植物中雄性育性的遺傳減少的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種核玉蜀黍基因，所述核玉蜀黍基因突變以導致顯性雄性不育。提供了兩種影響信號肽加工的突變體。提供了使用所述顯性雄性不育突變體來產(chǎn)生用于雄性不育雜交植物的雜交種子的恢復構(gòu)建體和方法。提供了其他信號肽修改形式。提供了各種物種中的所述野生型基因或突變型基因的直系同源物。
【專利說明】植物中雄性育性的遺傳減少

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明整體涉及分子生物學領(lǐng)域，具體地講涉及植物育性的調(diào)節(jié)以改善植物脅迫耐性。
[0002]背景信息
[0003]植物在發(fā)育生命周期期間在各種植物組織間分配光合產(chǎn)物、礦物質(zhì)和其他生長組分。在玉蜀黍中，例如，穗和穗絲為共享某些發(fā)育過程并且相互競爭所需營養(yǎng)物質(zhì)的特定雌性和雄性花序結(jié)構(gòu)。例如，穗絲頂端優(yōu)勢可限制玉蜀黍植物中的穗生長和谷粒產(chǎn)量潛力。雜交玉蜀黍中的遺傳雄性不育可減小穗絲優(yōu)勢并且將更多資源轉(zhuǎn)向穗生長、籽粒數(shù)量和/或尺寸，最終得到增加的谷粒產(chǎn)量。資源分配中這種變化的優(yōu)點在環(huán)境脅迫條件下可能是特別有利的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]氮利用效率(NUE)基因影響產(chǎn)量并對改善氮在作物(特別是玉蜀黍)中的利用具有實用性。氮使用效率增加可由增加的對氮肥的吸收和同化和/或?qū)Ψe聚的氮儲備的后續(xù)再動員和再利用，以及植物對諸如低氮環(huán)境之類的脅迫情況的耐受性增加得到。基因可用于改變植物的遺傳組成，從而使得它們在當前的肥料施用標準下更高產(chǎn)或在肥料顯著減少或氮可用量顯著減少的情況下保持它們的產(chǎn)出率。在氮肥獲得受限的發(fā)展中國家和在氮使用水平保持較高的發(fā)達國家，改善玉米中的NUE都將會增加每單位投入氮肥的玉米可收獲產(chǎn)量。氮利用改善還使得能降低在農(nóng)場上的投入成本，降低對氮肥生產(chǎn)所需的非可再生能源的使用和依賴，以及減少氮肥生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)利用的環(huán)境影響。
[0005]提供用于改善植物產(chǎn)量，尤其是植物谷粒產(chǎn)量的方法和組合物。在一些實施例中，植物產(chǎn)量在脅迫，特別是非生物脅迫，例如氮限制條件下得以改善。改善植物產(chǎn)量的方法包括抑制植物的育性。植物的雄性育性可用本領(lǐng)域已知的任何方法來抑制,這些方法包括但不限于破壞穗絲發(fā)育基因，或者例如通過利用共抑制、反義或RNA沉默或干擾來降低基因的表達。育性的抑制可為部分減少或完全抑制。雄性不育植物也可通過利用遺傳雄性不育突變體來實現(xiàn)。
[0006]抑制植物中的雄性育性可改善植物的氮脅迫耐受性，并且這種植物可在顯著較低的氮肥投入的情況下保持它們的產(chǎn)出率和/或可表現(xiàn)出增加的氮肥吸收和同化和/或?qū)Ψe聚的氮儲備的再動員和再利用。除了產(chǎn)量的總體增加外，通過減少雄性育性改善氮脅迫耐受性還可導致根質(zhì)量和/或長度增加，穗、葉、種子和/或胚乳尺寸增加，和/或抗倒伏性改善。因此，在一些實施例中，所述方法還包括在氮限制條件下栽培所述植物，并任選選擇表現(xiàn)出對低氮水平有較大耐受性的那些植物。
[0007]另外，提供了改善非生物脅迫下的產(chǎn)量的方法和組合物，該方法包括:評價耕作區(qū)的環(huán)境條件的非生物應激源(stressor)(例如，土壤中的低氮水平)，并在脅迫環(huán)境下栽培具有減少的雄性育性的種子或植物。
[0008]本文還提供了構(gòu)建體和表達盒，所述構(gòu)建體和表達盒包含可有效減少雄性育性的核苷酸序列。
[0009]另外的方法包括但不限于:
[0010]一種通過增加植物中的一種或多種產(chǎn)量組分來增加產(chǎn)量的方法，包括通過影響植物中核編碼組分的表達或活性來減少雄性育性，以及在植物生長條件下種植植物，其中該組分表現(xiàn)出顯性表型。在一個實施例中，核編碼組分為具有顯性表型的雄性育性基因或雄性不育基因。任選地，雄性育性基因或雄性不育基因為轉(zhuǎn)基因。
[0011]在一個實施例中，雄性育性基因編碼SEQ ID N0:10的蛋白質(zhì)。在一個實施例中，雄性育性基因包括SEQ ID NO: 13的核苷酸序列。在一個實施例中，雄性育性基因編碼SEQID NO:14的多肽。
[0012]在一個實施例中，雄性育性的減少或使植物雄性不育通過單個核苷酸置換來實現(xiàn)，得到在第37位氨基酸處的氨基酸改變，在預測的蛋白質(zhì)中從丙氨酸變?yōu)樘K氨酸(SEQ IDNO:153)。在一個實施例中，雄性育性的減少或使植物雄性不育通過在第37位氨基酸處的氨基酸改變來實現(xiàn)，在預測的蛋白質(zhì)中從丙氨酸變?yōu)槔i氨酸。在一個實施例中，顯性雄性育性基因可操作地連接到選自如下的啟動子:誘導型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子、時間調(diào)節(jié)型啟動子或它們的元件。例如，啟動子優(yōu)先地驅(qū)動雄性生殖組織中的表達。
[0013]在一個實施例中，雄性育性在育種對的雌性植物(例如，雌性自交系)中減少。
[0014]在一個實施例中，一種植物或細胞或種子或它們的子代，其包括減少的編碼其基因組中的SEQ ID NO:10的第43-101位氨基酸序列的雄性育性序列，并且其中該雄性育性基因的表達賦予顯性雄性不育性狀。
[0015]分離的核酸分子包括能夠引發(fā)植物細胞中的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸并且包括選自如下的序列:SE Q ID NO:15 ；SEQ ID NO:15的至少100個連續(xù)核苷酸，以及與SEQ ID NO:15的全長具有至少70%序列同一性的序列。在一個實施例中，表達盒或載體包括本文公開的可操作地連接到目的多核苷酸的SEQ ID NO:15o
[0016]適用于本文公開的某些實施例的植物包括，例如，玉蜀黍(玉米)、高粱、卡諾拉油菜、小麥、大麥、裸麥、黑小麥、水稻、甘鹿、草坪草、珍珠粟、大?、棉花和向日葵。
[0017]在一個實施例中，具有減少的育性或本文公開的任何其他性狀的植物任選地具有賦予以下目的表型或性狀的一種或多種多核苷酸:改善的營養(yǎng)物質(zhì)吸收、氮利用效率、耐旱性、根強度、根耐倒伏性、土壤害蟲管理、玉米根蟲抗性、除草劑耐性、抗病性、或昆蟲抗性、或改變的碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸代謝或植物激素生物合成。
[0018]一種增加植物中的產(chǎn)量或維持產(chǎn)量穩(wěn)定性的方法，包括通過如下方式減少雄性生殖組織發(fā)育:在雄性生殖組織優(yōu)選的啟動子的控制下表達轉(zhuǎn)基因；以及在雄性和雌性組織同時發(fā)育期間增加分配至雌性生殖組織的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0019]在一個實施例中，雄性生殖組織為穗絲。在一個實施例中，雄性生殖組織發(fā)育通過表達可操作地連接到啟動子的基因而減少，所述啟動子包括選自列表SEQ ID NO:64-106的序列的至少100個連續(xù)核苷酸。本文公開的啟動子序列的子集，例如，SEQ ID NO =64-70,70-75、75-80、85-90、90-95、100-106同樣適用于驅(qū)動本文公開的目的多核苷酸的組織優(yōu)選的表達。
[0020]在一個實施例中，在本文公開的穗絲優(yōu)選的啟動子的控制下轉(zhuǎn)基因地表達目的多核苷酸(例如，具有顯性雄性不育突變的Ms44)的植物或植物細胞或種子表現(xiàn)出改善的農(nóng)學參數(shù)，諸如在生殖發(fā)育期間增加分配至穗的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0021]某些實施例包括包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸引發(fā)植物細胞中的轉(zhuǎn)錄并且包括選自如下的序列:
[0022]選自SEQ ID NO:64-106 的序列；
[0023]選自SEQ ID NO =64-106的序列的至少100個連續(xù)核苷酸，以及
[0024]與選自SEQ ID NO:64_106的序列的全長或與其子啟動子區(qū)具有至少70%至約95%序列同一性的序列。
[0025]在一個實施例中，在本文公開的穗絲優(yōu)選的啟動子的控制下轉(zhuǎn)基因地表達目的多核苷酸(例如，靶向涉及穗絲發(fā)育的多核苷酸的RNAi抑制序列)的植物或植物細胞或種子表現(xiàn)出改善的農(nóng)學參數(shù)，諸如在生殖發(fā)育期間改善的分配至穗的營養(yǎng)物質(zhì)和/或相對于對照增加的谷粒產(chǎn)量。
[0026]一種增加植物中產(chǎn)量或維持產(chǎn)量穩(wěn)定性的方法，包括減少雄性育性，并且在雄性和雌性組織同時發(fā)育期間增加分配至雌性生殖組織的營養(yǎng)物質(zhì)。在一個實施例中，通過改變遺傳雄性育性基因的表達來減少植物中的雄性育性。在一個實施例中，植物在脅迫下生長。在一個實施例中，植物在營養(yǎng)物質(zhì)限制條件，例如減少的可用氮下生長。
[0027]在一個實施例中，具有減少的雄性育性并且其中營養(yǎng)物質(zhì)在雄性和雌性組織同時發(fā)育期間更多地分配至雌性生殖組織的植物表現(xiàn)出以下農(nóng)學相關(guān)參數(shù)中的一者或多者:增大的SPAD值(葉綠素測量)、增加的抽穗絲速率或數(shù)目或程度、增加的穗長度、增加的穗寬度、增加的每個穗的種子數(shù)、增加的每個穗的種子重量和增加的胚尺寸。
[0028]在一個實施例中，具有減少的雄性育性并且其中營養(yǎng)物質(zhì)在雄性和雌性組織同時發(fā)育期間更多地分配至雌性生殖組織的植物在干旱脅迫下生長。在一個實施例中，通過雄性不育來改善植物的耐旱性。
[0029]—種包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸以組織優(yōu)選的方式引發(fā)植物細胞中的轉(zhuǎn)錄并且包括選自如下的序列:
[0030]SEQ ID NO:9 或 13 的調(diào)控區(qū)；
[0031]SEQ ID NO:62 和 64-106 ；
[0032]SEQ ID NO:9或13的調(diào)控區(qū)的至少100個連續(xù)核苷酸；
[0033]SEQ ID NO:62和64-106的至少100個連續(xù)核苷酸；
[0034]與SEQ ID NO:9或13的調(diào)控區(qū)的全長具有至少70%序列同一性的序列；
[0035]與SEQ ID NO:62和64-106的全長具有至少70%序列同一性的序列。
[0036]在一個實施例中，一種在脅迫下增加植物中產(chǎn)量穩(wěn)定性的方法，包括表達影響可操作地連接到本文公開的穗絲優(yōu)選的啟動子的雄性育性的元件從而減小在植物生殖發(fā)育階段期間對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭，并且其中產(chǎn)量增加。
[0037]—種在氮限制條件和/或正常氮條件下增加植物中產(chǎn)量或維持產(chǎn)量穩(wěn)定性的方法，包括減少雄性生殖組織發(fā)育并且增加在雄性和雌性組織同時發(fā)育期間分配至雌性生殖組織的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0038]在一個實施例中，雄性生殖組織為穗絲并且雄性生殖組織發(fā)育通過減少NIP3-1或NIP3-1類蛋白質(zhì)的表達來減少。在一個實施例中，NIP3-1蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列。雄性生殖組織發(fā)育通過增加SEQ ID NO:63的表達而減少。
[0039]在一個實施例中，雄性生殖組織發(fā)育通過影響涉及穗絲形成的基因，例如無穗絲基因的功能而減少。
[0040]在一個實施例中，雄性生殖組織發(fā)育在用靶向基因的抑制的表達盒轉(zhuǎn)化的植物中減少，所述基因編碼SEQ ID NO:107的氨基酸序列或與SEQ ID NO:107具有至少70%或80 %或85 %或90 %或95 %同一性的序列。本文還公開了在TlsI等位基因中具有天然突變的植物。
[0041]在一個實施例中，組織優(yōu)選的啟動子優(yōu)先地驅(qū)動雄性生殖組織中目的基因的表達。在一個實施例中，啟動子為組織特異性啟動子、組成型啟動子或誘導型啟動子。在一個實施例中，組織優(yōu)選的啟動子為穗絲優(yōu)選的啟動子。
[0042]一種包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸包括選自如下的序列:SEQID NO:63 ；SEQ ID NO:63的至少100個連續(xù)核苷酸，以及與SEQ ID NO:63的全長具有至少70%序列同一性的序列。分離的核酸分子包括編碼TLSl蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:107的氨基酸序列或與SEQ ID NO:107具有至少70%或80%或85%或90%或95%同一性的序列。
[0043]一種用于產(chǎn)生雄性不育雜交種子的方法，包括轉(zhuǎn)化對于具有基因構(gòu)建體的顯性雄性不育為雜合的自交系，所述基因構(gòu)建體包括抑制顯性雄性不育表型的第一元件、破壞花粉功能的第二元件，以及任選地可為選擇性或篩選性標記的標記，其中在自交系中表達構(gòu)建體使雄性系可育；該系稱之為轉(zhuǎn)基因保持系。在一個實施例中，該方法還包括轉(zhuǎn)基因保持系的自花授粉植物，以產(chǎn)生為純合的顯性雄性不育的子代。
[0044]該方法還包括鑒別具有作為雌性自交系的純合顯性雄性不育基因型的那些種子。雌性自交系任選地通過用轉(zhuǎn)基因保持系對其授粉而增加，得到不含構(gòu)建體的100%純合的顯性雄性不育種子。
[0045]該方法還包括用雄性親本對由顯性雄性不育種子生長而來的植物授粉，以產(chǎn)生對于顯性雄性不育為雜合的雜交體并且顯示顯性雄性不育表型。
[0046]在一個實施例中，顯性雄性不育表型由多核苷酸序列賦予，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:15的至少100個連續(xù)核苷酸，并且還編碼蘇氨酸來替代SEQ ID NO:14的第37位的丙氨酸(由SEQ ID NO:15編碼的氨基酸序列)。
[0047]在一個實施例中，抑制元件包括對于SEQ ID NO:9或SEQ ID N0:13，或?qū)τ诳刹僮鞯剡B接至SEQ ID N0:15或SEQ ID NO:152的啟動子是特異性的啟動子反向重復(pIR)序列。在一個實施例中，反向重復序列包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13的至少100個連續(xù)核苷酸的片段。在一個實施例中，抑制元件為設計用于抑制顯性Ms44基因在雄性不育雌性自交系中的表達的RNAi構(gòu)建體，并且可靶向SEQ ID N0:15或SEQ ID N0:152。在一個實施例中，抑制元件為以顯性方式起作用以抑制植物中Ms44突變的顯性不育表型的遺傳抑制因子。任選地，如果內(nèi)源的正常ms44也受到抑制元件抑制,則構(gòu)建體可包括恢復ms44基因，例如在其自身啟動子或異源啟動子控制下的ms44基因的正常功能的元件。
[0048]在一個實施例中，公開了從本文所公開的方法得到的植物或植物細胞或種子或植物的子代。
[0049]在一個實施例中，用于產(chǎn)生雜交種子的方法包括在自交系中表達可操作地連接到異源啟動子的適于反向重復失活的顯性雄性不育基因；以及用來自雄性可育植物的花粉對該雄性不育植物授粉，所述雄性可育植物包含對于異源啟動子是特異性的反向重復。在一個實施例中，花粉包含對具有反向重復失活特異性的異源啟動子是特異性的反向重復。在一個實施例中，顯性雄性不育基因連接至水稻5126啟動子。
[0050]在一個實施例中，在雜交種子生產(chǎn)的上下文中使用的顯性雄性不育基因為以顯性方式起作用以實現(xiàn)雄性不育并且任選地適于抑制以維持雄性不育雌性自交系的任何基因。在一個實施例中，顯性雄性不育基因選自:芽孢桿菌RNA酶、DAM甲基化酶、鏈霉抗生物素蛋白、MS41 和 MS42。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1 一產(chǎn)生雄性不育雜交植物的遺傳顯性雄性不育體系的圖。已發(fā)現(xiàn)可利用顯性核雄性不育基因、穗絲特異性或穗絲優(yōu)選的啟動子和穗絲特異性或穗絲優(yōu)選的基因中的一種或多種的植物中的雄性育性的遺傳減少可增加穗組織發(fā)育、改善正在生長的植物中的營養(yǎng)物質(zhì)利用率、增加脅迫耐性和/或增加種子度量值，最終得到改善的產(chǎn)量。
[0052]圖2-MS44相關(guān)序列的比對(圖2A_C)。相同的殘基以粗體示出并且所有相似的殘基以下劃線和斜體示出。
[0053]圖3-利用隱性雄性不育基因產(chǎn)生雄性不育雜交植物的方法的圖。雌性親本和雄性親本均具有賦予不育性的純合隱性等位基因。然而，雄性親本使恢復等位基因在構(gòu)建體內(nèi)，其防止恢復等位基因通過花粉傳遞。所得的雜交種子產(chǎn)生雄性不育的雜交植物。
[0054]圖4-用于利用下述顯性雄性不育基因產(chǎn)生雄性不育雜交植物的方法的圖:
[0055]4A-對于顯性雄性不育(DMS)為雜合的自交系用基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化(SAM ;抑制、消融、標記)，所述基因構(gòu)建體包括抑制顯性雄性不育的元件、破壞花粉功能的第二元件，以及任選地選擇性標記。該構(gòu)建體在自交系中的表達使植物雄性可育。
[0056]迎-植物自花授粉以產(chǎn)生種子。
[0057]4C和4D-對種子或子代棺物講行基因分型和/或表型分型以鑒別對于顯件雄件不育為純合的那些，并且還將種子或子代植物表征為攜帶或不含SAM構(gòu)建體。
[0058]4E-雄性不育自交系可通過用轉(zhuǎn)基因保持系對其授粉而增加，得到全部為純合的顯性雄性不育并且不含SAM構(gòu)建體的種子。
[0059]4F-顯性雄性不育自交系植物由第二自交系授粉以產(chǎn)生對于顯性雄性不育為雜合并且表現(xiàn)出顯性雄性不育表型的雜交體。雄性不育雜交種子為在種植時將產(chǎn)生為雄性不育的雜交植物的種子。
[0060]圖5-圖5A示出了響應于氮肥力的MS44雜交體產(chǎn)量-試驗I。圖5B示出了響應于氮肥力的MS44雜交體產(chǎn)量-試驗2。
[0061]圖6示出了與野生型相比較的MS44雜交體穗干重(Rl階段)。
[0062]圖7-圖7A示出了響應于植物群體的MS44雜交體產(chǎn)量-試驗I。圖7B示出了響應于植物群體的MS44雜交體產(chǎn)量-試驗2。
[0063]圖8示出了 tlsl突變表型。A)來自野生型植物的穗絲。B)具有小的穗絲表型的純合tlsl植物。C)不具有穗絲的純合tlsl植物。D)具有最嚴重表型的植物往往具有帶長殼并且不抽穗絲的多個穗(箭頭)。E)穗表型的范圍。F)葉表型的范圍。WT=純合野生型植物；ST =具有小的穗絲的純合tlsl植物；NT =不具有穗絲的純合tlsl植物。
[0064]圖9示出了 tlsl的基于圖譜的克隆。
[0065]圖10示出了 tlsl候選基因驗證。ZmNIP3.1的敲除得到tlsl表型。圖1OA-具有完整ZmNIP3.1的野生型植物。圖1OB-在ZmNIP3.1中具有Mu-插入的植物表現(xiàn)出tlsl表型。
[0066]圖11示出突變型、野生型和噴以硼的突變型中的穗絲分枝數(shù)。
[0067]圖12示出突變型、野生型和噴以硼的突變型中的穗絲分枝長度。
[0068]圖13示出突變型、野生型和噴以硼的突變型中的穗長度。
[0069]圖14示出tlsl植物較不易受50ppm硼的硼毒性條件影響。圖14A-并列放置純合tlsl植物和野生型植物，其中突變型植物看起來更高和更大。圖14B-在野生型植物中，第二嫩的完全張開的葉的節(jié)在最嫩的完全張開的葉的節(jié)的上方延伸，然而突變型植物看起來是正常的。圖14C-突變型的最嫩的完全張開的葉比野生型更寬。
[0070]圖15示出了 ZmNIP3.1類似于硼通道蛋白。圖15A-系譜樹示出ZmNIP3.1與已被表征為硼通道蛋白的0sNIP3.1和AtNIP5.1(突出顯示的)密切相關(guān)。圖15B-在15A中突出顯示的蛋白質(zhì)序列的比對，其中ZmNIP3.1與0sNIP3.1和AtNIP5.1的百分比同一性分別為 84.4 和 67.3。
[0071]圖16-來自所選物種的Ms44序列。在該比對中，Ms44顯性多肽序列的氨基酸突變在第42位以粗體和下劃線示出，如MS44dom等位基因中的T (SEQ ID NO: 14)或Ms44_2629等位基因中的V(SEQ ID NO:153)，其中所有其他序列在該位置具有A。

【具體實施方式】
[0072]正在發(fā)育的雌性生殖結(jié)構(gòu)與雄性生殖結(jié)構(gòu)在這些生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育期間競爭氮、碳和其他營養(yǎng)物質(zhì)。這在當植物以增加的氮肥水平種植時定量正在發(fā)育的玉蜀黍穗和穗絲的氮平衡中進行說明。當玉蜀黍在較低氮肥水平下生長時，穗的氮平衡為負，或在發(fā)育期間當?shù)芟迺r，穗丟失氮至植物的其他部分。穗的氮平衡在提供給植物的氮肥的量增加時改善，直到穗維持氮的正向增加直至抽穗絲。相比之下，無論種植植物的育性水平如何，穗絲都維持正向氮平衡。穗絲和穗在生殖發(fā)育期間競爭氮，并且正在發(fā)育的穗絲對正在發(fā)育的穗占優(yōu)勢。穗和穗絲可能在發(fā)育期間競爭多個營養(yǎng)物質(zhì)，并且競爭在脅迫條件下變得更激烈。穗在開花之前在生殖發(fā)育期間與穗絲競爭減少了正在發(fā)育的穗在脅迫下積聚營養(yǎng)物質(zhì)的能力，得到具有較少籽粒的較小、發(fā)育較差的穗。更嚴重的、延長的脅迫可導致穗無法抽穗絲(exert silk)和產(chǎn)生谷粒。雄性育性的遺傳減少將減少穗絲發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，導致開花時穗發(fā)育改善。
[0073]遺傳雄性不育和雄性可育近親在不同氮肥水平下生長并且在約50%花粉散出時取樣。在兩種氮肥水平下雄性不育植物比其雄性不育近親產(chǎn)生更大的穗。抽穗絲的雄性不育植物的比例也大于可育近親植物。雖然生物量(總地上植物干重減去穗干重)在較高氮肥下生長的植物中較大，但是雄性不育對生物量無影響。這表明雄性不育具體地對植物產(chǎn)生更重、更完全發(fā)育的穗的能力的正面影響，而不影響總體營養(yǎng)生長。
[0074]之前尚未對遺傳雄性不育衍生的雜交體進行產(chǎn)量實驗，因為直到最近還沒有利用該雄性不育源產(chǎn)生雜交種子的適當方法。由于大多數(shù)遺傳雄性不育為隱性的，因此產(chǎn)生雄性不育雜交體將需要雄性不育源回交到雜交體的兩個親本中。對于雜交體雌性親本將必須為純合隱性(雄性不育)的并且雄性親本必須為雜合(雄性可育)的以對雄性不育1:1分離。
[0075]相比之下，顯性遺傳雄性不育MS44僅需要回交到雌性親本中以產(chǎn)生對雄性不育
I: I分離的雜交種子。顯性雄性不育在多倍體植物諸如小麥中特別有用，其中純合隱性不育的維持更為復雜。
[0076]已發(fā)現(xiàn)表達植物中顯性遺傳雄性不育基因的過程，所述植物任選地結(jié)合穗絲組織特異性/穗絲組織優(yōu)選的啟動子和穗絲特異性或穗絲優(yōu)選的基因，以增加穗組織發(fā)育、改善正在生長的植物中的營養(yǎng)物質(zhì)利用率并且增加種子度量值，最終得到改善的產(chǎn)量。(圖1)
[0077]與細胞質(zhì)雄性不育(CMS)相比，遺傳雄性不育極可能產(chǎn)生產(chǎn)量響應，因為花粉發(fā)育在遺傳雄性不育突變體中比在CMS衍生的不育中停滯得更早。大多數(shù)遺傳雄性不育突變體在花粉四分體釋放后很快就失效(Albertsen and Phillips, (1981)Can.J.Genet.Cytol.23:195-208 (Albertson和Phillips, 1981年，《加拿大遺傳學與細胞學雜志》，第23卷，第195-208頁)，其出現(xiàn)在雌性(穗)發(fā)育的非常早的階段。直到開花前10天才能確定CMS衍生的雄性不育，如通過與CMS穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)的環(huán)境相互作用所判斷的(Weider，et al.，(2009) Crop Sc1.49:77-84 (Weider 等人，2009 年，《作物科學》，第 49 卷，第 77-84頁))。穗的主體發(fā)育將發(fā)生在開花前10天之前，從而CMS衍生的不育將在穗發(fā)育期間提供極少減輕的穗絲競爭。相比之下， 遺傳雄性不育中雄性生殖組織發(fā)育的早期停滯減少了當穗處于發(fā)育早期階段時正在發(fā)育的穗與正在發(fā)育的穗絲之間對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭。與通過改善穗發(fā)育引導的雄性不育雜交體相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)量改善與穗發(fā)育和穗絲發(fā)育競爭的減少一致。
[0078]在恢復的(雄性可育)和未恢復的(雄性不育)細胞質(zhì)雄性不育(CMS)雜交體中測試對氮肥力的產(chǎn)量響應。一個雜交體在開花期間由于環(huán)境條件變?yōu)樾坌钥捎硪粋€雜交體由于雄性不育未表現(xiàn)出顯著的產(chǎn)量效應。這些結(jié)果將是可以預期的，因為通過細胞質(zhì)基因確定的雄性不育直到穗絲和穗發(fā)育的極晚期才會確定，如通過與CMS穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)的環(huán)境相互作用所判斷的。穗的主體發(fā)育已在不可否認地確定CMS雄性不育之前(開花前10天)發(fā)生，從而在穗發(fā)育期間提供極少減輕的穗絲競爭。大多數(shù)遺傳雄性不育突變體在花粉四分體釋放后很快就失效(Albertsen和Phillips, 1981年)，其出現(xiàn)在雌性(穗)發(fā)育的非常早的階段。因此，遺傳雄性不育中的穗絲發(fā)育將在整個穗發(fā)育時間段期間減少，從而與穗發(fā)育競爭較少。遺傳雄性不育突變體極少受環(huán)境條件的影響。
[0079]減輕正在發(fā)育的穗絲和穗之間的競爭還可通過化學誘導雄性不育來實現(xiàn)。化學物質(zhì)和遺傳操縱的組合也可誘導雄性不育。通過雄性生殖組織中具有較低功效的啟動子或通過使用殺配子劑前體(pro-gametocide)調(diào)節(jié)的除草劑耐性(Dotson, et al., (1996) ThePlant Journal 10:383-392 (Dotson 等人，1996 年，《植物雜志》，第 10 卷，第 383-392 頁)和(Mayer and Jefferson, (2004)Molecular Methods for Hybrid Rice Product1n.Areport for the Rural Industries Research and Development Corporat1n)(Mayer 和Jefferson, 2004年，用于雜交水稻生產(chǎn)的分子方法，農(nóng)村產(chǎn)業(yè)研究與開發(fā)公司的報告))以組織特異性方式釋放雄性抑制劑也將是實踐本發(fā)明的有效方法。
[0080]在多種情況下，特定的植物性狀通過維持純合隱性條件來表達。當恢復基因必須用于維持時，維持純合條件出現(xiàn)困難。例如，玉蜀黍中的MS45基因(美國專利N0.5，478，369)已表現(xiàn)出對于雄性育性至關(guān)重要。由于MS45育性性狀的孢子體性質(zhì)，因此顯性MS45等位基因的雜合或半合植物是完全可育的。MS45基因中指定為ms45的天然突變在該突變型等位基因處于純合狀態(tài)時賦予植物雄性不育表型。當通過普通雜交或轉(zhuǎn)基因互補方法將非突變形式的基因引入植物中時，此不育性可逆轉(zhuǎn)(即，育性被恢復)。然而，通過雜交對育性的恢復移除了所需的純合隱性條件，并且兩種方法都恢復了全部雄性育性并且阻止了對純的雄性不育母系的維持。
[0081]維持所需的純合隱性條件的方法在美國專利N0.7，696，405和7，893，317中有所描述，其中保持系用于雜交到純合隱性雄性不育姊妹體上。保持系在雄性不育所需的純合隱性條件下，而且還包含由顯性雄性育性基因組成的半合轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體以補充雄性不育條件；花粉消融基因，其導致對花粉的形成、功能或傳播的破壞從而阻止通過轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的花粉轉(zhuǎn)移至雄性不育姊妹體，但允許隱性雄性不育等位基因通過非轉(zhuǎn)基因花粉粒的轉(zhuǎn)移；以及種子標記基因，其允許對轉(zhuǎn)基因保持系種子或植物和轉(zhuǎn)基因無效雄性不育種子或植物進行分選。
[0082]制種技術(shù)(SPT)提供了維持植物中雄性不育基因的純合隱性條件的方法。參見(例如)美國專利N0.7，696，405。SPT將為花粉源的保持系用于其純合隱性雄性不育姊妹體的受精。保持系在雄性不育所需的純合隱性條件下，而且還包含半合轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體(“SPT構(gòu)建體”)。在某些實施例中，SPT構(gòu)建體包含以下三種元件:(I)顯性雄性育性基因，以補充雄性不育隱性條件；(2)編碼干擾雄性配子的形成、功能或傳播的產(chǎn)物的基因和(3)標記基因，其允許從那些不含該轉(zhuǎn)基因的種子/植物中分選該轉(zhuǎn)基因保持系種子/植物。對花粉的形成、功能或傳播的干擾阻止了通過轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的花粉轉(zhuǎn)移；功能性花粉不含該轉(zhuǎn)基因。所得的種子產(chǎn)生為雄性不育的植物。然后將這些雄性不育自交系植物用于通過用雄性親本授粉的雜交體生產(chǎn)，所述雄性親本對于雄性育性基因的顯性等位基因可為不相關(guān)的自交系純合體。所得的雜交種子產(chǎn)生為雄性可育的植物。
[0083]要產(chǎn)生雜交雄性不育子代，雄性親本將用作保持系以雜交到雄性不育雌性自交系上(利用單獨的保持系增加)以得到完全雄性不育的雜交植物。參見(例如)圖3。
[0084]使用顯性方法是實現(xiàn)雄性不育的另一種方法。在很多方面，顯性雄性不育方法優(yōu)于隱性雄性不育的使用，因為完全不育僅需要顯性基因的單拷貝。然而，如果方法不可用于產(chǎn)生純合顯性雄性不育系，那么所得的子代將對雄性不育50%分離。實際上，該情況可通過轉(zhuǎn)基因地將篩選性或選擇性標記連接到顯性雄性不育基因并且篩選或選擇攜帶標記的子代種子或植物來減輕。對于顯性雄性不育等位基因，連接的遺傳標記或連接的表型可用于分選子代。描述可逆顯性雄性不育體系的方法在將化學物質(zhì)施加于顯性雄性不育植物的美國專利N0.5，962，769中有所描述，所述可逆顯性雄性不育體系逆轉(zhuǎn)表型并且得到雄性育性，從而允許自花授粉使得可獲得純合顯性雄性不育植物。可預想用于產(chǎn)生純合顯性雄性不育植物的其他方法，所述方法使用控制抑制或干擾顯性雄性不育基因功能的基因的誘導型啟動子。植物為組成型不育的，僅當啟動子被誘導時變?yōu)榭捎模瑥亩试S破壞顯性雄性不育基因功能的阻遏子的表達。阻遏子可為靶向顯性雄性不育基因自身或其啟動子，或能夠結(jié)合顯性雄性不育基因產(chǎn)物或使其失活的基因產(chǎn)物的反義基因、RNA1、反向重復序列。
[0085]另一個在顯性雄性不育的子代中產(chǎn)生100%雄性不育的方法將使用自動剪接蛋白質(zhì)序列。自動剪接蛋白質(zhì)序列為能夠自行切除并且以肽鍵重新結(jié)合剩余的一個或多個部分的蛋白質(zhì)片段。自動剪接蛋白質(zhì)序列可自剪接并且以頁式和反式兩種狀態(tài)再連接剩余部分。顯性雄性不育基因可進行修飾使得對N和C蛋白質(zhì)區(qū)域編碼的區(qū)域被分成不同的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，與對自動剪接蛋白質(zhì)序列編碼的序列結(jié)合。由于蛋白質(zhì)為截短和無功能的，所以包含單個構(gòu)建體的植物將為雄性可育的，其允許自體受精以產(chǎn)生純合植物。然后可將對于N-DMS-N-自動剪接蛋白質(zhì)序列為純合的植物與對于C-自動剪接蛋白質(zhì)序列-C-DMS蛋白質(zhì)為純合的植物雜交。所有來自此雜交的子代通過切除每個自動剪接蛋白質(zhì)序列以及N和C序列的再連接將為雄性不育的，以產(chǎn)生功能性的顯性雄性不育蛋白質(zhì)。
[0086]一系列田間實驗用于定量在各種環(huán)境變量下遺傳雄性不育的產(chǎn)量響應。使用兩個變量:施氮量和植物密度，以使植物經(jīng)受各種程度的脅迫。脅迫處理的連續(xù)性由于對遺傳雄性不育植物的穗的更大程度的同化物分配，允許對植物性能的清晰分離。這些方法用于定量和說明田地中代表性的作物冠層環(huán)境中的正向產(chǎn)量效應。這些數(shù)據(jù)驗證了在溫室研究中測量的早期單個植株響應。
[0087]雄性不育表現(xiàn)為在特定植物組織的發(fā)育中的變化。玉蜀黍穗和穗絲為共享共同的發(fā)育過程并且受共同的一組基因控制的兩種花序結(jié)構(gòu)。組織彼此競爭所需的營養(yǎng)物質(zhì)。然而穗絲具有優(yōu)于穗的頂端優(yōu)勢的優(yōu)點，其不利于玉蜀黍植物中的穗生長和產(chǎn)量潛力。減小穗絲頂端優(yōu)勢可用于將更多資源轉(zhuǎn)向穗生長、籽粒數(shù)量或尺寸，并且最終可得到增加的谷粒產(chǎn)量。
[0088]有多種方法減少穗絲的競爭，諸如雄性不育、穗絲尺寸減少或穗絲消除(無穗絲玉蜀黍植物)。當基因的遺傳突變(突變體)諸如雄性不育基因可用于減少穗絲與穗的競爭時，轉(zhuǎn)基因操作提供用于此目的的替代方案或使能工具。由于涉及穗絲發(fā)育的基因通常涉及穗發(fā)育，所以通過中斷這些基因減少穗絲發(fā)育也可影響穗發(fā)育。無穗絲基因(Tsll)突變?yōu)槠渲袩o穗絲植物也是無穗的例子。要使穗絲生長減少而不干擾穗發(fā)育，則需要穗絲特異性啟動子靶向僅在穗絲組織中的基因破壞。
[0089]提到的所有參考文獻均以引用方式并入本文。
[0090]除非另外明確定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非另外提出，否則本文所采用或所考慮的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標準方法。材料、方法和實例僅為示例性的而不是限制性的。以下內(nèi)容以舉例說明的方式給出，而非意在限制本發(fā)明的范圍。
[0091] 借助前面的描述和隨附的附圖中給出的教導，這些公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將會想到本文所述公開內(nèi)容的許多修改形式和其他實施例。因此，應當了解，這些公開內(nèi)容不限于所公開的特定實施例，并旨在將修改形式和其他實施例包括在本文末尾所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。雖然本文中采用特定術(shù)語，但所述術(shù)語僅在一般性和描述性意義上使用而并非用于限制目的。
[0092]除非另外指明，否則本發(fā)明的實施將采用植物學、微生物學、組織培養(yǎng)、分子生物學、化學、生物化學和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)處于本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)。
[0093]單位、前綴和符號可以它們SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5’到3’的方向從左向右書寫；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左向右書寫。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文中可通過它們通常知道的三字母符號表示或通過IUPAC-1UB生化命名委員會(IUPAC-1UB B1chemical Nomenclature Commiss1n)推薦的單字母符號表示。同樣，核苷酸可通過它們通常接受的單字母密碼表示。下面定義的術(shù)語通過參考本說明書整體進行更完整的定義。
[0094]在描述本發(fā)明時，將采用下面的術(shù)語，并采用下文所示的定義。
[0095]所謂“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，諸如真菌、酵母、細菌、放線菌、藻類和原生動物以及其他單細胞結(jié)構(gòu)。
[0096]所謂“擴增”意指構(gòu)建核酸序列的多個拷貝或與該核酸序列互補的多個拷貝，該構(gòu)建是利用所述核酸序列中的至少一者作為模板進行。擴增系統(tǒng)包括聚合酶鏈式反應(PCR)系統(tǒng)、連接酶鏈式反應(LCR)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴增(安大略省米西索加市加拿大基因公司(Cangene, Mississauga, Ontar1))、Q-β復制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(TAS)和鏈置換擴增(SDA) ο 參見例如 Diagnostic Molecular Microb1logy !Principles andApplicat1ns，Persing，et al.,eds.,American Society for Microb1logy,Washington,DC(1993)(《診斷分子微生物學:原理和應用》，Persing等人編輯，美國微生物學會，華盛頓特區(qū)，1993年)。擴增的產(chǎn)物稱為擴增子。
[0097]術(shù)語“保守修飾的變體”同時適用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修飾的變體指編碼氨基酸序列的相同的或保守修飾的變體的那些核酸。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU全部編碼丙氨酸這種氨基酸。因而，在每個由密碼子規(guī)定丙氨酸的位置，可將該密碼子變更為所描述的相應密碼子的任一種而不會改變所編碼的多肽。這種核酸變異為“沉默變異”，代表保守修飾變異的一種。編碼多肽的本文每種核酸序列還描述了該核酸的每種可能的沉默變異。普通技術(shù)人員將認識到，核酸中的每個密碼子(除了 AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；一個例外是微球菌Micrococcus rubens,對于它來說GTG是甲硫氨酸密碼子(Ishizuka, et al., (1993) J.Gen.Microb1l.139:425-32 (Ishizuka 等人，1993 年，《普通微生物學雜志》，第139卷，第425-432頁))可進行修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼本發(fā)明多肽的核酸的每種隱匿的變異均隱含在每種所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。
[0098]至于氨基酸序列，技術(shù)人員會認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白序列的各個單獨置換、缺失或添加(其使被編碼的序列中的單個氨基酸或一小部分氨基酸變更、添加或缺失)在該變更導致氨基酸被化學上相似的氨基酸置換時，為“保守修飾變體”。因而，還可變更選自I至15的整數(shù)的任何數(shù)目的氨基酸殘基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10個變更。保守修飾的變體通常提供與它們所源自的未經(jīng)修飾的多肽序列類似的生物活性。例如，對于其天然底物而言，底物特異性、酶活性或配體/受體結(jié)合通常為天然蛋白質(zhì)的至少30%、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，優(yōu)選60-90 %。提供功能上相似的氨基酸的保守置換表是本領(lǐng)域所熟知的。
[0099]下面的六個組各含有對彼此而言是保守置換的氨基酸:
[0100]I)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；
[0101]2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0102]3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0103]4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；
[0104]5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和
[0105]6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
[0106]還可參見Creighton, Proteins, W.H.Freeman and C0.(1984) (Creighton,《蛋白質(zhì)》，ff.H.Freeman 公司，1984 年)。
[0107]如本文所用，“基本上由...組成”意指在如下情況下目標多核苷酸或多肽可包括額外的序列:額外的序列不會嚴重影響受權(quán)利要求保護的多核苷酸或多肽序列的基本功倉泛。
[0108]術(shù)語“構(gòu)建體”用來主要指多核苷酸序列的人工組合，即在自然界中不會發(fā)生的、通常包含一個或多個調(diào)節(jié)元件和一個或多個編碼序列的組合。該術(shù)語可包括指表達盒和/或載體序列，視上下文而定。
[0109]“對照”或“對照植物”或“對照植物細胞”提供度量其中已針對目的基因?qū)崿F(xiàn)了遺傳變更(諸如轉(zhuǎn)化)的受試植物或植物細胞的表型變化的參考點。受試植物或植物細胞可從作了如此變更的植物或細胞遺傳而來，且會包含該變更。
[0110]對照植物或植物細胞可例如包括:(a)野生型植物或細胞，即具有與用于進行遺傳變更的起始材料相同的基因型的植物或細胞，該遺傳變更會得到受試植物或細胞；(b)具有與起始材料相同的基因型但已用無效構(gòu)建體(即，用對目的性狀不具有已知效果的構(gòu)建體，諸如包含標記基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞；(c)為受試植物或植物細胞的子代中的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細胞；(d)在遺傳上與受試植物或植物細胞相同但不暴露于會引起目的基因的表達的條件或刺激因素的植物或植物細胞；或者(e)處于目的基因不被表達的條件下的受試植物或植物細胞本身。對照植物還可以是用另選的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。
[0111]就指定的核酸而言，所謂“編碼”意指包含翻譯成指定蛋白質(zhì)的信息。編碼蛋白質(zhì)的核酸可以包含在該核酸的翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如內(nèi)含子)或可以缺少這種居間的非翻譯序列(例如，如在CDNA中)。據(jù)以編碼蛋白質(zhì)的信息是通過使用密碼子來確定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遺傳密碼來編碼。然而，可使用諸如在某些植物、動物和真菌線粒體、細菌山羊支原體(Mycoplasma capricolum) (Yamao, et al., (1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:2306-9 (Yamao等人，1985年，《美國國家科學院院刊》，第82卷，第2306-2309頁))，或纖毛蟲大核(ciliate Macronucleus)中存在的通用密碼的變體，當用這些生物體表達該核酸時。
[0112]當通過合成法制備或改變核酸時，可利用將在其中表達核酸的預期宿主的已知密碼子偏好性。例如，盡管本發(fā)明的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種中都可表達，但可對序列進行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量偏好性，因為這些偏好性已被證實不同(Murray, et al., (1989)Nucleic Acids Res.17:477-98 (Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498頁)，將其以引用的方式并入本文)。因而，具體氨基酸的玉蜀黍優(yōu)選密碼子可由來自玉蜀黍的已知基因序列得出。關(guān)于來自玉蜀黍植物的28種基因的玉蜀黍密碼子使用在Murray等人(出處同上)的表4中列出。
[0113]如本文所用，術(shù)語“內(nèi)源”在參考基因使用時意指通常存在于指定生物體的細胞的基因組中并且以其常態(tài)存在于細胞中(即，以其通常存在于自然中的狀態(tài)存在于基因組中)的基因。
[0114]術(shù)語“外源”在本文中是指被引入細胞的任何材料。術(shù)語“外源核酸分子”或“轉(zhuǎn)基因”是指通常不存在于細胞基因組中或被引入細胞中的任何核酸分子。此類外源核酸分子通常為使用如本文所公開的重組DNA方法或者本領(lǐng)域中已知的其他方式生成的重組核酸分子。在各種實施例中，如本文所公開的轉(zhuǎn)基因非人類生物體可包含，例如，第一轉(zhuǎn)基因和第二轉(zhuǎn)基因。此類第一和第二轉(zhuǎn)基因可引入到細胞中，例如，轉(zhuǎn)基因生物體的祖細胞，作為單獨核酸分子或作為單個單元(例如，分別包含在不同載體或包含在單個載體中)。在任一種情況下，可確定待從中得到轉(zhuǎn)基因生物體的細胞包含使用常規(guī)和已知方法諸如標記基因的表達或核酸雜交或PCR分析的兩種轉(zhuǎn)基因。作為另外一種選擇或除此之外，轉(zhuǎn)基因存在的確定可較晚進行，例如，在植物由推定的轉(zhuǎn)化細胞再生后進行。
[0115]如本文所用，針對核酸的“異源”為起源于外來物種的核酸，或者，如果起源于相同物種的話，則為通過蓄意的人為干預對其天然形式在組成和/或基因組基因座方面進行了實質(zhì)性修飾的核酸。例如，可操作地連接至異源結(jié)構(gòu)基因的啟動子是來自不同于衍生該結(jié)構(gòu)基因的物種的物種，或者如果是來自相同的物種，則對一者或二者由其初始形式進行了實質(zhì)性的修飾。異源蛋白質(zhì)可起源于外來物種，或者，如果起源于相同物種，則通過蓄意的人為干預對其天然形式進行了實質(zhì)修飾。
[0116]所謂“宿主細胞”意指包含本發(fā)明的異源核酸序列、含有載體并能支持該表達載體的復制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞諸如大腸桿菌(E.coli),或真核細胞諸如酵母、昆蟲、植物、兩棲動物或哺乳動物細胞。優(yōu)選地，宿主細胞是單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、水稻、棉花、卡諾拉油菜、大麥、小米和番茄。特別優(yōu)選的單子葉宿主細胞是玉蜀黍宿主細胞。
[0117]術(shù)語“雜交復合體”包括指由兩條相互選擇性雜交的單鏈核酸序列形成的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)。
[0118]在將核酸插入細胞的語境中，術(shù)語“引入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導”，包括指將核酸并入真核或原核細胞中，其中該核酸可并入細胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化成自主復制子或瞬時表達(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0119]術(shù)語“分離的”指諸如核酸或蛋白質(zhì)之類的物質(zhì)，該物質(zhì)實質(zhì)上或基本上不含在其天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的通常與其相伴隨或與其相互作用的組分。術(shù)語“非天然存在的”、“突變的”、“重組的”、“重組表達的”、“異源的”或“異源表達的”為不存在于其天然存在環(huán)境中的代表性生物材料。
[0120]結(jié)合植物，“系”是遺傳上相同的植物的集合并且涵蓋產(chǎn)生此類植物的種子。自交系通常在大多數(shù)或所有基因座為純合的。
[0121] 術(shù)語“NUE核酸”意指包含編碼完全長度或部分長度多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
[0122]如本文所用，“核酸”包括指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否則涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質(zhì)的已知類似物:其以與天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式雜交至單鏈核酸。
[0123]所謂“核酸文庫”意指分離的DNA或RNA分子的集合，其包含且實質(zhì)上代表指定生物體的基因組的整個被轉(zhuǎn)錄的部分。示例性核酸文庫諸如基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建，在諸如以下的標準分子生物學參考文獻中有教導:Berger and Kimmel，(1987) Guide ToMolecular Cloning Techniques, from the series Methods in Enzymology, vol.152,Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger 和 Kimmel, 1987 年，《分子克隆技術(shù)指南》，來自《酶學方法》系列第152卷,學術(shù)出版社,加州圣地亞哥)；Sambrook, et al., (1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., vols.1-3 (Sambrook等人，1989年，《分子克隆實驗指南》，第 2 版,第 1-3 卷)；以及 Current Protocols in Molecular B1logy,Ausubel,et al.,eds,Current Protocols,a joint venture between Greene PublishingAssociates, Inc.and John Wiley & Sons, Inc.(1994Supplement)(《最新分子生物學實驗方法匯編》，Ausubel等人編輯，選自《實驗室指南》，格林出版聯(lián)合公司與約翰威立父子出版公司的合資公司(1994年增刊))。
[0124]本文所用的“可操作地連接”包括指第一序列(諸如啟動子)和第二序列之間的功能連接，其中該啟動子序列引發(fā)和介導對應于該第二序列的DNA的轉(zhuǎn)錄。一般來講，可操作地連接意指被連接的核酸序列是連續(xù)的，并且如果有必要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的話，是連續(xù)的且在相同的閱讀框內(nèi)。
[0125]如本文所用，術(shù)語“植物”包括指整個植株、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子和植物細胞和它們的子代。如本文所用，植物細胞包括但不限于存在于植物組織中或與植物組織分離的細胞，包括種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子。可用于本發(fā)明方法的植物種類通常與適用于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物種類一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括以下屬的種:南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、胡桃屬(Juglans)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜猜屬(Medicago)、驢食草屬(Onobrychis)、三葉草屬(Trifolium)、胡蘆巴屬(Trigonella)、豆工豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬( Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛爺屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番爺屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、爺屬(爺屬)、碧冬爺屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、馬珠草屬(Majorana)、菊苣屬(Ciahorium)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、萱草屬(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵屬(Pelargonium)、黍?qū)?Panieum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千里光屬(Senec1)、蛾蝶花屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)、布洛華麗屬(Browaalia)、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(Oryza)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、蔥屬(Allium)和小麥屬(Triticum)。特別優(yōu)選的植物是玉米(Zea mays)。
[0126]本文所用的“產(chǎn)量”可包括指收獲時每英畝谷類作物的蒲式耳數(shù)，該值針對谷粒水分(例如，對于玉蜀黍通常是15%)進行了調(diào)整，和/或所產(chǎn)生的生物量的體積(對于草料作物諸如苜蓿而言，以及復種作物的植株根尺寸)。谷粒水分是在收獲時的谷粒中測量。谷粒的經(jīng)調(diào)整的測試重量確定為針對收獲時的谷粒水分水平進行了調(diào)整的重量，單位磅/蒲式耳。生物量測量為所產(chǎn)生的可收獲植物材料的重量。
[0127]如本文所用，“多核苷酸”包括指脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或它們的類似物，所述類似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性質(zhì):在嚴格雜交條件下其所雜交的核苷酸序列與天然存在的核苷酸所雜交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻譯成與天然存在的核苷酸所翻譯的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因的全長序列或其亞序列。除非另外指明，否則該術(shù)語可包括指指定的序列及其互補序列。
[0128]術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0129]本文所用的“啟動子”包括指DNA的在轉(zhuǎn)錄起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)的識別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。“植物啟動子”是能夠引發(fā)在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子。示例性的植物啟動子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細胞中表達的基因的細菌(諸如農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)或根瘤菌屬(Rhizobium))獲得的那些啟動子。例子為優(yōu)先起始在某些組織，例如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導管、管胞或厚壁組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動子。這種啟動子被稱為“組織優(yōu)選的”。“細胞類型”特異性啟動子主要驅(qū)動在一個或多個器官中某些細胞類型中的表達，例如根或葉中的維管細胞。“誘導型”或“調(diào)控型”啟動子是處于環(huán)境控制下的啟動子。可實現(xiàn)通過誘導型啟動子進行的轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實例包括無氧條件或光的存在。另一類型的啟動子是發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子，例如在花粉發(fā)育過程中驅(qū)動表達的啟動子。組織優(yōu)選的、細胞類型特異性的、發(fā)育調(diào)節(jié)的和誘導型的啟動子是“非組成型”啟動子類別的成員。“組成型”啟動子為在發(fā)育或細胞分化的大多數(shù)環(huán)境條件和狀態(tài)下，在植物的基本上所有組織中都有活性的啟動子。
[0130]術(shù)語“多肽”指一條或多條氨基酸序列。該術(shù)語還包括其片段、變體、同源物、等位基因或前體(例如原前蛋白或前蛋白)。“NUE蛋白質(zhì)”包含多肽。除非另有規(guī)定，否則術(shù)語“NUE核酸”意指包含編碼多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
[0131]如本文所用，“重組的”包括指已通過引入異源核酸進行修飾的細胞或載體，或者源于經(jīng)這樣修飾過的細胞的細胞。因而，例如，重組細胞表達不以天然(非重組)形式的細胞內(nèi)的相同形式存在的基因，或因為有意人為干預而表達原本異常表達、表達不足或根本不表達的天然基因，或可具有減低的或消除的天然基因表達。本文所用的術(shù)語“重組的”不涵蓋通過天然發(fā)生的事件(例如自發(fā)突變、天然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導/轉(zhuǎn)座)進行的細胞或載體的變更，所述事件為例如在沒有蓄意人為干預的情況下發(fā)生的那些。
[0132]本文所用的“重組表達盒”是具有一系列規(guī)定核酸元件的通過重組法或合成法產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其允許特定核酸在靶細胞中轉(zhuǎn)錄。可將重組表達盒摻入到質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了別的序列以外，表達載體的重組表達盒部分還包含待轉(zhuǎn)錄的核酸和啟動子。
[0133]術(shù)語“選擇性雜交”包括指在嚴格雜交條件下核酸序列與指定的核酸靶序列雜交的程度比其與非靶序列雜交的程度可檢測地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。選擇性雜交的序列通常相互具有約至少40 %的序列同一性，優(yōu)選60-90 %的序列同一'I"生，最優(yōu)選10%的序列同一'I"生(即互補性)。
[0134]術(shù)語“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”包括指探針與其靶序列雜交的程度將比它與其他序列雜交的程度可檢測地更高(例如，至少2倍于背景)的條件。嚴格條件是序列依賴性的，并且將在不同環(huán)境下不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑒別與探針可最高達100%互補的靶序列(同源探測)。或者，可以調(diào)節(jié)嚴格性條件以允許序列中的一些錯配，從而檢測到較低程度的相似性(異源探測)。優(yōu)選地，探針長為大約500個核苷酸，但長度可變化很大，從小于500個核苷酸到等于靶序列的整個長度。
[0135]通常，嚴格條件將為其中鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，pH為7.0至8.3，對短探針(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少30°C，對長探針(例如超過50個核苷酸)而言溫度為至少約60°C的那些條件。嚴格條件還可通過添加去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺或Denhardt’ s來實現(xiàn)。示例性的低嚴格性條件包括在37°C下用30至35%甲酰胺、IM NaCl、I % SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，并在50至55°C下在IX至2X SSC(20X SSC = 3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴格性條件包括37°C下在40至45%甲酰胺、IM NaClU% SDS中雜交，并在55至60°C下在0.5X至IX SSC中洗滌。示例性的高嚴格條件包括在50%甲酰胺、IM NaCl,1% SDS中于37°C下雜交，并在0.1X SSC中于60-65°C下洗滌。特異性通常決定于雜交后的洗滌，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，Tm可根據(jù) Meinkoth and Wahl, (1984), Anal.B1chem., 138:267-84(Meinkoth 和 Wahl, 1984 年，《分析生物化學》，第138卷，第267-284頁):的方程Tm = 81.5°C +16.6 (log Μ) +0.41(%GC) -0.61(% form)-500/L估計；其中M為單價陽離子的摩爾濃度，％ GC為DNA中鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為雜交體的長度(單位為堿基對)。TmS 50%的互補靶標序列與完美匹配的探針雜交時的溫度(在確定的離子強度和PH下)。每1%的錯配，Tm降低約1°C ;因此，可調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件以雜交至所需同一性的序列。例如，如果尋求具有> 90%同一性的序列，則Tm可降低10°C。通常，將嚴格條件選擇為比特定序列及其互補序列在確定的離子強度和pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。然而，極端嚴格條件可以采用比熱解鏈溫度(Tm)低1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；適度嚴格條件可以采用比熱解鏈溫度(Tm)低6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可以采用比熱解鏈溫度(Tm)低11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌；利用該公式，雜交和洗滌組成以及所需的Tm，普通技術(shù)人員將認識到，雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯配程度導致^低于45°C (水溶液)或32 °C (甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC濃度以使得可使用較高的溫度。有關(guān)核酸的雜交的詳盡指南見于以下文獻:Tijssen, Laboratory Techniques in B1chemistryand Molecular B1logy-Hybridizat1n with Nucleic Acid Probes,part I,chapter 2,“Overview of principles of hybridizat1n and the strategy of nucleic acid probeassays, ”Elsevier, New York (1993) (Ti jssen,《生物化學和分子生物學實驗室技術(shù)_核酸探針雜交》，第I部分，第2章，“核酸探針測定法的雜交原理和策略概覽”，Elsevier出版社，紐約，1993 年)；以及 Current Protocols in Molecular B1logy, chapter 2, Ausubel,et al., eds, Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1995)(《最新分子生物學實驗方法匯編》，第2章，Ausubel等人編輯，格林出版公司與約翰威立出版公司，紐約，1995年)。除非另外指明，否則在本專利申請中，高嚴格性定義為在65°C下在4X SSC、5X Denhardt’ s (500ml水中的5gFicoll, 5g聚乙烯吡咯燒酮、5g牛血清白蛋白)、0.lmg/ml煮沸鮭精DNA和25mM磷酸鈉中雜交，并在65°C下在0.1X SSC、0.1% SDS中洗滌。
[0136]本文所用的“轉(zhuǎn)基因植物”包括指在其基因組中包含異源多核苷酸的植物。一般來講，異源多核苷酸穩(wěn)定地整合在基因組內(nèi)使得該多核苷酸得以傳遞到連續(xù)世代。異源多核苷酸可單獨整合進基因組中，或者作為重組表達盒的一部分整合進基因組中。“轉(zhuǎn)基因”在本文中用來包括任何其基因型已因異源核酸的存在而被變更的細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初如此變更的轉(zhuǎn)基因以及那些通過從最初的轉(zhuǎn)基因進行有性雜交或無性繁殖而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)的改變。
[0137]如本文所用，“載體”包括指用于轉(zhuǎn)染宿主細胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。載體常常是復制子。表達載體允許插入其中的核酸轉(zhuǎn)錄。
[0138]以下術(shù)語用于說明兩個或更多個核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系:(a) “參考序列”、(b) “比較窗口”、(c) “序列同一性”、(d) “序列同一性百分數(shù)”和(e) “基本上全同”。
[0139]如本文所用，“參考序列”是用作序列比較基準的確定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全長cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
[0140]如本文所用，“比較窗口”意指包括指多核苷酸序列的連續(xù)和指定的區(qū)段，其中該多核苷酸序列可與參考序列進行比較，并且其中該比較窗口中的該多核苷酸序列部分相比于參考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便兩個多核苷酸的最佳比對。通常，比較窗口長度為至少20個連續(xù)的核苷酸，任選可為30、40、50、100個或更長。本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，為避免由于在多核苷酸序列中納入空位所致的與參考序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。
[0141]將核苷酸和氨基酸序列進行比對以作比較的方法是本領(lǐng)域公知的。局部同源性算法(BESTFIT)(Smith and Waterman,(1981)Adv.Appl.Math2:482 (Smith 和 Waterman,1981年，《應用數(shù)學進展》，第2卷，第482頁))可以對用于比較的序列進行最佳比對；Needlemanand ffunsch, (1970) J.Mol.B1l.48:443-53 (Needleman 和 ffunsch, 1970 年，《分子生物學雜志》，第48卷，第443-453頁)的同源性比對算法(GAP);相似性搜索方法(Tfasta和Fasta)(Pearson and Lipman, (1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444 (Pearson 和 Lipman,1988年，《美國國家科學院院刊》，第85卷，第2444頁))；這些算法的計算機化實施包括，但不限于:Intelligenetics (加州山景城(Mountain View, California))的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software Package 第 8 版(可得自 Genetics Computer
Group ( GCG'(程序(Accelrys 公司(加州圣地亞哥(San Diego,CA)))中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA。CLUSTAL 程序由如下文獻詳細說明:Higginsh and Sharp, (1988)Gene73:237-44 (Higgins 和 Sharp, 1988 年，《基因》，第 73 卷，第 237-244 頁)；Higgins andSharp, (1989)CAB10S5:151-3 (Higgins和Sharp，1989年，《計算機在生物科學中的應用》，第 5 卷,第 151-153 頁)；Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res.16:10881-90 (Corpet等人，1988 年，《核酸研究》，第 16 卷，第 10881-10890 頁)；Huang, et al.，(1992) ComputerApplicat1ns in the B1sciences8:155-65 (Huang 等人，1992 年，《計算機在生物科學中的應用》，第 8 卷，第 I55-165 頁)以及 Pearson et al.，(1994)Meth.Mol.B1l.,24:307-31 (Pearson等人，1994年，《分子生物學方法》，第24第307-310頁)。用于多個序列的最佳全局比對的優(yōu)選程序是 PileUp (Feng and Doolittle, (1987) J.Mol.Evol., 25:351-60 (Feng和Doolittle, 1987年，《分子進化學雜志》，第25卷，第351-360頁)，其類似于 Higgins and Sharp, (1989) CAB10S5:151-53 (Higgins 和 Sharp, 1989 年，《計算機在生物科學中的應用》，第5卷，第151-153頁)中描述的方法，將文獻以引用的方式并入本文。可用于數(shù)據(jù)庫相似性搜索的BLAST家族程序包括:BLASTN，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列進行查詢；BLASTX，用于核苷酸查詢序列針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列進行查詢；BLASTP,用于蛋白質(zhì)查詢序列針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列進行查詢；TBLASTN，用于蛋白質(zhì)查詢序列針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列進行查詢；以及TBLASTX，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列進行查詢。參見Current Protocols in Molecular B1logy,Chapterl9,Ausubelet alGreene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1995)(《現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)》，第19章，Ausubel等人(編輯)，威利-英特科學出版公司，紐約，1995年)。
[0142]GAP利用Needleman和Wunsch(出處同上)的算法來尋找兩個完整序列的比對，該比對使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小。GAP考慮所有可能的比對和空位位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對。它允許提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分。GAP對于其插入的每個空位，必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分數(shù)。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對于每個插入的空位必須另外利用空位長度乘以空位延伸罰分。Wisconsin Genetics軟件包第10版中的默認空位產(chǎn)生罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。空位產(chǎn)生和空位延伸罰分可以以選自0-100的整數(shù)來表示。因而，例如，空位產(chǎn)生和空位延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50 或更大。
[0143]GAP給出具有最佳比對的家族中的一個成員。可能存在這個家族的許多成員，但其他成員沒有更好的品質(zhì)。GAP顯示用于比對的四個優(yōu)值因子:品質(zhì)、比率、同一性和相似性。品質(zhì)是為了比對序列而最大化的指標(metric)。比率是品質(zhì)除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同一性百分數(shù)是實際匹配的符號的百分數(shù)。相似性百分數(shù)是相似的符號的百分數(shù)。將對應于空位的符號忽略。當一對符號的評分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時，評定為相似性。威斯康星遺傳學軟件包版本10中所用的打分矩陣為BL0SUM62(參見Henikoff andHenikoff, (1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89: 10915 (Henikoff Henikoff, 1989 年，《美國國家科學院院刊》，第89卷，第10915頁))。
[0144]除非另外指明，否則本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默認參數(shù)獲得的值(Altschul, et al., (1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402 (Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402頁))。
[0145]如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解的,BLAST搜索假定蛋白質(zhì)可以隨機序列建模。然而，許多真實蛋白質(zhì)包含非隨機序列區(qū)，該非隨機序列可為同聚段、短周期重復或富含一種或多種氨基酸的區(qū)域。這種低復雜性區(qū)域可在不相關(guān)的蛋白質(zhì)之間比對，盡管該蛋白質(zhì)的其他區(qū)域完全不相似。可采用多種低復雜性過濾程序來減少這種低復雜性比對。例如，可單獨使用或聯(lián)合使用 SEG(Wooten and Federhen, (1993) Comput.Chem.17:149-63 (Wooten 和Federhen, 1993 年，《計算化學》，第 17 卷，第 149-163 頁))和 XNU(Claverie and States,(1993)Comput.Chem.17: 191-201 (Claverie 和 States, 1993 年，《計算化學》，第 17 卷，第191-201頁))低復雜性過濾程序。
[0146]在兩條多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指當在指定的比較窗口上進行比對以獲得最大對應時兩個序列中相同的殘基。當序列同一性百分數(shù)針對蛋白質(zhì)使用時，認識到不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基由具有相似化學性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基置換，因此不會改變分子的功能性質(zhì)。如果序列差別在于保守置換，則可上調(diào)百分比序列同一性以校正置換的保守性質(zhì)。差別在于這種保守置換的序列被說成具有“序列相似性”或“相似性”。作出這個調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換評定為部分錯配而不是完全錯配，從而增加序列同一性百分數(shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予I分，非保守置換給予O分,則保守置換給予O至I之間的分數(shù)。例如,根據(jù)Meyers and Miller, (1988)Computer Applic.B1l.Sc1.4:11-17 (Meyers 和 Miller, 1988 年，《計算機在生物科學中的應用》，第4卷，第11-17頁)的算法計算保守置換的分數(shù)，例如如在程序PC/GENE (美國加利福尼亞州山景城 Intelligenetics 公司(Intelligenetics, Mountain View, California,USA))中所實現(xiàn)的。
[0147]本文所用的“序列同一性百分數(shù)”意指通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便兩個序列的最佳比對。該百分數(shù)是這樣計算的:確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分數(shù)。
[0148]術(shù)語多核苷酸序列的“基本上相同”意指包含這樣的序列的多核苷酸，該序列與參考序列相比具有50-100%序列同一性，任選地至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性，所述比較是使用所描述的比對程序中的一種并采用標準參數(shù)進行的。技術(shù)人員將會認識到，可通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等等適當調(diào)整這些值以確定兩個核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相應同一性。用于這些目的的氨基酸序列的實質(zhì)同一'I"生通常意指55-100%之間的序列同一'丨生,諸如至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、最高至100%的同一性。
[0149]在肽的情形中術(shù)語“基本上相同”指肽包含在指定比較窗口上與參考序列具有55-100%之間的序列同一性，諸如與參考序列具有至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、最高至100%的序列同一性的序列。優(yōu)選地，利用Needleman和Wunsch(出處同上)的同源比對算法進行最佳比對。兩條肽序列是基本上相同的指示是，一種肽可與針對第二種肽產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應。因而，例如，如果某種肽與第二種肽差別僅在于保守置換的話，則這兩種肽實質(zhì)上相同。此外，當某種肽與第二種肽差別在于非保守變化時,如果抗體識別的表位實質(zhì)上相同，則它們實質(zhì)上相同。“基本上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的殘基位置差別可在于保守氨基酸變化。
[0150]表 1
[0151]

【權(quán)利要求】
1.一種包含多核苷酸序列的分離的核酸，所述多核苷酸序列編碼具有無功能的信號肽(SP)的多肽，其中所述無功能的信號肽無法加工并且其中所述核酸在植物中的表達賦予所述植物顯性表型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述具有無功能的信號肽的多肽保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述無功能的信號肽是由于氨基酸殘基在所述信號肽中或所述信號肽附近的一個或多個插入、缺失或置換而成為無功能的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸，其中所述具有所述無功能的信號肽的多肽相對于f目號妝切割位點在第 _10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1> +1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10位處具有一個或多個氨基酸插入、缺失或置換，其中所述信號肽切割位點位于第-1位和第+1位之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸包括SEQID N0.:13、15或152的所述無功能的信號肽編碼區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述無功能的信號肽由對應于SEQIDN0.:13的第1222-1332位的多核苷酸序列及其片段編碼。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述無功能的信號肽由對應于SEQIDN0.:15的第1-111位的多核苷酸序列及其片段編碼。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的分離的核酸，其中所述無功能的信號肽由對應于SEQIDN0.:152的第1-111位的多核苷酸序列及其片段編碼。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中核酸包括SEQID N0.:13、15或152的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述多肽包含SEQID NO: 14或153的無功能的信號肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述無功能的信號肽包含對應于SEQIDN0.:14的第1-37位的氨基酸序列及其片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述無功能的信號肽包含對應于SEQIDN0.:153的第1-37位的氨基酸序列及其片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述多肽包括SEQID NO:14或153的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述無功能的信號肽相對于所述信號肽切割位點在第-1位處具有蘇氨酸或纈氨酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述無功能的信號肽相對于所述信號肽切割位點在第+1位處具有脯氨酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述顯性表型為減少的雄性育性。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中植物為作物。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中植物為單子葉植物或雙子葉植物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述多肽為無穗絲(tlsl)突變體。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中編碼具有無功能的信號肽的多肽的所述多核苷酸可操作地連接至啟動子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的核酸，其中所述啟動子為誘導型啟動子、組成型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子、時間調(diào)節(jié)型啟動子或它們的元件。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的核酸，其中所述啟動子優(yōu)先地驅(qū)動在雄性生殖組織中的表達。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的核酸，其中所述啟動子為穗絲優(yōu)選的啟動子。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的核酸，其中所述啟動子選自:
a.SEQ ID NO:9或13的調(diào)控區(qū)；
b.SEQID NO:62和 64-106 ； c.SEQ ID NO:9或13的調(diào)控區(qū)的至少100個連續(xù)核苷酸； d.SEQ ID NO:62和64-106中任一個的至少100個連續(xù)核苷酸； e.與SEQID NO:9或13的調(diào)控區(qū)的全長具有至少70%序列同一性的序列；以及 f.與SEQID NO:62和64-106中任一個的全長具有至少70%序列同一性的序列。
25.一種具有無功能的信號肽的分離的多肽，其中所述無功能的信號肽無法加工并且其中所述多肽在植物中的表達賦予所述植物顯性表型。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中所述無功能信號肽是由于氨基酸殘基在所述信號肽中或所述信號肽附近的一個或多個插入、缺失或置換而成為無功能的。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的多肽，其中所述無功能的信號肽在所述信號肽中相對于信號妝切割位點在第 _10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10位處具有一個或多個氨基酸插入、缺失或置換，其中所述信號肽切割位點位于第-1位和第+1位之間。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO: 14或153的所述無功能信號肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中所述無功能的SP包括對應于SEQID N0.:14的第1-37位的氨基酸序列及其片段。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中所述無功能的SP包括對應于SEQID N0.:153的第1-37位的氨基酸序列及其片段。
31.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中所述多肽包括SEQID NO: 14或153的序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中所述無功能的信號肽相對于所述信號肽切割位點在第-1位處具有蘇氨酸或纈氨酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中所述無功能的信號肽相對于所述信號肽切割位點在第+1位處具有脯氨酸。
34.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中所述顯性表型為減少的雄性育性。
35.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中植物為作物。
36.根據(jù)權(quán)利要求25所述的多肽，其中植物為單子葉植物或雙子葉植物。
37.一種表達根據(jù)權(quán)利要求25-33中任一項所述的多肽的細胞。
38.一種表達根據(jù)權(quán)利要求25-33中任一項所述的多肽的植物，其中所述植物具有相對于對照增加的產(chǎn)量。
39.一種表達根據(jù)權(quán)利要求25-33中任一項所述的多肽的植物，其中所述植物具有相對于對照減少的雄性育性。
40.一種將減少的雄性育性的顯性表型賦予植物的方法，包括在所述植物中表達根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項所述的核酸，從而將所述減少的雄性育性的顯性表型賦予所述植物。
41.一種將減少的雄性育性的顯性表型賦予植物的方法，包括在所述植物中表達根據(jù)權(quán)利要求25-36中任一項所述的多肽，從而將所述減少的雄性育性的顯性表型賦予所述植物。
42.一種將多肽保留到植物細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的方法，包括在所述植物細胞中表達根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項所述的核酸，從而將多肽保留到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
43.一種將顯性表型賦予植物的方法，包括在所述植物中表達根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項所述的核酸，從而將顯性表型賦予所述植物。
44.一種將顯性表型賦予植物的方法,包括在所述植物中表達根據(jù)權(quán)利要求25-33中任一項所述的多肽，從而將所述顯性表型賦予所述植物。
45.一種包含可操作地連接到無功能的信號肽的蛋白質(zhì)的融合蛋白，其中所述無功能的信號肽未加工，并且其中所述蛋白質(zhì)在植物中的表達將顯性表型賦予所述植物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的融合蛋白，其中所述無功能的信號肽由根據(jù)權(quán)利要求1-24所述的核酸中的任一者編碼。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的融合蛋白，其中所述無功能的信號肽包含根據(jù)權(quán)利要求25-36所述的多肽中的任一者。
48.—種編碼根據(jù)權(quán)利要求45-47中任一項所述的融合蛋白的核酸。
49.一種表達根據(jù)權(quán)利要求45-47所述的融合蛋白中的任一者的植物，其中所述植物具有相對于對照減少的雄性育性和/或增加的產(chǎn)量。
50.一種將顯性表型賦予植物的方法，包括在所述植物中表達根據(jù)權(quán)利要求48所述的核酸。
51.—種分離的多核苷酸,所述多核苷酸包含選自以下的核酸: a.與SEQID NO:9、13、15或152的核酸的全長至少90%相同的核酸； b.與SEQID NO:9、13、15或152的核酸的全長至少95%相同的核酸；
c.編碼與SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、.119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 的多肽的全長至少 90%相同的多肽的核酸；
d.編碼與SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、.119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 的多肽的全長至少 95%相同的多肽的核酸；
e.SEQ ID NO:9、13、15 或 152 的核酸； f.與SEQID NO:9、13、15或152的核酸的全長至少90%相同的核酸，并且當與SEQ IDNO:10比對時，所述核酸在對應于SEQ ID NO:10的第37位氨基酸的位置處編碼丙氨酸或甘氨酸之外的氨基酸 ； g.與SEQID NO:9、13、15或152的核酸的全長至少90%相同，并且當將所述核酸與SEQ ID NO:10比對時，在對應于SEQ ID NO: 10的第37位氨基酸的位置處編碼蘇氨酸或纈氨酸的氨基酸的核酸；以及h.a、b、C、d、e、f或g的任一個核酸的互補核酸。
52.一種表達盒，所述表達盒包含可操作地連接至啟動子的根據(jù)權(quán)利要求51所述的多核苷酸。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的表達盒，其中所述啟動子為組成型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子或誘導型啟動子。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的表達盒，其中所述組織優(yōu)選的啟動子優(yōu)先地驅(qū)動在雄性生殖組織中的表達。
55.根據(jù)權(quán)利要求51所述的表達盒，其中所述啟動子為從玉蜀黍、小麥或水稻分離的MS45啟動子或5126啟動子或MS44啟動子。
56.—種植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求52-55中任一項所述的表達盒。
57.一種植物細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求52-55中任一項所述的表達盒。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的植物的種子，其中所述種子包含所述表達盒。
59.根據(jù)權(quán)利要求56所述的植物，其中所述植物是玉蜀黍。
60.一種分離的多肽，所述多肽包含選自以下的氨基酸序列:
a.包含SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或 130 的氨基酸序列；
b.與SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130的多肽的全長至少90%相同的氨基酸序列；
c.與SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120 、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130的多肽的全長至少95%相同的氨基酸序列；
d.包含由SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 編碼的成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列；
e.與由SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 編碼的所述成熟蛋白質(zhì)的全長至少90%相同的氨基酸序列；以及
f.一種與由 SEQ ID NO:10、14、153、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129 或 130 編碼的所述成熟蛋白質(zhì)的全長至少95%相同的氨基酸序列。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的分離的多肽，其中所述對應于SEQID NO:10的第37位的氨基酸為蘇氨酸或纈氨酸。
62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的分離的多肽，其中所述對應于SEQID NO:10的第37位的氨基酸不是丙氨酸或甘氨酸。
63.一種用于繁殖對于賦予顯性雄性不育的核基因或構(gòu)建體為純合的植物的轉(zhuǎn)基因保持系，其中所述轉(zhuǎn)基因保持系對于賦予顯性雄性不育的所述核基因或構(gòu)建體為純合的，并且其中所述轉(zhuǎn)基因保持系對于SAM構(gòu)建體為純合的，其中所述SAM構(gòu)建體包括抑制所述顯性雄性不育基因或構(gòu)建體的元件、破壞花粉功能的第二元件以及任選地為標記的第三元件，其中由所述轉(zhuǎn)基因保持系產(chǎn)生的功能性花粉不含所述SAM構(gòu)建體。
64.一種用于形成轉(zhuǎn)基因保持系以用于繁殖對于賦予顯性雄性不育的核基因或構(gòu)建體為純合的植物的方法，所述方法包括: a.用SAM構(gòu)建體轉(zhuǎn)化對于所述核基因或構(gòu)建體為雜合的植物，其中所述SAM構(gòu)建體包括: .1.抑制所述顯性雄性不育基因或構(gòu)建體的元件， ?.破壞花粉功能的第二元件， ii1.以及任選地為標記的第三元件； b.對所述轉(zhuǎn)化的植物自花授粉以產(chǎn)生種子； c.選擇對于所述顯性雄性不育基因為純合的并且包含所述SAM構(gòu)建體的那些種子；以及 d.種植所述選擇的種子以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因保持系。
65.一種用于形成對于賦予顯性雄性不育的核基因或構(gòu)建體為純合的植物的雄性不育系的方法，所述方法包括: a.對根據(jù)權(quán)利要求63所述的轉(zhuǎn)基因保持系自花授粉；以及 b.對部分a中產(chǎn)生的所述種子、或由其生長而來的植物基因分型，以選擇對于賦予顯性雄性不育的所述基因或構(gòu)建體為純合的并且不含根據(jù)權(quán)利要求63所述的SAM構(gòu)建體的那些種子或植物； 其中所述選擇的種子或植物包括所述雄性不育系。
66.一種用于增加對于賦予顯性雄性不育的核基因為純合的植物的雄性不育系的方法，所述方法包括: a.栽培根據(jù)權(quán)利要求65所述的選擇的種子或植物，以產(chǎn)生雄性不育植物； b.用根據(jù)權(quán)利要求63所述的轉(zhuǎn)基因保持系對所述雄性不育植物授粉；以及 c.從所述雄性不育植物收獲種子 其中所述收獲的種子對于賦予顯性雄性不育的所述核基因或構(gòu)建體為純合的。
67.一種用于形成對于賦予顯性雄性不育的核基因或構(gòu)建體為雜合的雜交植物的方法，所述方法包括: a.種植根據(jù)權(quán)利要求66所述的收獲的種子以栽培雄性不育植物，其中所述植物為雄性不育自交系； b.用為雄性可育的第二自交系對所述雄性不育自交系植物授粉； c.從所述雄性不育自交系植物收獲雜交種子； d.種植所述收獲的種子以產(chǎn)生對于賦予顯性雄性不育的所述基因或構(gòu)建體為雜合的雜交植物。
68.通過根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法的步驟a至c產(chǎn)生的雜交種子。
69.—種用于產(chǎn)生雄性不育雜交種子的方法,所述方法包括 a.用基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化對于顯性雄性不育為雜合的雄性不育系，所述基因構(gòu)建體包括: . 1.抑制所述顯性雄性不育的元件； ?.破壞花粉功能的第二元件； ii1.任選的為標記的第三元件；并且在所述自交系中表達所述元件以使得所述植物雄性可育； b.對所述雄性可育植物自花授粉； C.產(chǎn)生顯性雄性不育的純合子代； d.鑒別具有所述純合顯性雄性不育基因型并且包含所述構(gòu)建體作為所述保持系的那些種子； e.鑒別具有所述純合顯性雄性不育基因型并且不含所述構(gòu)建體作為所述顯性雄性不育自交系的那些種子； f.用所述保持系的花粉對所述雄性不育自交系授粉以增加所述顯性雄性不育自交系; g.用第二自交系的花粉對所述雄性不育自交系授粉，以產(chǎn)生對于顯性雄性不育為雜合的雄性不育雜交種子。
70.根據(jù)權(quán)利要求64或權(quán)利要求69所述的方法，其中抑制所述顯性雄性不育的所述元件選自涉及賦予顯性雄性不育的所述核基因或構(gòu)建體的反義分子、RNAi分子和發(fā)夾分子。
71.根據(jù)權(quán)利要求63所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中抑制所述顯性雄性不育的所述元件選自涉及賦予雄性不育的所述核基因或構(gòu)建體的反義分子、RNAi分子和發(fā)夾分子。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中所述抑制元件為靶向驅(qū)動賦予雄性不育的所述核基因的所述啟動子的啟動子反向重復。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中所述抑制元件為靶向所述MS44啟動子的啟動子反向重復。
74.根據(jù)權(quán)利要求63和71-73中任一項所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中破壞花粉功能的所述元件編碼干擾淀粉在花粉中的正常積聚或影響花粉內(nèi)的滲透平衡的蛋白質(zhì)。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中破壞花粉功能的所述元件編碼α-淀粉酶、淀粉酶或脫支酶。
76.根據(jù)權(quán)利要求63和71-73中任一項所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中破壞花粉功能的所述元件選自表達對雄性配子具有細胞毒性的產(chǎn)物或以其他方式抑制雄性配子發(fā)育的基因。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中破壞花粉功能的所述元件為DAM-甲基化酶、芽孢桿菌RNA酶或鏈霉抗生物素蛋白。
78.根據(jù)權(quán)利要求63和71-77中任一項所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中所述SAM構(gòu)建體包括在種子組織中表達的標記。
79.根據(jù)權(quán)利要求63和71-78中任一項所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中所述標記在胚乳、糊粉或果皮組織中表達。
80.根據(jù)權(quán)利要求63和71-79中任一項所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中所述標記為熒光蛋白。
81.根據(jù)權(quán)利要求63和71-80中任一項所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中所述標記為紅色熒光蛋白。
82.—種在雄性不育雜交植物上產(chǎn)生谷粒的方法，所述方法包括 a.由通過根據(jù)權(quán)利要求68或69所述的方法產(chǎn)生的所述種子栽培雄性不育雜交植物； b.提供傳粉媒介植物以使所述雄性不育雜交植物受精； c.允許來自所述雄性可育植物的花粉對所述雄性不育雜交植物授粉；以及d.從所述雄性不育雜交植物收獲谷粒。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，還包括: a.使將要生長成傳粉媒介植物的種子與根據(jù)權(quán)利要求68或69所述的方法產(chǎn)生的所述雜交種子混合； b.種植所述種子混合物； c.允許來自所述雄性可育植物的花粉對所述雄性不育雜交植物授粉；以及 d.從所述雄性不育植物收獲谷粒。
84.根據(jù)權(quán)利要求64、65、66、67、69、82或83中任一項所述的方法，其中所述植物為玉蜀黍植物。
85.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述方法在環(huán)境脅迫條件下實施。
86.根據(jù)權(quán)利要求63和71-81中任一項所述的轉(zhuǎn)基因保持系，其中賦予顯性雄性不育的所述核基因或構(gòu)建體選自: a.包含多核苷酸序列的分離的核酸，所述多核苷酸序列編碼包含無功能的信號肽的多肽，其中所述核酸在植物中的表達賦予所述植物顯性雄性不育表型； b.SEQ ID NO:13U5或152的分離的核酸； c.芽孢桿菌RNA酶、鏈霉抗生物素蛋白、DAM、MS41或MS42。
87.育種的植物對，包括:第一植物和第二植物，其中所述第一植物表達包含多核苷酸序列的外源核酸分子，所述多核苷酸序列編碼具有無功能信號肽序列的多肽，其中所述外源核酸分子的表達將雄性不育的顯性表型賦予所述第一植物，使得所述第一植物為雄性不育的，以及(b)第二植物，其中所述第二植物包括包含多核苷酸的可表達外源核酸分子，所述多核苷酸在表達時抑制所述第一植物的編碼具有無功能信號肽序列的多肽的多核苷酸序列的表達或可操作地連接到編碼具有無功能信號肽的多肽的多核苷酸序列的啟動子的表達。
88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的植物對，其中在所述第一植物中，編碼具有無功能信號肽序列的多肽的多核苷酸序列可操作地連接至啟動子。
89.根據(jù)權(quán)利要求88所述的植物對，其中所述啟動子為誘導型啟動子、組成型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子、時間調(diào)節(jié)型啟動子或它們的元件。
90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的植物對，其中所述啟動子優(yōu)先地驅(qū)動在雄性生殖組織中的表達。
91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的植物對，其中所述雄性生殖組織優(yōu)選的啟動子為所述MS45啟動子、MS26啟動子、MS22啟動子或5126啟動子。
92.根據(jù)權(quán)利要求88所述的植物對，其中所述啟動子選自:
g.SEQ ID NO:62 和 64-106，以及 SEQ ID NO:9 和 13 的調(diào)控區(qū)； h.SEQ ID NO:9、13、62和64-106的至少100個連續(xù)核苷酸；以及 1.與SEQID NO:9、13、62和64-106的全長具有至少70%序列同一性的序列。
93.根據(jù)權(quán)利要求87所述的植物對，其中所述第二植物中的外源核酸分子抑制所述第一植物中的MS44突變基因的多核苷酸序列的表達。
94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的植物對，其中所述第一植物中的所述MS44突變基因選自SEQ ID NO:13,15 和 152。
95.根據(jù)權(quán)利要求87所述的植物對，其中所述第二植物中的所述外源核酸分子為靶向驅(qū)動MS44多核苷酸的表達的啟動子的發(fā)夾抑制元件，所述MS44多核苷酸編碼具有所述第一植物中的無功能SP的多肽。
96.育種的植物對，包括:第一植物和第二植物，其中所述第一植物表達包含多核苷酸序列的外源核酸分子，所述多核苷酸序列編碼融合到無功能SP的多肽，其中所述外源核酸分子的表達將雄性不育的顯性表型賦予所述第一植物，使得所述第一植物為雄性不育的，以及(b)第二植物，其中所述第二植物包括包含多核苷酸的可表達外源核酸分子，所述多核苷酸在表達時抑制包括編碼融合到無功能SP的多肽的多核苷酸序列的核酸分子的表達或抑制可操作地連接到包括編碼融合到所述第一植物的無功能SP的多肽的多核苷酸序列的核酸分子的啟動子的表達。
97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的植物對，其中在所述第一植物中，編碼融合到所述無功能的信號肽的多肽的多核苷酸可操作地連接到誘導型啟動子、組成型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子、時間調(diào)節(jié)型啟動子或它們的元件。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的植物對，其中所述組織優(yōu)選的啟動子為MS45、MS26、MS22或 5126。
99.根據(jù)權(quán)利要求96所述的植物對，其中所述第二植物中的所述外源核酸分子抑制所述第一植物中的MS44突變基因的多核苷酸序列的表達。
100.根據(jù)權(quán)利要求99所述的植物對，其中所述第一植物中的所述MS44突變基因選自SEQ ID NO:13,15 和 152。
101.一種減少由谷粒生產(chǎn)田地中的作物物種產(chǎn)生的花粉的方法，所述方法包括在所述田地中種植雄性育性表型的共混物，其中所述植物的大多數(shù)為雄性不育的，其中用于所述田地的總花粉流少于用于其中所述植物的大多數(shù)為雄性可育的田地的總花粉流。
102.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述雄性不育植物為雜交體。
103.根據(jù)權(quán)利要求101或102所述的方法，其中所述雄性不育由顯性基因或構(gòu)建體賦予。
104.根據(jù)權(quán)利要求103所述的方法，其中所述顯性雄性不育基因為MS44的等位基因。
105.根據(jù)權(quán)利要求101-104中任一項所述的方法，其中所述作物物種為玉蜀黍或高
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106.根據(jù)權(quán)利要求101-105中任一項所述的方法，其中相對于其中所述植物的大多數(shù)為雄性可育的田地，與雜草型物種的遠交減少。
107.一種用于降低作物物種的產(chǎn)物中轉(zhuǎn)基因的偶然存在的風險的方法，其中所述方法包括使所述轉(zhuǎn)基因保持在所述作物的雄性不育系中。
108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因存在于所述作物物種的雄性不育雜交體中。
109.根據(jù)權(quán)利要求107或108所述的方法，其中所述產(chǎn)物為谷粒。
110.根據(jù)權(quán)利要求107-109中任一項所述的方法，其中所述作物物種為玉蜀黍或高粱或向日葵。
111.根據(jù)權(quán)利要求107-109中任一項所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因連接到賦予顯性雄性不育的基因或構(gòu)建體。
112.根據(jù)權(quán)利要求111所述的方法，其中所述賦予顯性雄性不育的基因為MS44的等位基因。
113.根據(jù)權(quán)利要求111或112所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼改善纖維素的消化性的酶 。
【文檔編號】C12N15/82GK104169296SQ201380014363
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月13日
【發(fā)明者】M.C.阿爾伯森, T.W.福克斯, A.L.倫納德, 李柏林, B.R.羅夫蘭, M.特林內(nèi)爾 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司