O總RNA反轉錄成cDNA，用上述引物對針對該cDNA進行PCR擴增， PCR產物(2217bp)的電泳圖見圖2。經測序鑒定正確。除去引入的酶切位點，PCR產物的 核苷酸序列見序列表的序列2，命名為atETRl。3、中間載體 loxP-MCS_loxP(pCAMBIA2300)的構建首先設計兩端帶有IoxP位點的多克隆位點堿基序列loxP-MCS-loxP (序列表中序 列3所示，Ioxp位點的核苷酸序列是序列表中序列3的第7-40位和第111-143位；MCS多 克隆位點是第41-142位)將該序列克隆到pGEM-TEasy載體，測序無誤。將IoxP-MCS-IoxP序列從克隆載體上切下，連入pCAMBIA2300質粒(http //www.cambia. org, au)的 pvsl sta 和 SmaI 酶切位點間(這樣 loxP-MCS-loxP 可替代 pCAMB2300 中35s =GFP序列)，構建成的中間載體，命名為IoxP-MCS-IoxP(pCAMBIA2300)。中間載體IoxP-MCS-IoxP (pCAMBIA2300)經 PCR 驗證，結構正確(圖 3)。4、構建重組表達載體 loxP-PAP3 :antiETRl_loxP (pCAMBIA2300)將步驟1得到的AP3啟動子和步驟2得到的atETRl分別插入步驟3的中間載體的 EcoRI和SacI位點間以及BglII和SpeI位點間(也即將將步驟1得到的AP3啟動子和步驟 2得到的atETRl插入了兩個Ioxp位點間)，獲得重組表達載體(圖4)，命名為1οχΡ_ΡΑΡ3 antiETRl-loxP (pCAMBIA2300)。將該載體經PCR驗證和酶切驗證，結構正確(圖5)。(二)不育系的獲得將構建好的轉基因質粒(loxP-PAP3 :antiETRl_loxP (pCAMBIA2300))利用農桿菌 介導的Floral Tip法轉入擬南芥(Col)。將發育中的花組織直接浸入含5 %蔗糖和200 μ 1/ 1表面活性劑Silwet L-77的過夜培養農桿菌液中。經過帶有潮霉素Hyg+(50mg/L)的平 板篩選(圖6)獲得33株具有潮霉素抗性的再生植株，將再生轉化植株轉移到溫室中生長。 經過一段時間生長得到的9株轉基因擬南芥出現了不育表型。為了鑒定具有潮霉素抗性的轉基因擬南芥是否確實轉入 1οχΡ-ΡΑΡ3 antiETRl-loxP片段，我們對轉基因陽性擬南芥苗進行了基因組PCR檢 測。因為鑒定陽性苗基因組中loxP-PAP3: :antiETRl-loxP片段的PCR引物是根 據loxP-PAP3: :antiETRl-loxP片段的DNA序列特點設計(正向引物設計在AP3 上，具體是AACCATGGAACTTGTGATTCCTTCTTAAAC ；反向引物在atETRl上，具體是 ACCATGGTTACATGCCCTCGTACAG)的，因此以擬南芥的基因組為模板的PCR擴增反應中，只有 整合有loxP-PAP3: :antiETRl-loXP片段的基因組DNA才會有對應的特異大小的條帶出現。 檢測結果表明，9株出現雄性不育表型的轉基因抗性植株均有預期的特異條帶擴增，而隨機 選擇4株未出現雄性不育表型的轉基因抗性植株也有預期的特異條帶擴增；而野生型植株 對照無相應片段的擴增(圖7)。實驗初步說明9個雄性不育表型抗性植株為陽性轉基因
田ο二、不育系的表型觀察1、花器官形態觀察利用常規石蠟切片技術，對上述9株陽性轉1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因雄性 不育植株與野生型植株花器官形態比較，結果如圖8 (由于9株表型一致，所以圖8只顯示 了 1株的結果)所示，陽性轉loxP-PAP3: :antiETRl-loxP基因植株花朵外形結構正常，花 萼、花瓣完整，雌蕊早期發育與正常野生型植株之間并無明顯差異，但是隨著植株進一步的 生長，轉基因植株花絲明顯比野生型花絲短，并且開始出現花藥萎縮現象；在全株水平上， 可以看出轉基因植株出現嚴重的不育表型，結實率相對于對照植株明顯降低，育性表現為 半不育或全不育。2、亞歷山大染色鏡檢花粉形態利用亞歷山大染色鏡檢對轉基因植株的花粉形態進行更精細的觀察。結果發現， 出現雄性不育表型的9株轉基因植株花藥萎縮，外形不規則，花藥內可育花粉含量很少，并 且在花粉染色實驗中大部分花粉被染成綠色，說明這部分花粉沒有生活力(圖9)；而野生 型植株則表現花藥結構飽滿，花粉顆粒飽滿、表面結構光滑，在花粉染色實驗中花粉被染成
7紫紅色，說明這部分花粉有活力。3、花粉萌發實驗實驗步驟取離體擬南芥花粉懸于萌發液中(10%蔗糖，IOOml加1_2滴0. 硼 酸，lmmol/L CaCl2, lmmol/L Ca (NO)3, Immo 1/L MgSO4)，用 KOH 調至 pH 值 6. 5。于 25C 光照 培養箱中，以30轉輕搖4小時。鏡下觀察并統計萌發率。在離體條件下，通過對培養基上培養24小時的花粉進行觀察，發現野生型植株花 粉的花粉管可以伸長，其萌發率可以達到41% ；而出現雄性不育表型的轉基因植株花粉萌 發率僅為2. 67% (表1)，僅有少數花粉發芽且花粉管短(圖10)。表1.花粉萌發情況統計表
權利要求
一種培育雄性不育系植物的方法，是將含有如下表達盒的重組表達載體導入目的植物中得到所述雄性不育系植物從上游至下游依次包括loxp位點、花藥或雄蕊器官原基特異啟動子、乙烯受體ETR1蛋白的編碼基因的反向互補基因、終止子和loxp位點。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述表達盒中，Ioxp位點的核苷酸序列如序 列表中序列3的第7-40位所示、花藥或雄蕊器官原基特異啟動子的核苷酸序列如序列表中 序列1所示、乙烯受體ETRl蛋白的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重組表達載體的構建方法是將所述啟動子和所述乙烯受體ETRl蛋白的編碼基因的反向互補基因插入一中間載體 的多克隆位點間，得到所述重組表達載體；所述中間載體是將序列表中序列3所示的片段插入PCAMB2300質粒的多克隆位點間， 得到所述中間載體。
4.如權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單 子葉植物，優選是擬南芥。
5.一種培育權利要求1-4中任一所述方法得到的不育系的恢復系的方法，是將Cre基 因導入權利要求1-4中任一所述方法中的目的植物中，得到所述恢復系，所述Cre基因的核 苷酸序列如序列表中序列4所示。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述Cre基因是通過一表達載體導入植物 中的所述表達載體是將序列表中序列4所示的Cre基因片段插入pCAMBIA2300的多克隆 位點間，得到所述表達載體。
全文摘要
本發明公開了一種植物雄性不育系及其恢復系的培育方法。該方法，是將含有一表達盒的重組表達載體導入目的植物中得到所述雄性不育系植物；所述表達盒從上游至下游依次包括loxp位點、花藥或雄蕊器官原基特異啟動子、乙烯受體ETR1蛋白的編碼基因的反向互補基因、終止子和loxp位點。本發明還構建了上述不育系的恢復系，是將Cre基因導入上述目的植物中，得到恢復系。實驗證明將恢復系和不育系雜交后，恢復F1代的育性，由此創造一個新的，具有自主知識產權(不育系創制方法)、同時方便可行的雄性不育與雜種優勢利用的技術體系。該發明將基礎研究的發現轉換為應用領域，為發掘雜種優勢應用潛力和今后的精確育種提供了新的視角和經驗。
文檔編號A01H5/00GK101948861SQ20101026357
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月26日 優先權日2010年8月26日
發明者李曦, 王東輝, 白書農, 許智宏 申請人:北京大學