專利名稱：人體唾液保存固定液及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及到一種人體唾液保存固定液的配方、 制備及應用。
背景技術：
在分子生物學科研中，血樣中的DNA提取在基因工程和分子生物學研究中占有重要地位。通常用于PCR反應和其他分子測試的DNA主要從抗凝血中提取，但保存時間較長的血樣，即使添加枸櫞酸鈉或EDTA抗凝劑，也會形成血塊，給提取帶來不便。同時，由于采集血液對人體能造成一定的創傷而且需要一定的專業技能才能完成，限制了血液作為DNA 來源的廣泛應用。人體唾液中含有口腔黏膜脫落細胞，收集唾液作為DNA樣本來源有以下優點① 無穿刺、無傷害取樣，避免了采血的痛苦和取尿的尷尬；②一些人群并不適合采血，如小孩、 老人。另一些人群則抗拒取血，如某些精神疾病患者，患者的親屬；③簡便易行，唾液收集只需離心管④廉價、高效，不需要配備注射器、消毒用具，也不用培訓專業的抽血人員.節省了大量人力物力；即使經過2周的室溫存放，依然能提取出完整的基因組DNA。當大范圍收集樣本時，唾液樣本適合在各地區的實驗室和收集點之間傳遞。人體的唾液中99%是水，有機物主要是唾液淀粉酶、粘多糖、粘蛋白及溶菌酶等， 無機物有鈉、鉀、鈣、氯等離子，同時還含有多種細菌、口腔脫落細胞等。因此，如何避免唾液腐敗、保持脫落細胞內基因組DNA完整，對唾液作為基因組DNA來源的應用至關重要。

發明內容
本發明的目的是提供一種人體唾液保存固定液及其制備及應用。本發明的人體唾液保存固定液包括如下組分蔗糖、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、 MgCl 2、異硫氰酸胍及水。以質量體積濃度計，蔗糖為 0. 05mol/L 0. 5mol/L，MgCl2 為 0. 5mmol/L 20mmol/ L，pH 為 7 10 的 Tris-HCl 為 lmmol/L 30mmol/L，異硫氰酸胍為 0. 5mol/L 10mol/L。較佳的，以質量體積濃度計，蔗糖為0. lmol/L 0. 4mol/L, MgCl2為mol/L 15mmol/L, pH 為 7 10 的 Tris-HCl 為 3m mol/L 20m mol/L，異硫氰酸胍為 lmol/L 6mol/L。優選的，以質量體積濃度計，蔗糖為0. 2mol/L 0. 4mol/L, MgCl2為mol/L 10mmol/L, pH 為 7 9 的 Tris-HCl 為 5m mol/L 15m mol/L,異硫氰酸胍為 2mol/L 5mol/L。最佳的，蔗糖為0. 25mol/L 0. 35mol/L, MgCl2 為 3m mol/L 8m mol/L, pH 為 7 8. 5 的 Tris-HCl 為 8m mol/L 12m mol/L，異硫氰酸胍為 2. 5mol/L 3. 5mol/L。本發明人體唾液保存固定液的配制方法包括下列步驟(1)分別配制Tris-HCl緩沖液、蔗糖、MgCl2及異硫氰酸胍的水溶液并滅菌；
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(2)無菌條件下，將經步驟1獲得溶液與無菌水一起按比例混合配制獲得人體唾液保存固定液。本發明的人體唾液保存固定液可用于保存人體唾液。該固定液能夠殺滅唾液中含有的細菌、抑制核酶的活性，保存基因組DNA的完整性。保存及基因組DNA抽提實驗結果表明，本發明的唾液固定液具有很好的保存作用，其保存效果明顯優于使用單一組分保存唾液，且成本較低，配制方便，有望成為唾液作為基因組DNA來源的廣泛應用所必需的較佳固定液。


圖1實施例1抽提的唾液基因組DNA電泳圖1為基因組DNA圖2實施例2固定液固定后放置于不同溫度、不同時間的唾液樣本基因組DNA抽提瓊脂糖凝膠電泳圖1為4°C放置2周2為25°C放置2周3為37 °C放置2周4為37°C放置1個月圖3實施例3固定液處理后提取的唾液基因組DNA經PCR擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖條帶為擴增片段DNA圖4實施例4不同成分的固定液固定后的唾液樣本基因組DNA抽提瓊脂糖凝膠電泳圖固定液1無異硫氰酸胍；固定液2中無Mgcl2 ；固定液3中無Tris ；固定液4中無蔗糖圖5實施例5不同成分對提取唾液基因組DNA的因素效應6實施例5固定液處理后提取的唾液基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖編號1-9分別對應實驗方案中的實驗編號。
具體實施例方式以下列舉具體實施例以進一步闡述本發明，應理解，實例并非用于限制本發明的保護范圍。實施例1固定液固定后唾液基因組DNA抽提人體唾液保存固定液的配方為0. 25mol/L蔗糖，8m mol/L Tris-HCl (pH為8)，3m mol/L MgCl2, 2. 5mol/L 異硫氰酸胍。人體唾液保存固定液的配制方法(1)先配制 IM 蔗糖，IM MgCl2,6M 異硫氰酸胍，IM Tris-HCl (pH 為 8. 0)和 dd H2O, 分別經1. lkgf/cm2滅菌20分鐘；(2)以配制IOOml固定液為例，按下述比例混合各種試劑即可IM 蔗糖25mlIM Tris-Hcl (pH 為 8) 0. 8mlIM MgCl20. 3ml6M異硫氰酸胍41.7ml
dd H2O32. 2ml合計IOOml實驗步驟(1)取500ul唾液樣本(含等體積固定液和唾液，已于一定溫度下放置一定時間)；(2)將 500ul 混合液放入 1. 5ml 離心管，12000g/5min ；(3)棄上清液，用漩渦振蕩器振蕩片刻；(4)加入 500ul 提取液(KCl、Tris、MgC12、白明膠和 NP40)和 6ul 10mg/ml 的蛋白酶K;(5)將混合液放置于60°C水浴箱，保溫Ih ；(6)加入等體積氯仿，振蕩混勻，于12000g/10min離心，取上清液于1. 5ml離心管內；(7)加5M Nacl 6ul于上清液中，使其終濃度達到0. 1M，再加等體積的異丙醇，混勻后于-20°C冷凍Ih ；(8)離心15000g/15min，可見DNA沉淀，加入70%的酒精清洗DNA ；(9)離心l5000g/10min，棄上清夜；(10)加入TE SOul溶解DNA，4°C冰箱保存待用，如長期保存放置于_20°C ；(11)準備的瓊脂糖凝膠，含溴化乙錠(EB)20ul/100ml凝膠液中；(12)在錫紙上將點樣緩沖液和DNA溶液混勻；(13)分別將樣品加入準備好的凝膠電泳場電泳，電泳緩沖液為TBE ；(14)30min后取凝膠在凝膠成像系統中分析，觀察DNA條帶，如圖1。結果說明如圖1顯示，用該固定液提取人類唾液基因組DNA效率高，分子量大， DNA完整。實施例2固定液固定后放置于不同溫度、不同時間的唾液樣本基因組DNA抽提人體唾液保存固定液的配方同實施例1人體唾液保存固定液的配制方法同實施例1實驗步驟同實施例1，結果如圖2。如圖2顯示1號為固定液固定人類唾液后，放置室溫(25°C ) 7天后提取基因組 DNA ；2號為固定液固定人類唾液后，放置37°C 7天后提取基因組DNA;3號為固定液固定人類唾液后，放置-20°C冰箱7天后提取基因組DNA ；4號為固定液固定人類唾液后，放置4°C冰箱7天后提取基因組DNA.由圖中結果表明該固定液對人類唾液樣本DNA保存具有明顯效果，無論是不同溫度下(37°C，25°C，4°C，-20°C )還是不同天數均具有有效的提取效果。實施例3固定液固定后室溫下放置一個月后的唾液樣本基因組DNA抽提及PCR擴增人體唾液保存固定液的配方同實施例1人體唾液保存固定液的配制方法同實施例1。實驗步驟
1.抽提方法同實施例1 ；2. PCR擴增條件1)95 "C 3min2)94°C 30s3) 50°C 30s4) 72°C 30s5)72°〇延伸5111土116)4°C 冷卻。步驟2)至步驟4)循環35次實驗結果如圖3:圖3為采用本唾液固定液提取5個不同來源樣本基因組DNA，經上述PCR擴增后均有明顯產物，表明該固定液固定人類唾液所提取的基因組DNA適合進行PCR實驗。(圖 3 是 L印tin 基因的 PCR 產物，引物分別為 5，-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3， 和5 ‘-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3，)實施例4不同成分的固定液固定后的唾液樣本基因組DNA抽提人體唾液保存固定液的配方為(1) 0. 25mol/L 蔗糖，8m mol/L Tris-Hcl (pH 為 8)，3m mol/L MgCl2 ；(2) 0. 25mol/L 蔗糖，8m mol/L Tris-Hcl (pH 為 8)，2. 5mol/L 異硫氰酸胍；(3) 0. 25mol/L 蔗糖，3m mol/L MgCl2, 2. 5mol/L 異硫氰酸胍；(4) 8m mol/L Tris-Hcl (pH 為 8)，3m mol/L MgCl2, 2. 5mol/L 異硫氰酸胍。人體唾液保存固定液的配制方法同實施例1按上述配方中試劑內容進行配制。實驗步驟唾液用四種不同成分的固定液固定后，基因組DNA抽提實驗步驟同實施例1。實驗結果如圖4 圖4結果表明固定液中四種成分缺少任何一種將導致唾液基因組DNA抽提效果變差。實施例5不同配比的固定液固定后的唾液樣本基因組DNA抽提實驗步驟對固定液做四因素、三水平正交實驗設計，抽提方法同實施例1，實驗方案如下
權利要求
1.一種人體唾液保存固定液，包括如下組分蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、異硫氰酸胍及水。
2.如權利要求1所述人體唾液保存固定液，其特征在于，所述人體唾液保存固定液中， 以質量體積濃度計，蔗糖為 0. 05mol/L 0. 5mol/L, MgCl2 為 0. 5m mol/L 20m mol/L, pH 為 7 10 的 Tris-HCl 為 Im mol/L 30m mol/L，異硫氰酸胍為 0. 5mol/L 10mol/L。
3.如權利要求2所述人體唾液保存固定液，其特征在于，所述人體唾液保存固定液中， 以質量體積濃度計，蔗糖為0. lmol/L 0. 4mol/L, MgCl2為2m mol/L 15m mol/L, pH為 7 10 的 Tris-HCl 為 3m mol/L 20m mol/L，異硫氰酸胍為 lmol/L 6mol/L。
4.如權利要求3所述人體唾液保存固定液，其特征在于，所述人體唾液保存固定液中， 以質量體積濃度計，蔗糖為0. 2mol/L 0. 4mol/L, MgCl2為2m mol/L 10m mol/L, pH為 7 9 的 Tris-HCl 為 5m mol/L 15m mol/L，異硫氰酸胍為 2mol/L 5mol/L。
5.如權利要求4所述人體唾液保存固定液，其特征在于，所述人體唾液保存固定液中， 以質量體積濃度計，蔗糖為0. 25mol/L 0. 35mol/L,MgCl2為3m mol/L 8m mol/L, pH為 7 8. 5 的 Tris-HCl 為 8m mol/L 12m mol/L，異硫氰酸胍為 2. 5mol/L 3. 5mol/L。
6.如權利要求1-5任一權利要求所述人體唾液保存固定液的制備方法，包括下列步驟(1)分別配制Tris-HCl緩沖液、蔗糖、MgCl2及異硫氰酸胍的水溶液并滅菌；(2)無菌條件下，將經步驟1獲得溶液與無菌水一起按比例混合配制獲得人體唾液保存固定液。
7.如權利要求1-5任一權利要求所述人體唾液保存固定液用于保存人體唾液。
全文摘要
本發明涉及人體唾液保存固定液及其制備與應用，本發明的人體唾液保存固定液包括如下組分蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、異硫氰酸胍及水。本發明的唾液固定液具有很好的保存作用，其保存效果明顯優于使用單一組分保存唾液，且成本較低，配制方便，有望成為唾液作為基因組DNA來源的廣泛應用所必需的較佳固定液。
文檔編號A01N1/02GK102440234SQ20101029921
公開日2012年5月9日 申請日期2010年9月30日 優先權日2010年9月30日
發明者孫長勝, 張健, 張天亮, 彭麗娟, 江三多, 魏寧, 鮑曉妮 申請人:上海泛亞生命科技有限公司