專利名稱：一種人體唾液保存用組合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種唾液樣本保存液，具體涉及一種人體唾液保存用組合物及其制備方法，適用于遺傳分析與檢測、醫(yī)學檢驗等領域。
背景技術：
基于核酸擴增的分子技術已日益用于法醫(yī)、軍事、人類醫(yī)藥以及科學研究等方面。如在法醫(yī)鑒定方面，通過提取家屬的DNA以進行核酸擴增可對死者的身份進行辨認；在人類健康方面，通過對檢測者的血液、其他體液或細胞中的DNA進行檢測，并進行核酸擴增，收集其相關基因信息后，分析其所含有的各種基因情況，使人們了解自己的基因信息，預知身體患病的風險，從而通過改善自己的生活環(huán)境，養(yǎng)成良好生活習慣等方式，避免或延緩疾病的發(fā)生。一般用于提取基因組DNA的體液通常來自靜脈血液中的白細胞，但使用血液作為檢測來源具有很多缺點。首先，血液的采集需要經過訓練的專業(yè)人員操作，其次，血液采集是侵入性方式，經常給供試者帶來一定程度的不適和疼痛，此外，血液采集過程還需要避免一些血源性病原體造成的感染。而與其相比，唾液作為一種人體較易獲得的體液，采集更為方便。唾液是主要由唾液腺分泌的透明無色液體。人體的唾液99%是水，有機物主要是唾液淀粉酶、粘多糖、粘蛋白及溶菌酶等，無機物有鈉、鉀、鈣、氯等離子。純凈的唾液并不含有人體DNA，而由于口腔上皮細胞處于不斷地新陳代謝與新老更替過程中，每時每刻都存在細胞脫落，因此，通過采集唾液可以得到細胞DNA。唾液的采集相比于血液，具體有如下明顯的優(yōu)勢1，無刺痛，無傷害取樣，避免了采血對供試者造成不必要的痛苦；2，廉價高效，采集人員不需要經過專業(yè)訓練，也節(jié)省了注射器和抗凝管等耗材的費用；3，操作簡便，唾液收集只需要供試者將唾液收集于唾液采集器即可；4，適用范圍廣，一些人群不適合采血，例如老人和小孩等，另外一些人群則抗拒采血，如暈血和精神疾病的患者。5，運輸方便，若要大范圍，長距離的采集運輸樣本，唾液顯然更適合在實驗室與各個收集地之間傳遞。但是，一旦采集后，樣本必須迅速進行DNA抽提，否則口腔內的微生物容易對DNA進行降解。因此，如將唾液能夠較好地保存起來，對于唾液作為基因組DNA的來源應用于基因檢測中將具有至關重要的作用。專利申請?zhí)?01010299215，名稱為人體唾液保存固定液及其制備和應用的專利公開了一種唾液保存液，但其中涉及的MgCl2組分屬于核酸酶的激活劑，不利于DNA的穩(wěn)定性保存。而異硫氰酸胍雖屬于變性裂解試劑，可以抑制核酸酶的活性，但會破壞細胞，使DNA處于游離狀態(tài)，容易造成DNA的斷裂損傷。而用于基因檢測的DNA首先應保證純度和完整性，如果DNA發(fā)生斷裂等損傷，則勢必會直接影響到PCR等后續(xù)試驗，進而影響分析結果的準確性；另外唾液保存液作為唾液DNA的保存介質，也存在被氧化和微生物污染的風險。微生物會將DNA作為其營養(yǎng)材料，更甚者，這些微生物還可能分泌出促進DNA加速降解的酶，破壞DNA的完整性，同時唾液被微生物污染后，也很容易導致由此提取的DNA不純，而最終導致DNA的完整性和純度不能得到保證，進而導致后續(xù)試驗的可信度大大降低。綜上，唾液中所含的DNA量較少，很容易受到破壞。研究開發(fā)一種保存效果好、保存方便的人體唾液樣本保存用保存液具有十分重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種人體唾液保存用組合物及其制備方法。為實現(xiàn)上述技術問題，本發(fā)明采取的技術方案為
一種人體唾液保存用組合物，其組分和含量如下pH為6-8. 5的Tris-HCl 5-20mmol/L ；EDTA O. 5-2mmol/L ；NaOAc 2. 5-3. 5mol/L ;蔗糖 0. 1-0. 4mol/L ；N-乙酰基 ~5~ 甲氧 基色胺l-3mmol/L ;對輕基苯甲酸丙酯l_4mg/mL ;重氮燒基咪唑脲l_3mg/mL ;蛋白酶ΚΙΟμ g/mL,體系 pH 7. 5-8. 5。上述人體唾液保存用組合物的制備方法，具體包括以下步驟
(1)分別配制EDTA、PH為6-8.5的Tris-HCl緩沖液、蔗糖的儲存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的無水乙醇儲存液，121°C滅菌30min后，室溫保存；
(2)在無菌條件下，根據(jù)預配制的人體唾液保存用組合物的總體積，結合體系中各組分的含量要求，選用相應體積的EDTA、PH6-8. 5的Tris-HCl緩沖液、蔗糖的儲存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的無水乙醇儲存液混合，并加入相應量的NaOAc、對羥基苯甲酸丙酯、重氮烷基咪唑脲和蛋白酶K后，補加無菌水至所預設定配制的人體唾液保存用組合物的總體積，得到體系PH滿足要求的人體唾液保存用組合物。按上述方案，步驟(2 )中的體系pH值在需要時可通過加入調節(jié)劑進行調節(jié)。其中調節(jié)劑的加入量很少，對體系中各組分濃度的影響可忽略不計。本發(fā)明人體唾液保存用組合物的具體使用過程為將該用于保存人體唾液樣本的組合物與人體唾液I: I混合后，于設定溫度保存，優(yōu)選為4°c。本發(fā)明中提供的人體唾液保存用組合物中引入的EDTA組分可以螯合唾液中自身含有的Mg、Ga等二價陽離子，抑制核酸酶的活性，保證DNA不被降解；引入的蛋白酶K可以有效降解蛋白質，消化核酸酶，進一步避免核酸酶解；引入的醋酸鈉可以沉淀部分裂解細胞釋放出的DNA，防止懸浮斷裂，同時可以提供保證DNA穩(wěn)定的弱堿性環(huán)境；更主要地是其引入的N-乙酰基-5-甲氧基色胺作為迄今發(fā)現(xiàn)的最強的內源性自由基清除劑，很容易進入細胞而擔任起保護細胞核DNA、防止其抗氧化而發(fā)生斷裂的任務，且其作用溫和，用量少，效果好；另外，同時引入的對羥基苯甲酸丙酯，相比于其他酸性防腐劑，特別適宜于在該人體唾液保存用組合物構成的弱堿性保護環(huán)境(PH7. 5-8. 5)中發(fā)揮作用，而達到較好地抑制微生物細胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性以及破壞微生物的細胞膜結構，使其細胞內的蛋白質變性，以此抑制微生物菌落的生長，同時也不會破壞DNA，而便于唾液樣本的保存，且將其與重氮烷基咪唑脲復配使用，能構成極其良好的廣譜抗菌體系，有效抑菌殺菌，更好地防止微生物的污染，除此在該組合物中引入蔗糖，還可以起到增加體系粘度，維持適當?shù)臐B透壓達到防止DNA受機械力損傷的作用。綜上，本發(fā)明通過引入上述特定組分，按設定配比配合使用，達到了使人體唾液樣本中的DNA即不會被體系內固有酶如核酸酶等或受外界污染后的微生物分泌產生的酶進行酶解，或氧化而導致DNA鏈不完整，甚至被污染而導致的DNA純度差的問題，同時也能維持唾液樣本處于適宜的條件包括pH，體系粘度等而使唾液樣本DNA能穩(wěn)定存在，達到較好保存唾液樣本的目的。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的人體唾液保存用組合物用于保存人體唾液樣本，可以抑制核酸酶活性，并避免其受到外界微生物的污染或自身氧化，而保證基因組DNA的完整性和純度，保存時間長，適用保存溫度廣，能夠保證唾液樣本在各采集地之間運輸過程中的穩(wěn)定性，適用于基因檢測及相關科學研究。相關唾液保存及基因組DNA抽提檢測試驗表明，本發(fā)明的人體唾液保存用組合物在室溫條件下可以穩(wěn)定保存唾液樣本4個月以上；在高溫(40°C)條件下，可以穩(wěn)定保存唾液樣本7d以上；且在有溫差條件上，也可以穩(wěn)定保存唾液樣本7d以上。


圖I為從用實施例I制備的人體唾液保存用組合物于室溫保存不同時間后的唾液樣本中抽提的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中
M λDNA/HindIII Marker
1:室溫放置7d
2:室溫放置14d
3:室溫放置I個月
4:室溫放置2個月
5:室溫放置3個月 6:室溫放置4個月；
圖2為從用實施例I制備的人體唾液保存用組合物于不同溫度條件下保存7d后的唾液樣本中抽提的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中
MλDNA/HindIII Marker
1:4°C放置 7d，
2:溫變條件下放置7d
3:40°C放置 7d ；
圖3為從用實施例I制備的人體唾液保存用組合物于室溫保存4個月，_20°C，存在溫變條件下和40°C保存7d后的唾液樣本中抽提的基因組DNA為模板，PCR擴增β -actin基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中
MDL2000 Marker
1:室溫放置4個月
2:-20 O 放置 7d
3:有溫變條件下放置7d
4:40°C放置 7d ；
圖4為從用實施例I制備的人體唾液保存用組合物于室溫保存4個月，存在溫變條件下和保存7d后的唾液樣本中抽提的基因組DNA為模板，PCR擴增16Sr DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖，并相應以PCR擴增β-actin基因片段作為對照，圖中
I:室溫放置4個月，擴增16Sr DNA片段2:溫變條件下放置7d，擴增16Sr DNA片段 M DL2000 Marker
3:室溫放置4個月，擴增β -actin基因片段
4:溫變條件下放置7d，擴增β -actin基因片段；
圖5為從用實施例1-3制備的人體唾液保存用組合物于？保存？后的唾液樣本中抽提的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中
M λDNA/HindIII Marker
1:實施例I制備的人體唾液保存用組合物保存的唾液樣品； 2:實施例2制備的人體唾液保存用組合物保存的唾液樣品；
3:實施例3制備的人體唾液保存用組合物保存的唾液樣品。
具體實施例方式以下列舉的具體實施例，僅為進一步闡述本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明的實施方法與應用范圍。實施例I
人體唾液保存用組合物，其組分和含量為EDTA lmmol/L ； Tris-HCl (pH為8)10mmol /I,;鹿糖 O. 3mol/L ； NaOAc 3mol/L ； N-乙酸基 _5_ 甲氧基色胺 2mmo1 /I,;對輕基苯甲酸丙酯3mg/mL ;重氮燒基咪唑脲2mg/mL;蛋白酶K 10 μ g/mL,體系pH值8。制備方法如下
(1)分別配制EDTA、TriS-HCl緩沖液(pH為8)、蔗糖的儲存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的無水乙醇儲存液，得到lOmmol/L的EDTA水溶液，O. lmol/L的Tris-HCl緩沖液，3mol/L的蔗糖水溶液，20mmol/L的N-乙酰基-5-甲氧基色胺的無水乙醇溶液，121°C滅菌30min后，室溫保存；
(2)在無菌條件下，根據(jù)各組分終含量，將步驟(I)制得的各組分儲存液與無菌水按比例混合
IOmmo I/L 的 EDTA 水溶液 IOml
O.lmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液 IOml
3mol/L的鹿糖水溶液IOml
20mmol/L的N-乙酰基-5-甲氧基色胺IOml
配制得到各組分含量符合規(guī)定濃度的混合液，最后加入NaOAc 24. 6g，對羥基苯甲酸丙酯0. 3g,重氮燒基咪唑脲0. 2g,蛋白酶K Img,使其終濃度分別為3mol/L, lmg/mL, 2mg/mL和10 μ g/mL,加入無菌水并攪拌使其充分溶解,后補加無菌水至總體積為IOOmL,得人體唾
液保存用組合物，室溫放置。上述人體唾液保存用組合物的保存效果試驗
在收集唾液樣本前30分鐘受試者需清潔口腔(建議刷牙)，并保持口腔潔凈，清潔口腔后請勿進食、吸煙、嚼口香糖。開始收集唾液之前，放松臉頰，并用手指輕輕按摩臉頰15 30秒以產生唾液。向唾液采集管中輕輕吐入唾液，盡量避免出現(xiàn)過多的泡沫。收集得到2mL唾液即收集管中唾液與上層泡沫之間的分層界面在收集管的2mL刻度線處，然后與2mL實施例I的人體唾液保存用組合物渦旋混合后，根據(jù)下述保存條件進行保存，備用。
(I)用人體唾液保存用組合物保存的唾液樣本在室溫放置不同時間后的穩(wěn)定性檢測
將上述用人體唾液保存用組合物保存的唾液樣本分別于室溫下放置7天、14天、I個月、2個月、3個月、4個月后，利用“天根”公司的唾液基因組DNA抽提試劑盒抽提得到各唾液樣本基因組DNA，分別編號為1-6，備用。瓊脂糖凝膠電泳
取上述各唾液樣本DNA 3 μ L加樣于1%瓊脂糖凝膠，用λ DNA/HindIII Marker作標記，電泳。電泳后，用SYBR Green I將瓊脂糖凝I父染色后，在285nm透照下，使用凝I父成像系統(tǒng)拍照，具體見圖I。濃度和純度檢測 另將上述各唾液樣本DNA取2μ L，用NanoDrop Lite檢測其濃度和純度，具體見表I。
表I室溫放置不同時間的唾液樣本DNA檢測
釋苯編號 I濃度(ng/yL) |Aa6(1/Aa8(1 ~93~1.92
2~87~1.89
~89~1.94
~95~1.92
~921.90
6~丨88|l. 95
總結
如圖I和表I所示，該唾液樣本室溫放置7天直至4個月，DNA沒有發(fā)生氧化斷鏈，其DNA均是穩(wěn)定的，而且基因組DNA完整性良好，沒有出現(xiàn)斷裂片段。(2)用人體唾液保存用組合物保存的唾液樣本在不同溫度條件下的穩(wěn)定性檢測 將上述用人體唾液保存用組合物保存的唾液樣本分別放置于_20°C、高溫(40°C)以及
存在溫變條件下(溫變溫度為_20°C、室溫和40°C )保存7天，后利用“天根”公司的唾液基因組DNA抽提試劑盒抽提得到于不同溫度下保存的各唾液樣品基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳和DNA的濃度、純度檢測同上，結果分別見圖2和表2。表2-不同溫度放置7d的唾液樣本DNA檢測_
釋苯編號 I濃度(ng/yL) |Aa6(1/Aa8(1 ~87~1.92
F921.88
~丨84|l. 89
總結
如圖2和表2所示，該唾液樣本與在_20°C、高溫(40°C )、以及存在溫變條件下放置7天后,其DNA均是穩(wěn)定的。另，將從上述于-20°C、高溫(40°C )以及變溫條件下及室溫下保存7天的唾液樣本中抽提得到的各唾液樣本DNA做模板，擴增β -actin基因的337bp片段。引物如下
primer-F 5’ -TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’primer-R 5’ -CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
PCR 擴增程序如下95 °C 5min ；94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 40s，循環(huán) 35 次；72 °CIOmin ;4°C冷卻。
結果見圖3。總結
如圖3所示，于不同溫度及存在溫變條件下保存的唾液樣本中抽提的DNA均能穩(wěn)定擴增出明顯條帶，且與預期片段大小一致，說明該唾液樣本于_20°C、高溫(40°C )以及存在變溫條件下和室溫下保存后，從中所抽提的基因組DNA均適用于PCR實驗，表明DNA保存完整，沒有斷裂。(3)用人體唾液保存用組合物保存的唾液樣本室溫放置4個月，以及在有溫變條件下(溫變溫度為_20°C、室溫和40°C)放置7天后的樣本中提取的唾液DNA作為模版用于微生物16SrRNA擴增
擴增引物如下 primer-F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’primer-R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR 擴增程序如下95 °C 5min ；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 2min，循環(huán) 35 次；72 °CIOmin ;4°C冷卻。具體結果見圖4，并以上述同等條件保存的唾液樣本中抽提的DNA擴增β-actin基因的片段作為正對照。總結
如圖4所示，將用人體唾液保存用組合物保存的唾液樣本室溫放置4個月，以及在有溫變條件下放置7天后的唾液樣本中提取的唾液DNA作為模板用于微生物16SrRNA擴增，沒有明顯條帶產生，說明該唾液樣本用發(fā)明的唾液保存用組合物保存后沒有受到微生物的污染，抽提得到的DNA純度很高，適用于基因檢測實驗。實施例2
人體唾液保存用組合物，其組分和含量為EDTA O. 5mmol/L ；Tris-HCl (pH為6)5mmol/L ;鹿糖 O. 2mol/L ；NaOAc 2. 5mol/L ;N_ 乙酸基-5-甲氧基色胺 3mmol/L ;對輕基苯甲酸丙酯4mg/mL ;重氮燒基咪唑脲lmg/mL;蛋白酶K 10 μ g/mL,體系pH值7. 5。制備方法如下
(1)分別配制EDTA、Tris-HCl緩沖液(pH為6)、蔗糖的儲存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的無水乙醇儲存液，得到lOmmol/L的EDTA水溶液，O. lmol/L的Tris-HCl緩沖液，3mol/L的蔗糖水溶液，20mmol/L的N-乙酰基-5-甲氧基色胺的無水乙醇溶液，121°C滅菌30min后，室溫保存；
(2)在無菌條件下，根據(jù)預配制的人體唾液保存用組合物的總體積，結合體系中各組分的含量，選用相應體積的EDTA、PH6的Tris-HCl緩沖液、蔗糖的儲存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的無水乙醇儲存液混合，并加入相應量的NaOAc、對羥基苯甲酸丙酯、重氮烷基咪唑脲和蛋白酶K后，補加無菌水至近IOOmL,然后加入少量NaOH調節(jié)得到總體積IOOmU體系pH為7. 5的人體唾液保存用組合物。實施例3
人體唾液保存用組合物，其組分和含量為EDTA 2mmol/L ；Tris-HCl (pH為8. 5)20mmol/L ;鹿糖 0. 4mol/L ；NaOAc 3 mol/L ;N_ 乙酸基-5-甲氧基色胺 lmmol/L ;對輕基苯甲酸丙酯lmg/mL ;重氮燒基咪唑脲3mg/mL;蛋白酶K 10 μ g/mL,體系pH值8.5。
其配制方法參考實施例I進行。參考實施例1，將采用本實施例2-3制得的人體唾液保存用組合物保存的唾液樣本分別于室溫保存7天后，利用“天根”公司的唾液基因組DNA抽提試劑盒抽提得到保存后的各唾液樣品基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳和DNA的濃度、純度檢測同上，結果分別見圖5和表3。表3實施例1-3的人體唾液保存用組合物保存的唾液樣本DNA的檢測
權利要求
1.一種人體唾液保存用組合物，其組分和含量如下pH為6-8. 5的TriS-HCl5-20mmol/L ；EDTA O.5_2mmol/L ；NaOAc 2.5-3. 5mol/L;蔗糖 0.1-0. 4mol/L；N-乙酰基-5-甲氧基色胺l_3mmol/L ;對輕基苯甲酸丙酯l_4mg/mL ;重氮燒基咪唑脲l_3mg/mL ;蛋白酶 K 10 μ g/mL，體系 pH 7. 5-8. 5。
2.根據(jù)權利要求I所述的人體唾液保存用組合物的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟 Cl)分別配制EDTA、PH 6-8. 5的Tris-HCl緩沖液、蔗糖的儲存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的無水乙醇儲存液，121°C滅菌30min后，室溫保存； (2)在無菌條件下，根據(jù)預配制的人體唾液保存用組合物的總體積，結合體系中各組分的含量要求，選用相應體積的EDTA、PH6-8. 5的Tris-HCl緩沖液、蔗糖的儲存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的無水乙醇儲存液混合，并加入相應量的NaOAc、對羥基苯甲酸丙酯、重氮烷基咪唑脲和蛋白酶K后，補加無菌水至所預設定配制的人體唾液保存用組合物的總體積，得到體系PH滿足要求的人體唾液保存用組合物。
3.根據(jù)權利要求2所述的人體唾液保存用組合物的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的體系pH值在需要時可通過加入調節(jié)劑進行調節(jié)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人體唾液保存用組合物及其制備方法。其組分和含量如下pH為6-8.5的Tris-HCl5-20mmol/L；EDTA0.5-2mmol/L；NaOAc2.5-3.5mol/L；蔗糖0.1-0.4mol/L；N-乙酰基-5-甲氧基色胺1-3mmol/L；對羥基苯甲酸丙酯1-4mg/mL；重氮烷基咪唑脲1-3mg/mL；蛋白酶K10μg/mL，體系pH7.5-8.5。其用于保存人體唾液樣本可抑制核酸酶活性，并避免其受到外界微生物的污染或自身氧化，而保證基因組DNA完整性和純度，保存時間長，適用保存溫度廣，適用于基因檢測及相關科學研究。
文檔編號A01N1/02GK102919218SQ201210473690
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月21日 優(yōu)先權日2012年11月21日
發(fā)明者徐謀勝, 王寧, 王珊, 袁雅燕 申請人:湖北維達健基因技術有限公司