專利名稱：來源于轉基因植物的高致病性禽流感病毒蛋白疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種產生轉基因植物的方法、一種自所述轉基因植物產生抗原性禽流感病毒的血凝素蛋白的方法和針對禽流感病毒的疫苗組合物，所述轉基因植物可以高度有效的方式產生禽流感病毒的表面蛋白血凝素，所述血凝素蛋白可誘導針對禽流感病毒的免疫原性，所述疫苗組合物包含通過所述方法產生的血凝素蛋白。背景領域
禽流感病毒(AIV)為屬于正黏病毒的RNA病毒，其傳播非常迅速。已知致病性非常多樣化，從感染后無臨床癥狀到幾乎100%死亡率。所有禽流感病毒屬于A型并具有多種血清型根據病毒表面存在的血凝素基因和神經氨酸酶基因，將血凝素(HA)歸類為16個亞型，將神經氨酸酶(NA)歸類為9個亞型，這潛在地允許A型流感病毒的144種不同的組合。在A型流感病毒的這些不同亞型中，已知H5和H7亞型對鳥致病，已知H1、H2和H3亞型導致人流感。一般已知禽流感病毒并不感染除禽和豬物種之外的任何動物。但是，在1997年香港出現了感染禽流感病毒的患者并且已知H5N1禽流感病毒導致患者的出現，這確認了人被禽流感病毒感染的可能性。人感染被認為由高致病性病毒引起，所述高致病性病毒通過當禽流感病毒和人流感病毒同時感染人時在它們之間的遺傳組合而產生。此外，在韓國在2003年12月至2004年3月21日之間出現的高致病性禽流感H5N1的總共19例爆發，不僅影響了國內的家禽養殖產業，而且還因由對人感染的擔憂引起的消費者信心縮減所致，影響了相關第二產業，并且導致了非常巨大的經濟損失，包括1500億韓元的僅在用于根除高致病性禽流感的政府花費之中的直接花費，接著該爆發結束。近來，在泰國和越南也不斷出現H5N1感染的人病例并引起全世界的關注。但是，禽流感病毒具有如此多種血清型并且血清型相互之間有弱交叉免疫性或無交叉免疫性。因此，很難通過其它血清型來防止感染。因為禽流感病毒非常容易發生突變，故沒有防止禽流感的有效疫苗。目前，最有效的防止方法是用抗菌劑洗滌，并用滅活的流感病毒疫苗或重組的禽痘病毒疫苗進行的胃腸外疫苗接種。然而，此類方法僅在禽流感爆發并檢查病毒亞型后才使用。因此，對減少或防止禽流感的傳播有限。盡管全球已將大量資金投入到禽流感并加速各種治療劑和疫苗的開發，但尚未達到有效控制H5N1病毒的足夠的疫苗生產量。到2008年6月為止，已開發了三種H5N1疫苗，但仍在實驗階段，并且生產量非常小。因此，當需求急劇上升時例如大流行時，供給足量的這些疫苗的可能性非常小。具體而言，限制在于由于各種原因針對H5N1的疫苗的生產困難并且需要大量時間使其商業化。針對H5N1的大多數疫苗是通過代表性方法獲得的病毒疫苗，該方法中通常將病毒接種于雞蛋中，接著擴增。然后分離，然而，該方法有以下限制生產量小；應對需求的急劇上升例如大流行的能力有限；并且需要大量資金和時間安裝生產設備。因此，用雞蛋產生高致病性H5N1疫苗實際上是不可能的。預期的是，并非制自病毒而是制自蛋白抗原的疫苗可有效防止家禽飼養主的經濟損失并使家禽和牧場主免受致命病毒。因此，有利用蛋白抗原開發疫苗的需要。同時，近來已開發了利用植物和從植物中產生有用的生理活性物質的技術。從植物中有用的生理活性物質的生產具有以下優點可實質上減少生產的單位成本；可阻止自動物細胞或微生物合成的蛋白的分離和純化期間可產生的包括病毒、癌基因和腸毒素在內的污染源；當商業化生物活性物質時，有可能長期儲存種子，并且若植物容易栽培，則可以種子狀態全球傳播，并因此比應依賴冷藏和冷凍配送的蛋白更有利；并且若對生物活性物質的需求急劇上升，則大量生產設備所需的技術或成本絕對小于動物細胞系統，并且其可在最短時間內提供視大量需求而定的供應。由于植物具有真核蛋白合成途徑，即哺乳動物所必需的翻譯后修飾，因此植物能夠產生與哺乳動物中表達的那些蛋白類似的蛋白。因此，很多關注已放在來自轉基因植物的有用的生理活性物質的產生。然而，至今，自植物有效合成和產生有用的生物活性物質(例如醫學上有用的蛋白、疫苗和工業上有價值的酶)的技術還沒有變得非常成功。 本發明的公開內容摶術問是頁因此，本發明人已研究用植物的所述特性來開發針對禽流感特別是針對高致病性病毒H5N1的蛋白疫苗，并發現通過用包含H5N1病毒血凝素(HA)基因的用于植物轉化的重組載體轉化植物，可實現自轉基因植物的H5N1病毒的抗原性蛋白血凝素(HA)的大量生產。接著，本發明人開發了來源于植物的禽流感疫苗，其比傳統疫苗更經濟且更安全并且可用作易于給予的可食用疫苗，從而導致本發明的完成。因此，本發明的一個目標為提供制備產生血凝素(HA)的轉基因植物的方法，所述血凝素為H5N1病毒的抗原性蛋白。本發明的另一個目標為提供通過所述方法制備的轉基因植物，其中所述轉基因植物產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白。本發明的又一個目標是提供從本發明的轉基因植物中產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法。本發明的又一個目標是提供通過本發明產生的針對H5N1病毒的疫苗蛋白。本發明的又一個目標是提供針對H5N1病毒的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含本發明的轉基因植物、自所述轉基因植物產生的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白或所述轉基因植物的蛋白提取物。本發明的又一個目標是提供一種診斷臨床樣本中的抗體是因H5N1病毒的感染而形成還是因本發明的疫苗給予而形成的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)從臨床樣本中收集血液；(b)從收集的血液中分離血清；和(C)將針對血凝素(HA)的抗體和針對纖維素結合域(CBD)的抗體加至所分離的血清以反應。技術方案為實現所述目標，本發明提供了一種制備產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的轉基因植物的方法，所述方法包括將用于植物轉化的載體引入植物中，其中所述載體包含由以下組成的基因構建體(i)由選自SEQ ID NO :1-12的任一個核苷酸序列組成的DNA片段；(ii)具有SEQ ID NO : 13的核苷酸序列的BiP (分子伴侶結合蛋白)基因編碼H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，其具有SEQ ID NO :14的核苷酸序列，(iv)編碼纖維素結合域(CBD)的多核苷酸，其具有SEQ ID NO 15的核苷酸序列；和(v)編碼HDEL(His-Asp-Glu-Leu)肽的多核苷酸，其中所述基因構建體與啟動子可操作地連接。在本發明的一個實施方案中，將用于植物轉化的載體引入植物的方法可為選自以下的任一種農桿菌(Agrobacterium sp.)介導的轉化、粒子槍轟擊、碳化娃晶須、超聲處理、電穿孔和PEG (聚乙二醇)沉淀。在本發明的一個實施方案中，植物可為選自以下的雙子葉植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆、煙草、爺子、辣椒、土豆、西紅柿、中國白菜、大蘿卜(Chinese radishes)、卷心菜、萵苣、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜和芳:菜；或選自以下的單子葉植物水稻、大麥、小麥、黑麥、玉米、甘蔗、燕麥和洋蔥。本發明還提供了通過本發明的方法制備的轉基因植物，其中所述轉基因植物產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)。
此外，本發明提供了一種從轉基因植物中產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法，其中所述方法包括栽培本發明的轉基因植物和將自所述轉基因植物表達的HA蛋白分離和純化，其中編碼H5N1的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸具有SEQ ID N0:14的核苷酸序列。在本發明的一個實施方案中，血凝素(HA)蛋白(其為H5N1的抗原性蛋白并從轉基因植物中分離和純化)，可呈與纖維素結合域(CBD)融合的形式。本發明還提供了一種針對H5N1病毒的疫苗蛋白，該疫苗蛋白通過本發明的方法產生。在本發明的一個實施方案中，所述疫苗蛋白可為纖維素結合域(CBD)融合的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白。此外，本發明提供了一種針對H5N1病毒的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含本發明的轉基因植物、產生自所述轉基因植物的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白或所述轉基因植物的蛋白提取物。本發明還提供了一種診斷臨床樣本中的抗體是因H5N1病毒的感染而形成還是因本發明的疫苗給予而形成的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)從臨床樣本中收集血液；(b)從收集的血液中分離血清；和(c)將針對血凝素(HA)的抗體和針對纖維素結合域(CBD)的抗體加至所分離的血清中以反應。在本發明的一個實施方案中，若在步驟(C)的反應中檢測到針對血凝素(HA)的抗體和針對纖維素結合域(CBD)的抗體兩者，則可確定臨床樣本中的抗體因所述疫苗組合物的給予而形成；若僅檢測到針對血凝素(HA)的抗體，則可確定臨床樣本中的抗體因H5N1病毒的感染而形成。有利作用依照本發明，從植物中產生抗原性H5N1禽流感病毒的血凝素蛋白的方法能夠以低成本大量生產抗原性血凝素蛋白，所述植物用植物轉化重組載體轉化，其中所述載體可以高度有效的方式表達抗原性H5N1禽流感病毒的血凝素蛋白并能夠使蛋白在內質網中保留以完成糖基化，其為抗原活性所必需。本發明所用的重組載體具有其中插入的纖維素結合域以便以快速和容易的方式分離植物中表達的蛋白。此外，本發明的轉基因植物可呈飼料添加劑等形式，因此可用作可食用疫苗。此外，通過本發明產生的抗原性血凝素當給予動物模型時誘導免疫應答，因此不僅可用作H5N1禽流感病毒的蛋白疫苗，而且還可用作禽流感病毒感染的診斷試劑。附圖簡沭圖Ia的示意圖闡述了本發明中制備的用于植物轉化的載體中35Sp-UTR35:Bip:H5N1 (HA) :CBD:HDEL:N0S部分的連接形式。圖Ib顯示了本發明的一個實施方案中制備的用于植物轉化的載體的剪切圖譜。圖2顯示了在自各轉基因植物中提取的蛋白的SDS-PAGE電泳后，通過用CBD抗體的蛋白印跡分析轉基因植物中H5N1的HA表達程度，所述轉基因植物通過利用本發明的用于植物轉化的載體產生。
圖3的照片顯示了通過利用本發明的用于植物轉化的載體產生的能夠產生H5N1的HA蛋白的擬南芥。圖4為通過細胞免疫染色觀察到的、本發明的轉基因擬南芥中表達的H5N1的HA抗原性蛋白的細胞位置的照片。圖5為蛋白印跡分析的結果，所述蛋白印跡分析在從本發明的轉基因擬南芥中提取蛋白后，對其中蛋白提取物用降解寡糖的內切糖苷酶H處理的組和其中不用內切糖苷酶H處理的對照組進行，以確定H5N1的HA抗原性蛋白是否糖基化。圖6a顯示了通過考馬斯染色對分離和純化的蛋白的確認結果。用纖維素從本發明的轉基因擬南芥中分離和純化H5N1的抗原性HA蛋白。接著，進行SDS-PAGE電泳和考馬斯染色。圖6b顯示了從本發明的轉基因擬南芥中提取的總水溶性蛋白中檢測表達的H5N1抗原性HA蛋白的量的結果。用CBD抗體進行蛋白印跡分析并用多用檢測儀表(multigauge)程序檢測信號強度。圖7顯示了通過ELISA用各血清檢查針對禽流感抗原的特異性抗體即IgG抗體、IgG2a抗體和IgGl抗體的形成程度的結果。將分離自本發明的轉基因擬南芥的H5N1的抗原性HA蛋白注射至小鼠中。對于對照組，使用注射了用TIV代替H5N1的抗原性HA蛋白的小鼠的血清樣品。圖8的圖測量在將依照本發明產生的H5N1的抗原性HA蛋白或TIV(對于對照組)注射至小鼠中并用H5N2病毒誘導感染后各小鼠的體重變化。圖9的圖顯示了在將依照本發明產生的H5N1的抗原性HA蛋白注射至小鼠或TIV(對于對照組)注射至小鼠中并用H5N2病毒誘導感染后，各小鼠的生存率。


圖10顯示了通過蛋白印跡分析的對用小鼠血清形成針對H5N1HA的抗體和針對CBD的抗體的確認結果。小鼠用依照本發明產生的H5N1的抗原性HA蛋白免疫。
圖11顯示了通過ELISA法檢查針對禽流感抗原的特異性抗體、抗總IgG(雞)抗體的形成的結果。將分離自本發明的轉基因擬南芥的H5N1的抗原性HA蛋白注射至雞中。分離血清樣品并通過ELISA法檢查針對禽流感抗原的特異性抗體的形成情況，對于對照組，顯示其中將用PBS緩沖液代替H5N1的抗原性HA蛋白注射的雞血清樣品用于進行抗原-抗體反應的結果。
實施本發明的最佳方式本發明涉及用于防止高致病性禽流感H5N1病毒的疫苗的開發，并且特征在于產生H5N1病毒的抗原性蛋白血凝素(HA)的轉基因植物的制備。更特別地，本發明提供了一種制備產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的轉基因植物的方法，其中所述方法包括將用于植物轉化的載體引入植物中，其中所述載體包含由以下組成的基因構建體(i)由選自SEQ ID NO 1-12的任一個核苷酸序列組成的DNA片段；(ii)具有SEQ ID NO 13的核苷酸序列的BiP(分子伴侶結合蛋白)基因；(iii)編碼H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，其具有SEQ ID NO: 14的核苷酸序列；(iv)編碼纖維素結合域(CBD)的多核苷酸，其具有SEQ ID NO 15的核苷酸序列；和(V)編碼HDEL(HiS-ASp-Glu-Leu)肽的多核苷酸，其中所述基因構建體與啟動子可操作地連接。為了使來自植物的可用于疫苗的有用蛋白即H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的產生最大化，本發明人制備了用于植物轉化的重組載體，其將編碼HA蛋白的基因引入植物中并在該植物中表達。所述重組載體包含5’非翻譯區(5’UTR)的核苷酸序列，其可在翻譯階段 調節蛋白的表達。已知mRNA的5’非翻譯區(5’ UTR)通常在基因表達的翻譯后調節、mRNA轉運至核外的調節、蛋白翻譯效率的調節和mRNA穩定性的調節中起重要作用。在本發明中，5’非翻譯區(5，UTR)可為提高分離自擬南芥的蛋白的翻譯效率的DNA片段，并且優選具有選自由下表示出的SEQ ID NO :1-12的任一個核苷酸序列。5’UTR 序列
5，UTR No. 核苷酸序列SEQ ID NO.
UTR IAGAGAAGACGAAACACAAAAGI
UTR 2GAGAGAAGAAAGAAGAAGACG2
UTR 6AAAACTTTGGATCAATCAACA3
UTR 7CTCTAATCACCAGGAGTAAAA4
UTR 24AGAAAAGCTTTGAGCAGAAAC5
UTR 35AACACTAAAAGTAGAAGAAAA6
Ul AMAGAGAAGACGAAACACAAAAA7
Ul CCCAGAGAAGACGAAACACAACCC8
Ul GGGAGAGAAGACGAAACACAAGGG9
Ul(-4，5G)AGAGAAGACGAAACACGGAAG10
Ul(-4,5C)AGAGAAGACGAAACACCCAAGHU AAG AAGAAGAAGAAGMGAAGAAG ~12此外，本發明的用于植物轉化的重組載體可包含靶向基因以移動血凝素蛋白至內質網，以便從植物中大量產生抗原性H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白。通常，當異源蛋白在轉基因植物或細胞中過表達時，往往發生蛋白水解降解。然而，若外來蛋白靶向各種細胞內細胞器，這些蛋白可更穩定地儲存。特別地，當異源蛋白靶向內質網而非存在胞質中時，可使蛋白水解降解最小化。此外，大多數病毒的表面蛋白以糖基化形式存在并且已知病毒的表面蛋白是否糖基化在病毒蛋白的穩定結構的形成、抗體反應的誘導和免疫應答的誘導等中起非常重要的作用(Goffard,A.等.，J. Virol. 79，8400-8409，2005 ；Hebert,D. N.等.,J. Cell Biol. 139，613-623,1997)。文獻還已報道當對比糖基化蛋白和非糖基化蛋白時，病毒蛋白的糖基化有助于抗體形成(Ewasyshyn, M.，等.，J. Gen. Virol. 74，2781-2785，1993)。因為內質網包含大量甘露糖并且糖基化在內質網中活躍進行，所以將H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白移動至 內質網可保持蛋白的穩定性并得到大量糖基化形式的HA蛋白。在本發明中，編碼Bip(分子伴侶結合蛋白)的多核苷酸可用于將H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白移動至植物內的內質網。優選可使用具有SEQ ID NO 13的核苷酸序列的多核苷酸(包含內含子的Bip的基因組DNA)，代替Bip的cDNA。Bip這種腔內結合蛋白(luminal binding protein)被鑒定為免疫球蛋白重鏈結合蛋白和葡萄糖調節的蛋白，并且為定位于內質網的HSP70分子伴侶家族的一個成員，且瞬時結合內質網中新合成的蛋白。確定靶向內質網的信號序列包含于Bip的N-端并在靶向靶蛋白至內質網中起作用。用于植物轉化的重組載體可包含編碼ER保留信號肽例如HDEL的多核苷酸以確保在HDEL信號肽的情況下，將異源蛋白保留于內質網中以增加通過分子伴侶的折疊和裝配并隨后進一步使蛋白水解降解最小化(Nuttall, J.等.，2002)。例如這樣地，已知當異源蛋白保留于內質網而非送至分泌途徑時，異源蛋白的產量增加了約10-100倍(Hellwig，S.等.，2004)。此外，本發明的用于植物轉化的重組載體可包含編碼H5N1病毒表面上存在的血凝素(HA)的基因。通常，流感病毒在其表面上具有血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)抗原。HA和NA是比較大的糖蛋白。HA為有助于病毒識別和穿透細胞表面的蛋白。NA為病毒在宿主細胞中增殖后有助于病毒脫離宿主細胞的蛋白。已知HA和NA為引起宿主細胞的免疫應答的蛋白。具體而言，HA蛋白具有凝集鳥的紅細胞的能力并且已知為引起體內觸發的大多數抗體反應的抗原。因此，在本發明中，為了從植物中產生針對H5N1病毒的疫苗，可將編碼H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，優選具有SEQ ID NO :14的核苷酸序列的H5N1病毒的血凝素(HA)基因包含于用于植物轉化的重組載體中。具有SEQ ID NO :14的核苷酸序列的多核苷酸編碼包含H5N1型/香港/213/03病毒毒株的血凝素蛋白的一部分的多肽，其中該部分不包含HA蛋白的23個氨基酸。此外，用于植物轉化的重組載體可包含編碼纖維素結合域(CBD)的多核苷酸。包含于重組載體中的編碼CBD的多核苷酸可為在本領域通常用于蛋白純化的任何核苷酸序列，優選可具有SEQ ID NO 15的核苷酸序列。因此，依照本發明的用于植物轉化的重組載體為包含由以下順次組成的基因構建體的表達載體可提高異源蛋白的翻譯效率的DNA片段、Bip基因序列、編碼H5N1病毒的HA蛋白的多核苷酸、編碼CBD的多核苷酸和編碼HDEL肽的多核苷酸；并且所述基因構建體可與啟動子可操作地連接。在本發明中，術語“表達載體”是指可通過本發明的DNA片段、基因構建體或多核苷酸的插入或摻入來操縱的質粒、病毒或本領域已知的其它載體。本發明的DNA片段、基因構建體或多核苷酸可與表達控制元件可操作地連接。所述可操作地連接的基因構建體和表達控制元件可一起包含于一個表達載體中，所述載體包含選擇標記和復制起點。術語“可操作地連接的”可指以當合適的分子結合表達控制元件時允許基因表達的方式連接的基因和表達控制元件。術語“表達控制元件”是指控制特定的宿主細胞中可操作地連接的多核苷酸的表達的DNA片段。所述控制元件可包括用于進行轉錄的啟動子、用于調節轉錄的任意操縱基因元件、合適的mRNA核糖體結合位點和用于控制轉錄和翻譯終止的DNA片段。
只要其可在植物中表達插入的基因就可使用任何啟動子，并無特別限制。啟動子的實例包括但不限于CaMV的35S RNA和19SRNA啟動子、來源于玄參花葉病毒(FMV)的全長轉錄啟動子和TMV外殼蛋白的啟動子。用于將本發明的DNA片段、基因構建體或多核苷酸摻入植物細胞的合適載體的實例包括Ti質粒、植物病毒載體等。合適載體的優選實例包括但不限于雙質粒(binary vector)載體例如pCHF3、pPZP、pGA和pCAMBIA載體。本發明可使用任何載體，只要其可將本發明的所述多核苷酸引入植物細胞中。在本發明的一個實施方案中，如下制備用于H5N1病毒的抗原性血凝素的表達的重組載體用本發明人開發的載體(其可移動異源基因至植物的內質網以表達并保持，即韓國專利申請第2009-0081403號中公開的載體)，作為基礎載體，通過用編碼具有SEQ IDNO 14的核苷酸序列的H5N1病毒的血凝素蛋白的多核苷酸取代基礎載體的異源基因；切割包含35S啟動子和NOS終止子部分的區；和利用PstI和EcoRI限制性酶連接該區域至PBI121載體，該載體為用于植物轉化的載體。依照本發明制備的載體中的由啟動子、UTR序列、Bip序列、H5N1的HA序列、CBD序列和HDEL序列組成的基因構建體的質粒圖譜示于圖I中。韓國專利申請第2009-0081403號通過引用以其整體結合于本文中。因此，本發明可提供制備產生血凝素這種H5N1病毒的抗原性蛋白的轉基因植物的方法，其包括將之前所述的用于植物轉化的重組載體引入植物中的步驟。將本發明的重組載體引入植物的方法可為但不限于農桿菌介導的轉化、粒子槍轟擊、碳化硅晶須、超聲處理、電穿孔和PEG(聚乙二醇)沉淀。在本發明的一個實施方案中，擬南芥通過農桿菌介導的轉化用本發明的重組載體轉化，通過該方法轉化的擬南芥的照片在圖3中示出。因此，本發明提供了通過本發明的方法制備的轉基因植物，其中所述轉基因植物產生H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白。此外，因為H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白以高度有效的方式翻譯并在植物的內質網中累積，所以用本發明的重組載體轉化的植物，即可以高度有效的方式產生H5N1的血凝素的植物，可通過有性繁殖或無性繁殖(其為本領域的常規方法)獲得。更特別地，本發明的植物可通過有性繁殖獲得，有性繁殖是通過經由花的傳粉產生的種子來繁殖植物的過程。此外，本發明的植物可通過利用本發明的重組載體轉化植物獲得，接著進行無性繁殖，其為包括以下的過程依照常規方法誘導愈傷組織、生根和適應土壤。換言之，將用本發明重組載體轉化的植物的外植體轉移至本領域已知的合適的培養基中，并培養以誘導愈傷組織的形成。當形成芽時，將其轉移并培養于無激素的培養基中。約兩周后，將芽轉移至生根培養基中以誘導根。當誘導出根后，將其轉移至土壤中并適應，接著可獲得本發明的植物。在本發明中，所述轉基因植物不僅可包括整株植物，而且還可包括自整株植物獲得的組織、細胞和種子。在本發明中，所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物。雙子葉植物的實例可為但不限于擬南芥、大豆、煙草、茄子、辣椒、土豆、西紅柿、中國白菜、大蘿卜、卷心菜、萵苣、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜和芹菜。單子葉植物的實例可為但不限于水稻、大麥、小麥、黑麥、玉米、甘蔗、燕麥和洋蔥。同時，為了鑒定H5N1的血凝素蛋白是否位于用重組載體轉化的植物的細胞內質網中，本發明人在一個實施方案中用細胞免疫染色檢查并發現H5N1的血凝素蛋白存在于 植物的內質網中(圖4)。 按照本發明的一個實施方案，為了鑒定轉基因植物中表達的H5N1的血凝素蛋白是否以糖基化形式存在，本發明人從植物中提取蛋白并用內切糖苷酶H處理，該酶降解寡糖。因此，發現表達的H5N1的血凝素蛋白通過翻譯后修飾糖基化(圖5)。此外，本發明可提供一種從轉化了本發明的重組載體的植物中產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法。所述方法可包括栽培所述轉基因植物并分離和純化從植物中表達的蛋白，所述植物中引入了編碼H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO :14的核苷酸序列。更具體地，從轉基因植物中產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法可通過以下完成將本發明的重組載體引入植物或用重組的表達載體轉化植物細胞，接著栽培植物或植物細胞達合適的時間段以表達血凝素(HA)，并接著從轉基因植物或植物細胞中獲得血凝素(HA)。可使用表達蛋白的任何方法，只要其在本領域已知。轉基因植物或植物細胞中高度表達的蛋白的收集可通過本領域已知的各種分離和純化方法進行。一般而言，可進行細胞裂解物的離心，隨后沉淀例如鹽析沉淀(硫酸銨沉淀和磷酸鈉沉淀)、溶劑沉淀(用丙酮、乙醇等進行的蛋白級分的沉淀)以移除細胞碎片等。可進行透析、電泳、各種柱層析等。可單獨或聯合應用離子交換層析、凝膠過濾層析、HPLC、反相HPLC、親和柱層析、超濾等以純化本發明的血凝素(HA)蛋白(Maniatis等 ，Molecular Cloning A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982) ；Sambrook等.,Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989) ；Deutscher, M. , Guide to Protein Purification Methods Enzymology,第182 卷 Academic Press. Inc. , San Diego, CA(1990))。此外，在本發明中，為了容易并快速地從轉基因植物中分離和純化血凝素(HA)蛋白，可另外將編碼纖維素的纖維素結合域(CBD)的多核苷酸(優選其具有SEQ ID N0:15的核苷酸序列)與前述的本發明重組載體可操作地連接。因此，植物中表達的H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白可呈與纖維素結合域(CBD)的融合形式。因此，使用用纖維素載體作柱的層析可容易地將其分離并純化。
因此，本發明可提供具有抗原性的H5N1病毒的重組血凝素蛋白，其由以上方法產生。由該方法產生的重組HA蛋白可為針對H5N1病毒的疫苗蛋白。該蛋白可為融合蛋白，其中H5N1病毒的血凝素蛋白與纖維素結合域(CBD)融合。此外，本發明人研究了通過如上所述的本發明方法從植物中產生的H5N1血凝素融合蛋白是否真的作為抗原起作用并且是否可用于H5N1病毒疫苗。換言之，依照本發明的一個實施方案，將通過如上所述的本發明方法分離并純化的H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白肌內注射至小鼠模型，并接著收集血液。分離血清并用ELISA法研究抗原特異性抗體反應。對于對照組，用TIV (三價流感疫苗，H1N1+H3N2+B型HA蛋白)代替血凝素抗原性蛋白。因此，對照組所用TIV不能誘導H5N1-特異性抗體反應，但其中小鼠給予了本發明產生的H5N1的血凝素抗原性蛋白的實驗組，具有免疫原性并誘導抗原特異性抗體反應(圖8)。
從該結果，本發明人發現產生自植物的本發明H5N1病毒的血凝素蛋白，可在活體內誘導針對HA蛋白的抗體，其隨后研究了 H5N1病毒的血凝素蛋白是否真的具有針對禽流感病毒的防御作用。依照本發明的一個實施方案，將注射了產生自植物的本發明H5N1病毒的血凝素蛋白或TIV(對照組)的小鼠用H5N2病毒感染，已知所述H5N2病毒比H5N1具有相對低的風險。檢查體重的變化情況和生存率。在給予H5N1血凝素蛋白的組中，小鼠的體重減輕了，但隨時間的推移并在15天后，恢復了初始體重的超過90%。然而，在給予TIV的組中，小鼠的體重持續減少(圖8)。依據生存率的檢測結果，給予TIV的組中，所有小鼠在第6-8天死亡。在給予H5N1血凝素蛋白的組中，一只小鼠在第7天死亡，另一只小鼠在第8天死亡，相比于對照組生存率為67% (圖9)。因此，本發明人發現從本發明轉基因植物中產生的H5N1病毒的血凝素蛋白不僅可誘導針對H5N1病毒的抗體形成，而且還可具有針對禽流感病毒的防御作用。如上所述，根據對小鼠的實驗，本發明人發現通過本發明的方法從植物中產生的H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白具有免疫原性并且可誘導抗原特異性抗體反應。基于該結果，本發明人發現本發明中產生的H5N1病毒的血凝素蛋白可用作可應用于包括小鼠和人在內的哺乳動物的疫苗。為了研究通過本發明的方法從植物中產生的H5N1病毒的血凝素蛋白是否可用作不僅可應用于哺乳動物而且還可應用于鳥和家禽的疫苗，本發明人在本發明的一個實施方案中將通過本發明的方法從植物中產生的H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白給予雞。分離血清樣品并用ELISA法研究抗原特異性抗體反應。對于對照組，給予PBS緩沖液代替所述抗原性血凝素蛋白。因此，給予了 PBS緩沖液的雞不能誘導H5N1-特異性抗體反應。但是，無論性別，給予了本發明產生的H5N1的抗原性血凝素蛋白的雞具有免疫原性并誘導抗原特異性抗體反應(
圖11)。因此，發現從本發明轉基因植物中產生的H5N1病毒的血凝素蛋白可用作疫苗的生產，該疫苗不僅可應用于哺乳動物而且還可應用于包括雞在內的鳥和家禽。因此，本發明可提供依照上述本發明的方法的轉基因植物、產生自所述轉基因植物的H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白或包含含有所述轉基因植物的蛋白提取物的針對H5N1病毒的疫苗組合物。本發明的疫苗組合物可通過包括以下的各種方式給予有需要的個體口服給藥、經皮給藥、皮下給藥、靜脈給藥或肌肉給藥。組合物的給藥劑量可視不同因素例如給藥途徑、體重、個體年齡等合適地控制。本發明的組合物可與對H5N1病毒的感染具有預防或治療作用的其它已知的化合物聯合給藥，并且還可包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形齊U。本發明的疫苗組合物可包含約100-約1000mg/L的H5N1病毒的血凝素蛋白作為活性成分并且給藥劑量可為約50-500mg，但不限于此。可另外包含于所述疫苗組合物中的載體、賦形劑和稀釋劑的實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酯、羥苯丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。此外，可另外包含填充齊U、抗凝血劑、潤滑齊U、濕潤齊U、芳香齊U、乳化劑、防腐劑等。本發明的組合物可通過本領域已知的方法配制以在給予有需要的個體后提供活性成分的快速、持續或延遲釋放。所述制劑可為但不限于散劑、顆粒劑、片劑、乳劑、糖漿、氣霧劑、軟明膠膠囊或硬明膠膠囊、無菌注射液和無菌散劑。
本發明的疫苗組合物可給予的個體可包括可為H5N1病毒感染的對象的所有個體，例如哺乳動物，包括人、鳥、家畜、家禽等。此外，本發明的轉基因植物可以其本身或通過研磨植物并將其加入動物飼料或飲用水中給予，因此，所述轉基因植物可用于用于口服給藥的疫苗。因此，本發明可提供本發明的轉基因植物，從所述轉基因植物中產生的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白，或包含來自所述轉基因植物的蛋白提取物的針對H5N1病毒的用于口服給藥的疫苗組合物。當所述轉基因植物用作用于口服給藥的疫苗組合物時，有以下優點被動物病毒污染的可能性低；因為產生的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白包含于植物中，長期儲存和運輸是切實可行的；和可明顯減少注射接種的成本。由于有可能從本發明轉基因植物中分離和純化高致病性禽流感H5N1病毒的血凝素(HA)抗原性蛋白，所以本發明可提供用于H5N1病毒感染的診斷試劑。此外，本發明可提供一種H5N1病毒感染的診斷方法，所述方法通過使分離和純化的H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白與家禽或哺乳動物的血清等反應來進行。此外，從本發明轉基因植物中分離并純化的H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白，具有與纖維素結合域(CBD)融合的融合蛋白的特征，其。因此，本發明人檢查了當將通過本發明產生的H5N1病毒的血凝素(HA)抗原性蛋白給予小鼠時，是否形成針對血凝素蛋白融合的CBD蛋白的抗體。因此，發現當給予HA抗原性蛋白時，還形成了針對融合的CBD蛋白的抗體(
圖10)。因此，基于該結果，通過檢測從個體中獲得的血清中針對H5N1病毒的血凝素(HA)的抗體和針對CBD蛋白的抗體的過程，本發明可診斷個體中形成的針對血凝素(HA)的抗體是因H5N1病毒的感染而形成還是因包含本發明H5N1病毒的血凝素(HA)的疫苗而形成。因此，本發明可提供一種診斷臨床樣本中的抗體是因H5N1病毒的感染而形成還是因疫苗給予而形成的方法，所述方法包括以下步驟(a)從臨床樣本中收集血液；(b)從收集的血液中分離血清；和(c)將針對血凝素(HA)的抗體和針對纖維素結合域(CBD)的抗體加至所分離的血清以反應。更特別地，血液樣品從臨床樣本中收集，所述臨床樣本優選為具有被禽流感病毒感染的機會的對象，例如除鳥或人之外的所有類型的動物；血清樣品用本領域常規使用的方法從血液中分離；并接著加入針對血凝素(HA)的抗體和針對纖維素結合域(CBD)的抗體以產生免疫反應。接著，通過檢測針對血凝素(HA)的抗體和針對纖維素結合域(CBD)的抗體，所述診斷方法可診斷臨床樣本中形成的血凝素(HA)抗體是因H5N1病毒的感染而形成還是因包含本發明的H5N1病毒血凝素(HA)的疫苗而形成。在根據免疫反應的診斷中，若從臨床樣本中獲得的血清中檢測到針對血凝素的抗體和針對纖維素結合域(CBD)的抗體兩者，則可確定H5N1病毒的HA抗體因本發明的疫苗給予形成。若僅從臨床樣本中獲得的血清中檢測到針對血凝素的抗體，則可確定H5N1病毒的HA抗體因H5N1病毒的感染形成。因此，本發明的診斷方法具有以下作用在給予本發明的疫苗或疫苗組合物后，可確定是否有效形成針對H5N1病毒的抗體；若接種針對禽流感的疫苗并通過該診斷方法診斷出針對H5N1病毒的HA抗體是因H5N1病毒的感染而形成，則可快速采取預防或治療措 施，并且因此，可防止家禽的不必要毀滅并可減少經濟損失；和可預防或治療人的感染。因此，本發明中產生的呈與CBD融合形式的抗原性H5N1血凝素蛋白可用作標記疫苗。下文中，將參考以下實施例更詳細地描述本發明。但是，以下實施例僅出于闡述的目的提供，并且本發明的范圍不應受其限于此。實施例I包含H5N1病毒的抗原性基因的用于植物轉化的載體的制備為了產生包含HPAI (H5N1)病毒表面上的抗原性血凝素(HA)基因的用于植物轉化的載體，本發明人使用了包含提高翻譯效率的DNA片段的重組載體，該DNA片段提高了異源蛋白的翻譯效率，所述載體由本發明人開發并描述于韓國專利申請第2009-0081403號。換言之，對于本發明所用的用于植物轉化的重組載體，本發明人用PstI和EcoRI限制性酶將以下序列的區域連接至常規使用的載體PBI121載體，并制備用于植物轉化的載體pBI121-35Sp-UTR35: Bip :H5N1 (HA) : CBD: HDEL: NOS，所述序列包含花椰菜花葉病毒35S啟動子；提高異源蛋白的翻譯效率的DNA片段，其為5’ UTR(5’非翻譯區)并為在具有下表I中所示SEQ ID NO :1-12的核苷酸序列的多核苷酸之中的具有SEQ ID NO :6的核苷酸序列的多核苷酸；編碼Bip (分子伴侶結合蛋白)的多核苷酸，其具有SEQ ID NO 13的核苷酸序列，其能夠在植物細胞中使異源蛋白靶向內質網(ER);編碼H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白的多核苷酸，其具有SEQ ID NO: 14的核苷酸序列(其為HPAI (H5N1)A型/香港/213/03病毒毒株的部分血凝素蛋白，不含最后的23個氨基酸)；編碼纖維素結合域(CBD)的多核苷酸序列，其具有SEQ ID N0:15的核苷酸序列；HDEL(HiS-ASp-Glu-Leu)肽，其為保留異源蛋白于內質網內的信號肽；以及包含35S終止子(NOS)的終止密碼子。依照本發明制備的用于植物轉化的載體中35Sp-UTR35: Bip: H5N1 (HA) : CBD: HDEL: NOS的基因構建體的圖譜在圖Ia中示出，該制備載體的質粒圖譜在圖Ib中示出。[表I]5’UTR 序列
權利要求
1.一種制備產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的轉基因植物的方法，所述方法包括將用于植物轉化的載體引入植物中，其中所述載體包含由以下順次組成的基因構建體⑴具有選自SEQ ID NO 1-12的核苷酸序列的DNA片段；(ii)具有SEQ ID NO 13的核苷酸序列的BiP(分子伴侶結合蛋白)基因；(iii)編碼H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，其具有SEQ ID NO : 14的核苷酸序列；(iv)編碼纖維素結合域(CBD)的多核苷酸，其具有SEQ ID NO 15的核苷酸序列；和(V)編碼HDEL (His-Asp-Glu-Leu)肽的多核苷酸，其中所述基因構建體與啟動子可操作地連接。
2.權利要求I所述的方法，其中將用于植物轉化的載體引入植物中的方法可為選自以下的任一種農桿菌介導的轉化、粒子槍轟擊、碳化硅晶須、超聲處理、電穿孔和PEG(聚乙二醇)沉淀。
3.權利要求I所述的方法，其中所述植物可為選自以下的雙子葉植物擬南芥、大豆、煙草、茄子、辣椒、土豆、西紅柿、中國白菜、大蘿卜、卷心菜、萵苣、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜和芹菜；或選自以下的單子葉植物水稻、大麥、小麥、黑麥、玉米、甘蔗、燕麥和洋蔥。
4.一種產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的轉基因植物，其通過權利要求1-3中任一項的方法制備。
5.一種自權利要求4的轉基因植物產生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法，其包括栽培所述轉基因植物和從所述轉基因植物中分離和純化HA蛋白。
6.權利要求5所述的方法，其中H5N1的抗原性血凝素(HA)為與纖維素結合域(CBD)的融合形式。
7.一種針對H5N1病毒的疫苗蛋白，其通過權利要求5或權利要求6的方法產生。
8.權利要求7所述的疫苗蛋白，其中所述蛋白為纖維素結合域(CBD)融合的H5N1血凝素(HA)蛋白。
9.一種針對H5N1病毒的疫苗組合物，其包含權利要求5或權利要求6的轉基因植物、自所述轉基因植物產生的H5N1血凝素(HA)蛋白或所述轉基因植物的蛋白提取物。
10.一種診斷臨床樣本中的抗體是因H5N1病毒的感染而形成還是因疫苗給予而形成的方法，其包括以下步驟(a)從臨床樣本中收集血液；(b)從收集的血液中分離血清；和(c)將針對血凝素(HA)的抗體和針對纖維素結合域(CBD)的抗體加至所分離的血清以反應。
11.權利要求10所述的方法，其中若在步驟(C)的反應中檢測到針對血凝素(HA)的抗體和針對纖維素結合域(CBD)的抗體兩者，則確定臨床樣本中的抗體因權利要求9的疫苗組合物的給予而形成；若僅檢測到針對血凝素(HA)的抗體，則確定臨床樣本中的抗體因H5N1病毒的感染而形成。
全文摘要
本發明涉及一種利用植物轉化重組載體產生轉基因植物的方法，所述轉基因植物涉及以高度有效的方式產生H5N1病毒的血凝素蛋白，其中所述載體可以高度有效的方式表達高致病性禽流感病毒H5N1病毒的血凝素蛋白，并且可將植物中表達的蛋白轉運至內質網并能夠使蛋白在內質網中保留以完成糖基化，該糖基化為抗原活性所必需。本發明還涉及一種從轉基因植物中大量產生抗原性H5N1病毒的血凝素蛋白的方法，以及包含所述轉基因植物或自所述植物產生的血凝素蛋白的用于禽流感病毒的疫苗組合物。用本發明的轉基因植物產生H5N1病毒的血凝素蛋白的方法能夠以低成本大量生產血凝素蛋白。本發明所用的植物轉化重組載體具有插入其中的纖維素結合域以便以快速和容易的方式分離植物中表達的蛋白。此外，本發明的轉基因植物可呈飼料添加劑等形式，因此可用作可食用疫苗。此外，通過所述方法產生的抗原性血凝素蛋白當給予動物模型時誘導免疫應答，因此不僅可用作H5N1禽流感病毒的蛋白疫苗，而且還可用作禽流感病毒感染的診斷試劑。
文檔編號A01H1/00GK102770016SQ201080056346
公開日2012年11月7日 申請日期2010年10月6日 優先權日2009年10月6日
發明者任世鎮, 全恩賢, 孫恩珠, 成永喆, 樸基碩, 權恩惠, 羅允貞, 黃仁煥 申請人:螺線有限公司