專利名稱：高致病性禽流感的中和分子及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和免疫學領域；更具體地，本發明涉及高致病性禽流感的中和分子及其制備方法。
背景技術：
自1997年以來高致病性禽流感H5N1病毒已感染了約5億只禽類，同時在亞洲、歐洲和非洲已有越來越多的人被感染。雖然，目前為止人類的感染都是由禽類傳播的，但H5N1病毒經過重組和進化可能演變出來具有人傳人能力的新的病毒株。這種新病毒的廣泛蔓延加之人們對H5N1病毒缺少預成的免疫力將會對人類造成重大的發病率和死亡率。感染了高致病性禽流感H5N1病毒的主要表現是嚴重的肺炎、淋巴細胞減少、高淋巴因子血癥及呼吸道的高病毒載量2_6。病毒通常可以從患者的腦脊液、糞便、痰液和血清樣本中培養出來。目前對此病的治療主要是依靠抗病毒藥物，但一些H5N1病毒株可以對三環癸胺類離子通道阻滯劑藥物產生耐藥性7。雖然奧塞米韋等神經氨酸抑制劑對季節性流感有一定的療效但對于H5N1病毒的效果還存在爭議。動物實驗表明神經氨酸抑制劑藥物的療效只有在感染前或感染后瞬間給藥才能發揮療效2，且H5N1病毒對奧塞米韋等神經氨酸抑制劑類藥物也可產生耐藥性8。因此尋找能有效的治療禽流感和控制禽流感在人類中傳播的方法是急需的。應用單克隆抗體和多克隆抗體的抗體療法已有效的應用于甲肝、乙肝、狂犬病、水痘及巨細胞病毒感染等多種疾病的治療9。嬰兒通過后天的抗體免疫也可獲得針對流感病毒的免疫力1CH13。從1918年西班牙流感大流行的幸存者體內所分離得到的單克隆抗體可以有效的將流感的死亡率降低50%14。輸入感染過H5N1的康復病人的血漿可以有效的降低H5N1病毒感染病人的病毒載量并可以完全康復15。將免疫小鼠、雪貂、馬和人獲得的流感抗體打入小鼠體內可以有效的預防和治療流感16_25。最近，Koudstaal等人發現小鼠單次注射15毫克/公斤的人單克隆抗體CR6261比感染后連續5天注射10毫克/公斤/天的奧塞米韋更能有效預防和治療致命的H5N1和HlNl感染26。因此，應用被動免疫獲得的抗體治療高致病性禽流感H5N1病毒人類感染性疾病將是一種有效可行的方法。血凝素基因(HA)是禽流感病毒基因組中變異最大的基因。從HA的序列方面看，自2000來有10個H5HA的分支在不同的物種中出現27。其中分支2又可分為5亞分支。亞分支2. 3又可分為2. 3. 1,2. 3. 2,2. 3. 3和2. 3. 4四個亞亞分支28。目前為止感染人類的高致病性禽流感H5N1病毒分為O、1、2和7分支，在中國比較流行的感染人的高致病性禽流感H5N1病毒屬于2. 3. 4亞亞分支27’28。此外，在東南亞和東亞感染家禽和鳥類的高致病性禽流感H5N1病毒也屬于2. 3. 4亞亞分支29。研究顯示，在人類H5HA至少有四種不同的抗原30。此外，流感病毒通過其遺傳漂移和重組來逃逸免疫監視的特性使其一直以來是公共衛生健康的重大威脅，導致臨床上常用的兩類抗病毒藥物對其效果都不是很理想，且有耐藥株出現，因此尋找新的有效的治療方法是急需的。
綜上，鑒于禽流感的高變異性，尋找對盡可能多的禽流感變異病毒株均具有良好的中和能力的中和分子是非常必要的。

發明內容
本發明的目的在于提供高致病性禽流感的中和分子及其制備方法。
在本發明的第一方面，提供一種結合分子，其識別禽流感病毒的血球凝集素HAl，并結合于血球凝集素N端區域上的表位上，該表位包含以下位點
血球凝集素氨基酸序列第121位的Ser ;和
血球凝集素氨基酸序列第162位的Arg。
在另一優選例中，所述的表位還包含以下位點
血球凝集素氨基酸序列第117位的Ile ；
血球凝集素氨基酸序列第118位的Pro ；
血球凝集素氨基酸序列第161位的Lys ；
血球凝集素氨基酸序列第164位的Tyr ;或
血球凝集素氨基酸序列第167位的Thr。
在另一優選例中，所述的N端區域是血球凝集素氨基酸序列第51 260位氨基酸區域。
在另一優選例中，所述結合分子(例如65C6或其類似物)包含SEQID NO: 7所示的重鏈CDRl, SEQ ID NO:8所示的重鏈CDR2，SEQ ID NO:9所示的重鏈CDR3。
在另一優選例中，所述結合分子(例如65C6或其類似物)包含SEQID NO:10 所示的輕鏈CDR1, SEQ ID NO: 11所示的輕鏈CDR2，SEQ ID NO: 12所示的輕鏈CDR3。
在另一優選例中，所述結合分子(例如65C6或其類似物)包含SEQ ID N0:7所示
的重鏈CDR1, SEQ ID NO: 8所示的重鏈CDR2，SEQ ID NO: 9所示的重鏈CDR3 ;以及SEQ IDNO: 10所示的輕鏈CDRl，SEQ ID NO: 11所示的輕鏈CDR2，SEQ ID NO: 12所示的輕鏈CDR3。在另一優選例中 ，所述的結合分子(例如65C6或其類似物)包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在另一優選例中，所述的結合分子(例如65C6或其類似物)包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。在另一優選例中，所述的結合分子(例如65C6或其類似物)包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在另一優選例中，所述結合分子包含SEQ ID NO: 13所示的重鏈⑶Rl，SEQ IDNO: 14所示的重鏈CDR2，SEQ ID NO: 15所示的重鏈CDR3 ;和/或包含SEQ ID NO: 16 所示的輕鏈 CDRl，SEQ ID NO: 17 所示的輕鏈 CDR2，SEQ ID勵:18所示的輕鏈0 3。在另一優選例中，所述的結合分子(例如100F4或其類似物)包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。在另一優選例中，所述的結合分子(例如100F4或其類似物)包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
在另一優選例中，所述的結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在另一優選例中，所述結合分子包含SEQ ID NO: 19所示的重鏈⑶Rl，SEQ IDNO:20所示的重鏈CDR2，SEQ ID NO:21所示的重鏈CDR3 ;和/或包含SEQ ID NO: 22 所示的輕鏈 CDRl，SEQ ID NO: 23 所示的輕鏈 CDR2，SEQ IDN0:24所示的輕鏈CDR3。在另一優選例中，所述的結合分子(例如3C11或其類似物)包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列。在另一優選例中，所述的結合分子(例如3C11或其類似物)包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列。在另一優選例中，所述的結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列。在另一優選例中，所述的結合分子是人單克隆抗體、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體；優選的，所述的結合分子是人單克隆抗體；更優選的，所述的人單克隆抗體其重鏈恒定區選擇下組中重鏈類型之一的恒定區IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，和其輕鏈恒定區選擇下組輕鏈類型的恒定區之一 K鏈和λ鏈；更優選的，所述的人單克隆抗體其重鏈恒定區和輕鏈恒定區分別具有Genebank號ACK87036和ACK87038所示的氨基酸序列。在另一優選例中，在所述結合分子的重鏈或輕鏈中，所述的⑶Rl、⑶R2和⑶R3區
從氨基酸至羧基端依次串聯排列。 在另一優選例中，所述的⑶Rl之前，⑶Rl與⑶R2之間，⑶R2與⑶R3區之間，⑶R3之后，還包括框架區；較佳地，所述的框架區的氨基酸長度為6-40個；較佳地8-35個；更佳地10-32個。在本發明的另一方面，提供一種多核苷酸，它編碼前面任一所述的結合分子。在本發明的另一方面，提供一種表達載體，所述表達載體中含有編碼前面任一所述的結合分子的重鏈的多核苷酸；和/或編碼前面任一所述的結合分子的輕鏈的多核苷酸。在本發明的另一方面，提供一種宿主細胞，所述宿主細胞中含有所述的表達載體；或其基因組中整合有所述的多核苷酸。在另一優選例中，所述的宿主細胞是果蠅S2細胞。在本發明的另一方面，提供一種制備前面任一所述的結合分子的方法，所述方法包括培養前面所述的宿主細胞，從而表達所述的結合分子。在本發明的另一方面， 提供所述的結合分子的用途，用于制備預防、緩解或治療禽流感病毒感染的組合物(如藥物)。在另一優選例中，所述的禽流感病毒是Η5亞型的病毒。在另一優選例中，所述的禽流感病毒是Η5Ν1病毒。
在另一優選例中，所述的禽流感病毒是除H5N1的7. 2分支外的H5亞型的病毒；較佳地為除H5N1的7. 2分支外的H5N1病毒。在本發明的另一方面，提供一種藥物組合物，它含有有效量的前面所述的結合分子，以及藥學上可接受的載體。在另一優選例中，所述的藥物組合物還含有有效量的其它抗流感藥物，選自烷胺類藥物或流感病毒神經氨酸酶抑制劑。在另一優選例中，所述的烷胺類藥物包括金剛烷胺或金剛乙胺；或所述的流感病毒神經氨酸酶抑制劑包括奧司他韋或扎那米韋。在本發明的另一方面，提供前面任一所述的結合分子的用途，用于制備鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒。在本發明的另一方面，提供一種預防、緩解或治療禽流感病毒感染的方法，所述的方法包括給予患者有效量的前面任一所述的結合分子。在本發明的另一方面，提供一種鑒定禽流感病毒的方法，所述方法包括將前面任一所述的結合分子與待檢測樣品接觸，觀察所述的結合分子與待檢測樣品的結合情況，若所述的結合分子與待檢測樣品發生結合，則該樣品中存在禽流感病毒。在本發明的另一方面，提供一種抗禽流感病毒的免疫原(疫苗)，其包含有一段能與前面任一所述的結合分子結合的抗原表位。在另一優選例中，所述的抗原表位包含以下位點相對于血球凝集素的氨基酸序列第121位的Ser ;和相對于血球凝 集素的氨基酸序列第162位的Arg。在另一優選例中，所述的抗原表位還包含以下位點相對于血球凝集素的氨基酸序列第117位的Ile ；相對于血球凝集素的氨基酸序列第118位的Ρι·ο ；相對于血球凝集素的氨基酸序列第161位的Lys ；相對于血球凝集素的氨基酸序列第164位的Tyr ;或相對于血球凝集素的氨基酸序列第167位的Thr。在另一優選例中，所述的免疫原不包括全長的禽流感H5N1病毒的血球凝集素。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖la、抗體表達載體的構建示意圖。其中，MT-P表示MT啟動子，Bip表示信號肽編碼區；VL_A表示輕鏈λ可變區；VL-k表示輕鏈K可變區；VH表示重鏈可變區；(Χ_λ I表示輕鏈λ I恒定區；CL-k I表示輕鏈K I恒定區；CH-Y I表示重鏈Y I恒定區；poly-A為含有表達腺嘌呤核苷酸鏈的序列。圖lb、SDS/PAGE電泳鑒定抗體的識別區域。圖lc、不同濃度的血凝素與抗體100F4、65C6和3C11的結合和游離曲線。圖2、65C6、100F4、3C11和TG15純化抗體的臺盼藍染色結果。其中，HC表示重鏈的條帶，LC表示輕鏈的條帶。
圖3、抗體100F4、65C6、3C11和TG15對19個所有H5N1和I個HlNl亞類的假病毒以及VSV-G包埋假病毒的中和活性測試的結果。以抗體TG15作為陰性對照。圖4、來自于野生型A/Shenzhen/406H/06與其兩株100F4逃逸株變體中H5HA蛋白序列的對比結果。圖5a-b、HPAI H5NlA/Shenzhen/406H/06病毒接種后的14天內小鼠的體重改變和
存活率。圖5c-d、HPAI H5N1 A/Cambodia/P0322095/05 病毒接種后的 14 天內小鼠的體重
改變和存活率。圖 6、感染 H5N1 A/Shenzhen/406H/06 和 HPAI H5N1 A/Cambodia/P0322095/054 天后的肺部組織進行病理切片。其中，a、給予15mg/kg 65C6抗體的經H5NlA/Shenzhen/406H/06感染的小鼠肺部組織病理切片；b、給予5mg/kg 65C6抗體的經H5NlA/Shenzhen/406H/06感染的小鼠肺部組織病理切片；C、給予lmg/kg 65C6抗體的經H5NlA/Shenzhen/406H/06感染的小鼠肺部組織病理切片；d、給予 15mg/kg TG15 抗體的經 H5N1A/Cambodia/P0322095/05 感染的小鼠肺部組織病理切片； e、給予 15mg/kg 65C6 抗體的經 H5N1A/Cambodia/P0322095/05 感染的小鼠肺部組織病理切片；f、給予 5mg/kg 65C6 抗體的經 H5N1A/Cambodia/P0322095/05 感染的小鼠肺部組織病理切片；g、給予 lmg/kg 65C6 抗體的經 H5N1A/Cambodia/P0322095/05 感染的小鼠肺部組織病理切片；h、給予 15mg/kg TG15 抗體的經 H5N1A/Cambodia/P0322095/05 感染的小鼠肺部組織病理切片。圖7a-b、HPAI H5NlA/Shenzhen/406H/06病毒接種后的14天內小鼠的體重改變和
存活率。圖 7c-d、HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05病毒接種后的14天內小鼠的體重改
變和存活率。圖 8a 和 C、感染 H5NlA/Shenzhen/406H/06 和 HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染后24小時經65C6抗體處理的小鼠組在感染4天后未出現任何明顯的炎癥反應。 圖 8b 和 d、感染 H5NlA/Shenzhen/406H/06 和 HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染后24小時經TG15抗體處理的小鼠在感染4天后出現明顯的肺部炎癥病理改變包括肺泡壁增厚、炎癥細胞浸潤和血管擴張充血。圖9、電鏡下觀察到的經負染的HA和抗體65C6的復合物及其示意圖。a、一個抗體與兩個HA分子形成的復合體b、一個抗體與兩個HA分子形成的復合體C、一個抗體與兩個HA分子形成的復合體
d、一個抗體與五個HA分子形成的復合體,五個HA分子C端連接形成Rossett結構，由此推測抗體65C6是結合在HA的N端；e、兩個抗體與兩個HA分子形成的復合體；每個抗體的Fab段與HA分子結合時都形成固定的105度的角度。圖10、涉及到中和表位的氨基酸。A、血球凝集素(HA)上23個單氨基酸的突變位點。這些單個氨基酸的突變能夠使釀酒酵母表面展示的帶有該單個氨基酸突變的血球凝集素的51-260個氨基酸的片段失去和抗體65C6的結合能力。而這其中有10個突變的氨基酸從血球凝集素的三維結構上看是埋在里面的，而另外13個突變的氨基酸是暴露在表面的。B、對13個單個氨基酸發生突變的HA形成的假病毒，要達到95%的中和效果所需要的抗體65C6的濃度以及相對于中和原始株抗體濃度增加的倍數。紅色所示為對單克隆抗體65C6的中和更加耐受的單個氨基酸的突變。C、通過酵母展示和假病毒中和試驗所鑒定出來的7個分別位于H5N1的7.1亞型的A/Beijing/01/03株的血球凝集素蛋白上117，118，121，161，162，164和167 (紅色所示)
位的氨基酸。D、從血球凝集素蛋白的三維結構上來看那7個氨基酸117，118，121，161，162，164和167 (紅色和藍色所示)相互挨在一起。E、比較抗體65C6中和7.1亞類的原始株和該株的5個單個氨基酸的突變以及5
個氨基酸的聯合突變的滴度。F、在假病毒中和實驗中，中和5個單個氨基酸的突變和5個氨基酸的聯合突變要達到80%的中和所需要的抗體65C6的濃度，以及相比之中和原始株病毒抗體濃度的增加倍數。紅色標記的為對抗體65C6中和耐受的單個氨基酸突變或者多個氨基酸的聯合突變。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，獲得含有獨特的CDR區的抗禽流感病毒的結合分子，所述的結合分子對于禽流感病毒具有良好的中和作用。本發明人還深入研究了其中一種結合分子在禽流感病毒血球凝集素(HA)上的結合位點，獲得了所述結合分子的中和表位。在此基礎上完成了本發明。結合分子本發明提供了能特異性結合禽流感病毒的結合分子。優選地，所述結合分子結合的是禽流感的H5N1病毒。本發明的結合分子呈現對于禽流感病毒良好的中和活性。本發明人應用高敏感的HA和NA假病毒篩選法及分子克隆技術，成功地從感染2. 3. 4亞亞分支H5N1病毒的恢復期病人的記憶性B細胞分離得到了三株人源的抗H5亞型禽流感病毒的單克隆抗體65C6U00F4和3C11。三株單克隆抗體都與HAl具有良好的親和力。其中，65C6U00F4能夠中和許多種(19中或更多)H5亞型的禽流感病毒，是廣譜的中和性抗體；3C11能夠中和4種或多于4種的H5亞型的禽流感病毒。本發明中較為優選的抗體是65C6抗體，其對幾乎所有的H5N1病毒的分支均有良好的中和能力并在動物體內有良好的預 防與治療的效果。電子顯微鏡及體外抗體篩選的實驗結果表明，65C6抗體結合在H5HA的頭部區域保守的抗原表位，且體外誘變實驗表明經11代的抗體篩選并沒有發現逃逸的突變株，可見65C6抗體所識別的保守中和表位位于HA的頭部區域且該表位在所有的H5N1中都很難發生突變。因此，一方面，65C6抗體單獨使用或與其它抗體或與小分子抑制劑聯合使用在治療H5N1各種分支引起的感染方面將有很大的潛力；另一方面，利用H5HA共同的中和表位作為免疫原有可能制備出針對所有H5N1分支的廣譜抗病毒抗體。本發明的結合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述結合分子可以是抗原結合片段，包括但不限于Fab、F(ab’ )、F(ab，)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈卩遼菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體以及至少含有足以賦予與禽流感病毒毒株的特異性抗原結合的免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。本發明還提供了所述的結合分子在制備預防、緩解和/或治療禽流感病毒感染的藥物中的應用。這種感染可以在小群體中發生，但是也可以以季節流行病方式在世界范圍傳播，或者更嚴重地在全球蔓延，數百萬個體處于危險之中。本發明提供了可以中和導致這種流行病以及潛在的全球性流行病的禽流感病毒毒株的感染的結合分子。本發明的結合分子可以大規模地制備和貯存，因為其提供了針對不同的流行性毒株的保護作用，且對于為將來可能發生的禽流感爆發做準備是有利的。根據本領域公知的技術，抗體的CDR區是免疫學感興趣的蛋白質的序列。在本發明的實施方案中，每一種結合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六個CDR區。優選地，本發明的結合分子包含本文揭示的至少兩個CDR。本發明還包括所述的結合分子的“功能變體”。如果變體能與親代結合分子(變異前的結合分子)競爭特異性結合禽流感病毒或其蛋白片段，則認為該變體分子是親代結合分子的功能變體。換句話說，所述功能變體仍能結合禽流感病毒的HAl蛋白或其片段，且與變異前的結合分子具有相同或相似的結合特性(例如，識別的抗原決定區域的相同的)。功能變體包括但不限于一級結構序列基本相似、但是含有例如在親代結合分子中未發現的體外或體內化學和/或生物化學修飾的衍生物。這種修飾包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共價附著、脂質或者脂質衍生物的共價附著、交聯、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。換句話說，親代結合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或者含有所述氨基酸序列的所述結合分子的結合特性，即所述結合分子仍能識別并結合其靶位。所述功能變體可以具有保守序列修飾，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領域己知的標準技術導入，例如定向誘變和隨機PCR介導的誘變，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基由具有相似結構或者化學性質的另一氨基酸殘基置換的取代。具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族己經在本領域中限定。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性側鏈氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支側鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香側鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領域技術人員明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸殘基家族分類方式。另外，變體可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同結構或者化學性質的另一氨基酸殘基置換。相似的小變異也可包括氨基酸缺失和/或插入。使用本領域熟知的計算機程序可以發現確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫學活性的指導。此外，功能變體可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者這兩端的截短體。本發明的功能變體與親代結合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的結合親和性，但是仍能結合禽流感病毒或其片段。例如，本發明的功能變體與親代結合分子相比對于禽流感病毒H5亞型病毒的HAl或其片段可具有增加或降低的結合親和性。在本發明范圍內的功能變體與本文所述親代結合分子具有至少大約50%至大約99%、優選至少大約60%至大約99%、更優選至少大約70%至大約99%、甚至更優選至少大約80%至大約99%、最優選至少大約90%至大約99%、特別是至少大約95%至大約99%，以及特別是至少大約97%至大約99%的氨基酸序列同源性。本領域技術人員已知的計算機算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以進行對比以及明確相似或相同的氨基酸殘基。功能變體可以通過使用本領域已知的普通分子生物學方法改變親代結合分子或其一部分而獲得，所述方法包括但不限于易錯PCR、寡核苷酸指導的誘變、定點誘變以及重鏈和/或輕鏈改組法。因此，應理解，當使用術語(人)結合分子時，其也涵蓋所述(人)結合分子的功能變體。結合分子的抗原結合特性通常由位于重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱為互補決定區(complementarity determining region, CDR),所述的CDR區將可變區間隔成4個框架區域(FR)，4個FR的氨基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些⑶R形成環狀結構，通過其間的FR形成的β折疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的⑶R和相應輕鏈上的CDR構成了結合分子的抗原結合位點。可以通過比較同類型的結合分子的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構成了 FR或CDR區域。較佳地，所述的取代、插入或者缺失可以發生在CDR區以外的區域，例如抗體重鏈或輕鏈的FR區上；由于FR區不參與與抗原的直接結合，該區的適當變化是可以的。
作為本發明的優選方式，所述的結合分子是單克隆抗體，其包括人源的恒定區(如人源恒定區IgH序列和IgKappa序列)。所述的抗禽流感病毒單克隆抗體的重鏈可變區、輕鏈可變區以及位于重鏈可變區和輕鏈可變區的互補決定區(CDR)均具有獨特的不同于現有技術的結構，且它們是全人源的。作為本發明的優選方式，本發明包括具有所述單克隆抗體的相應氨基酸序列的單克隆抗體，具有所述單克隆抗體可變區鏈的單克隆抗體。本發明還包括具有含所述的互補決定區(CDR)的輕鏈和重鏈的任何抗體，以及CDR區與本發明的單克隆抗體的CDR具有90%以上(更佳地95%以上)的同源性的任何抗體。經驗證，本發明的抗禽流感病毒單克隆抗體的CDR區是全新的，其針對的是一個獨特的禽流感病毒HAl蛋白上的抗原表位，技術構思不同于現有的抗禽流感病毒抗體。本發明的單克隆抗體可以是全人源的，其重鏈、輕鏈可變區以及恒定區均來源于人抗體。因此，其在具有特別優異的識別和中和禽流感病毒的作用的同時，還具有免疫原性低、安全性高的特點。另一方面，本發明包括免疫綴合物，即包含本發明所述至少一個結合分子以及進一步包含至少一個其它治療分子、治療劑或可檢測物質。適于治療和/或預防的標記可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增強吞噬作用或者免疫刺激作用的其它結合分子。包含可檢測物質的免疫綴合物可診斷性地用于例如評定對象是否已經感染禽流感病毒毒株或者作為臨床實驗程序的一部分監測禽流感病毒感染的發生或進展以例如確定指定治療方案的功效。然而，它們也可以用于其它檢測和/或分析和/或診斷目的。可檢測的部分/物質包括但不限于酶、輔基、熒光材料、發光材料，生物發光材料、放射性材料、正電子發射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。為了檢測和/或分析和/或診斷目的用于標記單克隆抗體的標記依賴于使用的特定檢測/分析/診斷技術和/或方法例如免疫組織化學染色(組織)樣品、流式細胞計量術、激光掃描細胞計量術檢測、熒光免疫測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、生物測定(例如吞噬作用測定)、蛋白質印跡應用等。對于本領域已知的檢測/分析/診斷技術和/或方法合適的標記為本領域技術人員所熟知。本發明的結合分子可以與一或多個抗原綴合/附著。優選地，這些抗原是由給予了結合分子-抗原綴合物的對象的免疫系統識別的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附著抗原和結合分子的綴合方法為本領域所熟知，包括但不限于使用交聯劑。除了通過直接或間接(例如通過接頭)綴合而化學產生免疫綴合物之外，所述免疫綴合物可以作為融合蛋白而產生，所述融合蛋白包含本發明的結合分子及合適的治療分子、治療劑或可檢測物質。融合蛋白可以通過本領域已知方法產生，例如通過構建核酸分子以及隨后表達所述核酸分子而重組產生，所述核酸分子包含符合讀框的編碼結合分子的核苷酸序列以及編碼合適標記的 核苷酸序列。本發明另一方面提供了編碼本發明的至少一種結合分子、其功能變體或者免疫綴合物的核酸分子。這種核酸分子可以用作中間物以進行克隆。在一個優選的實施方案中，所述核酸分子是分離或純化的。DNA分子的序列可以用常規技術，或利用雜交瘤技術獲得。本領域技術人員可以理解，這些核酸分子的變體也是本發明的一部分。核酸分子的變體是這樣的核酸序列，通過使用標準遺傳密碼可以將其直接翻譯以提供與從親代核酸分子中翻譯的序列相同的氨基酸序列。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明的結合分子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明的結合分子的序列中。本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。優選的，本發明的載體是例如含病毒啟動子的質粒表達載體，且在所述表達載體中分別插入了抗禽流感病毒結合分子重鏈可變區(VH)與恒定區的IgH (來自人源IgH的恒定區)融合序列和輕鏈可變區VL與人體Ig kappa(來自人源Ig kappa的恒定區)融合序列。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有細菌細胞如大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9 ;動物細胞如CH0、C0S7、NS0或Bowes黑素瘤細胞等。特別適用于本發明的宿主細胞是真核宿主細胞，如果蠅S2細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，或常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的結合分子。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。本發明的結合分子也可以在轉基因非人哺乳動物如兔、山羊或者牛中產生，并且分泌進例如其乳中。中和表位

本發明人的深入研究發現，本發明的一種中和分子(65C6)能夠識別一個位于HA上遠膜區的球形末端上保守的中和表位，該抗體可以很好地中H5N1病毒。因此，可以設計基于抗體65C6的表位的免疫原,從而誘導出可以中和各種(亞)型的H5N1病毒的免疫反應。所述的免疫原較好地包含以下抗原表位相對于血球凝集素的氨基酸序列第121位的Ser ;和相對于血球凝集素的氨基酸序列第162位的Arg，上述表位是與所述結合分子結合的表位。所述的免疫原更好地還包含以下抗原表位相對于血球凝集素的氨基酸序列第117位的Ile ;相對于血球凝集素的氨基酸序列第118位的Pio ;相對于血球凝集素的氨基酸序列第161位的Lys ;相對于血球凝集素的氨基酸序列第164位的Tyr ;或相對于血球凝集素的氨基酸序列第167位的Thr。基于上述所示的表位可設計出合適的免疫原，以誘導產生一些新的廣譜中和性結合分子(如抗體)。所述的免疫原的設計可以參照本領域已知的一些技術，其原則是將上述的中和性表位暴露于其空間結構的表面上。藥物組合物本發明的結合分子可用于制備抑制禽流感病毒的組合物。基于本發明的新發現，還提供了一種可抑制禽流感病毒或禽流感病毒感染相關疾病的組合物，其包含有效量的本發明所述的結合分子；以及藥學上可接受的載體。本文所用的術語“藥學上可接受的”是指當分子本體和組合物適當地給予動物或人時，它們不會產生不利的、過敏的或其它不良反應。本文所用的“藥學上可接受的載體”應當與本發明的結合分子相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低組合物的效果O可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween ;潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。本發明的組合物可根據需要制成各種劑型，并可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以采用注射或其它治療方式。本發明的結合分子可以以未分離的或者分離的形式使用。此外，本發明的結合分子可以單獨應用或者于包含至少一種本發明的結合分子(或其變體或片段)的混合物中應用。換句話說，所述結合分子可以組合應用，例如作為包含兩或更多種本發明的結合分子、其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補活性的結合分子可以組合在一個治療方案中以達到希望的預防、治療或診斷作用，但是或者也可以將具有相同活性的結合分子組合在一個治療方案中以達到希望的預防、治療或診斷作用。任選地，所述混合物進一步包含至少一種其它治療劑。所述藥物組合物可包含兩或多個對于禽流感病毒具有中和活性的結合分子。在一個實施方案中，當組合應用時，所述結合分子呈現協同中和活性。換句話說，所述組合物包含至少兩種具有中和活性的結合分子，特征在于所述結合分子在中和禽流感病毒中起協同作用。如本文所用，術語“協同”是指當組合應用時，結合分子的組合作用高于單獨應用時的加合作用。所述協同作用的結合分子可以結合禽流感病毒的相同或不同片段上的不同結構。計算協同作用的方式是通過組合指數計算。組合指數(Cl)的概念己經由Chou andTalalay(1984)描述。所述組合物也可包含具有中和活性的一種結合分子以及一種非中和性禽流感病毒特異性結合分子。所述非中和性及中和性禽流感病毒特異性結合分子在中和禽流感病毒H5亞型中也可以協同作用。本發明的結合分子或藥物組合在用于人體之前可以在合適的動物模型系統中檢測。這種動物模型系統包括但不限于小鼠、雪貂(ferret)和猴。本發明的結合分子還可與其它抗流感病毒的藥物聯合用藥，所述的抗流感藥物例如但不限于烷胺類藥物(金剛烷胺和金剛乙胺)；2)流感病毒神經氨酸酶抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)。因此本發明還提供了包含本發明的結合分子以及上述抗流感藥物的藥物組合物。可以調整給藥方案以提供最佳的所需應答(例如治療應答)。合適的劑量范圍可例如是O. 01-500mg/kg體重,優選O. l_50mg/kg體重。此外,例如可以給予一次推注、隨時間給予多次分開劑量或者根據治療情況的緊急性而可以按比例降低或增加劑量。本發明的分子和組合物優選是無菌的。使得這些分子和組合物無菌的方法為本領域所熟知。用于診斷、預防和/或治療的其它分子可以以與本發明的結合分子相似的給藥方案給予。如果單獨給予其它分子，則可以在給予本發明的一或多種人結合分子或藥物組合物之前、同時或者之后給予患者。對于人患者的精確給藥方案通常在臨床實驗期間挑選出。檢測試劑和試劑盒本發明的結合分子可用于制備檢測流感病毒的試劑或試劑盒。如本文所用，術語“待檢測樣品”或“待測樣品”涵蓋了多種樣品類型，包括生物學來源的血液及其它體液樣品，實體組織樣品如活檢組織樣品或者組織培養物，或者衍生自其中的細胞或者其后代。該術語還包括在獲得后已經通過任何方式處理的樣品，例如用試劑處理、溶解、或者富集某些成分如蛋白質或者多核苷酸。該術語涵蓋了得自任何物種的各種臨床樣品，也包括培養的細胞、細胞上清和細胞溶解產物。以所述的結合分子為基礎，可制備方便、快速且準確地檢測禽流感病毒(如H5N1)的試劑盒。因此，本發明提供了一種用于檢測樣品中是否存在禽流感病毒的檢測試劑盒，該試劑盒中含有本發明的結合分子。在獲得了本發明提供的結合分子后，可以方便地制備出用于特異性檢測禽流感病毒的檢測試劑盒。作為本發明的一種檢測方式，采用間接ELISA法，將待測的抗原包被于固相載體上，利用本發明的結合分子進行檢測。 作為本發明的一種優選方式，所述的結合分子是抗體，可根據雙抗夾心法的原理來檢測。雙抗夾心法常規的做法是將一抗(如本發明的單克隆抗體)固定于載體，然后使一抗與抗原反應，洗滌后再與二抗反應(所述的二抗攜帶可檢測信號，或可與攜帶可檢測信號的物質結合)，最后進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。雙抗夾心法特別適用于具有兩個或兩個以上表位的抗原的檢測。為了在檢測時更方便，所述試劑盒中除了含有本發明的結合分子以外，還可以包含其它檢測試劑或輔助試劑，所述的輔助試劑例如是ELISA試劑盒中常規使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領域技術人員所熟知的，如顯色劑、標記物、二抗、抗抗體、增敏劑等。本領域人員應理解，各種變化形式的檢測試劑盒均是包含在本發明中的，只要在其中利用了本發明的結合分子作為識別禽流感病毒的試劑。此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方法。在獲得了本發明提供的結合分子和/或試劑盒后，可以利用多種免疫學相關方法來檢測樣品中HA蛋白或其含量，從而得知待測樣品的供體是否感染禽流感病毒，這些方法均被包含在本發明中。較佳地，所述的方法是以非疾病診斷為目的的。作為一種優選方式，本發明提供一種體外(非診斷或治療性地)檢測禽流感病毒的方法，包括以下步驟(al)將待測樣品包被于固相載體；(a2)將本發明的結合分子加樣于(al)的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒與結合分子結合，形成帶有“禽流感病毒-本發明的結合分子” 二元復合物的固相載體；(a3)將特異性結合本發明的結合分子的檢測物加樣于(a2)的固相載體，形成帶有“禽流感病毒-本發明的結合分子-檢測物”三元復合物的固相載體；所述的檢測物上攜帶一標記物；(a4)檢測三元復合物中的標記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒的存在與否以或存在的量。按照上述方法，只要設置已知濃度的抗原對照，制作濃度標準曲線，通過比照濃度標準曲線就可以得出待測樣品中的流感病毒含量。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行·定義，·文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。1.方法材料人H5N1 病例該深圳病人于2006年6月被診斷出感染了高致病性H5N1禽流感病毒，通過輸入感染過高致病性H5N1禽流感病毒的康復期病人血漿，該病人被治愈了。血液樣品在該病人康復6個月后采集，通過Ficoll密度梯度離心，分離出外周血單核細胞。血漿和外周血單核細胞樣品于_80°C儲存31。動物實驗小鼠為6-8 周雌性 BALB/c 小鼠購自 Charles River Laboratories(L’ Arbresle, France)飼養在負壓,微生物隔離裝置中，空氣通過HEPA過濾裝置過濾。12小時光照和12小時黑暗周期。攻毒實驗在柬埔寨巴斯德研究所生物安全3級實驗室中進行。小鼠在接種前通過腹腔注射75mg/kg的戊巴比妥鈉先麻醉小鼠。細胞系培養病毒包裝細胞系293FT (購自InvitiOgen)的培養液為完全DMEM培養液[高糖，10%胎牛血清，2mM L-谷氨酸，I mM丙酮酸鈉，青霉素(100U/ml))和鏈霉素(100 μ g/ml) ；Invitrogen Life Technologies]含有 O. 5mg/ml of G418。MDCK 細胞(購自美國組織培養公司)的培養液為完全DMEM培養液，果蠅S2細胞(Invitrogen)的培養液為完全SFM含有10%(v/v)FBS，50U/ml青霉素，50 μ g/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酸]，S2細胞培養溫度為 28。。。病毒高致病性H5N1 病毒 A/Shenzhen/406H/06 和 A/Cambodia/P0322095/05 分別獲自深圳東湖醫院、柬埔寨巴斯德研究所。病毒在MDCK細胞中繁殖，含有病毒的上清最后分裝后儲存于_80°C 32。半數組織感染劑量的計算通過系列稀釋病毒，并感染MDCK細胞，通過Reed andMuench公式計算出半數組織感染劑量33。半數致死量的計算每組5只老鼠鼻腔滴注50ul的10倍系列稀釋的病毒，觀察14天，體重下降超過35%的老鼠被安樂死。最后通過Reed and Muench公式計算出半數致死量。所有高致病性H5N1禽流感病毒相關實驗都在生物安全3級實驗室中完成。HA/NA假病毒的制備H5病毒包括10個分枝以及5個分枝2的亞分枝，其中分枝O、1、2. 1、2. 2、2. 3和7分離自人，其余分離自禽類。構建密碼子優化的H5病毒和HlHA及flag標簽的NlNA的方法以及生產流感HA/NA假病毒的方法參考以前發表的文章中的描述34’35VSV-G包埋假病毒=VSV-G病毒包膜蛋白所包埋的假病毒，其包埋方法請參照Vaccine 27:6777-6790(2009)文章所述的方法。用于包裝HA和NA假病毒所用的HA基因的原始病毒株來源及其AccessionNumber見表I。HA是通過常規的合成方法獲得的。表I
權利要求
1.一種結合分子，其識別禽流感病毒的血球凝集素HAl，并結合于血球凝集素N端區域上的表位上，該表位包含以下位點 血球凝集素氨基酸序列第121位的Ser ;和 血球凝集素氨基酸序列第162位的Arg。
2.如權利要求1所述的結合分子，其特征在于，所述的表位還包含以下位點 血球凝集素氨基酸序列第117位的Ile ； 血球凝集素氨基酸序列第118位的Pro ； 血球凝集素氨基酸序列第161位的Lys ； 血球凝集素氨基酸序列第164位的Tyr ;或 血球凝集素氨基酸序列第167位的Thr。
3.如權利要求1所述的結合分子，其特征在于，所述結合分子包含SEQID N0:7所示的重鏈CDRl，SEQ ID NO:8所示的重鏈CDR2，SEQ ID NO:9所示的重鏈CDR3。
4.如權利要求1所述的結合分子，其特征在于，所述結合分子包含SEQID NO: 10所示的輕鏈CDR1, SEQ ID NO: 11所示的輕鏈CDR2，SEQ ID NO: 12所示的輕鏈CDR3。
5.如權利要求1所述的結合分子，其特征在于，所述結合分子包含SEQID N0:7所示的重鏈CDR1, SEQ ID NO: 8所示的重鏈CDR2，SEQ ID NO: 9所示的重鏈CDR3 ;以及SEQ IDNO: 10所示的輕鏈CDR1，SEQ ID NO: 11所示的輕鏈CDR2，SEQ ID NO: 12所示的輕鏈CDR3。
6.如權利要求1所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
7.如權利要求1所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
8.如權利要求1所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子包含 重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；以及 輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
9.如權利要求1所述的結合分子，其特征在于，所述結合分子包含SEQID NO: 13所示的重鏈CDR1，SEQ ID NO: 14所示的重鏈CDR2，SEQ ID NO: 15所示的重鏈CDR3 ;和/或 包含SEQ ID勵16所示的輕鏈0 1，SEQ ID NO: 17所示的輕鏈CDR2，SEQ ID NO: 18所示的輕鏈⑶R3。
10.如權利要求9所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
11.如權利要求9所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
12.如權利要求9所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子包含 重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列；以及 輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
13.如權利要求1所述的結合分子，其特征在于，所述結合分子包含SEQID N0:19所示的重鏈CDRl, SEQ ID NO: 20所示的重鏈CDR2，SEQ ID NO: 21所示的重鏈CDR3 ;和/或 包含 SEQ ID N0:22 所示的輕鏈 CDR1，SEQ ID NO:23 所示的輕鏈 CDR2，SEQ ID NO:24所示的輕鏈⑶R3。
14.如權利要求13所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列。
15.如權利要求13所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列。
16.如權利要求13所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子包含 重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列；以及 輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列。
17.如權利要求1-16任一所述的結合分子，其特征在于，所述的結合分子是人單克隆抗體、Fab、F(ab’ )、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區片段、單鏈抗體、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體； 優選的，所述的結合分子是人單克隆抗體； 更優選的，所述的人單克隆抗體其重鏈恒定區選擇下組中重鏈類型之一的恒定區IgGl, IgG2a、IgG2b和IgG3，和其輕鏈恒定區選擇下組輕鏈類型的恒定區之一 κ鏈和λ鏈； 更優選的，所述的人單克隆抗體其重鏈恒定區和輕鏈恒定區分別具有Genebank號ACK87036和ACK87038所示的氨基酸序列。
18.—種多核苷酸,其特征在于,它編碼權利要求1-17任一所述的結合分子。
19.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體中含有 編碼權利要求3-17任一所述的結合分子的重鏈的多核苷酸；和/或 編碼權利要求3-17任一所述的結合分子的輕鏈的多核苷酸。
20.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞中含有權利要求19所述的表達載體；或其基因組中整合有權利要求18所述的多核苷酸。
21.如權利要求20所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞是果蠅S2細胞。
22.權利要求1-17任一所述的結合分子的用途，用于制備預防、緩解或治療禽流感病毒感染的組合物。
23.如權利要求22所述的用途，其特征在于，所述的禽流感病毒是Η5亞型的病毒。
24.如權利要求23所述的用途，其特征在于，所述的禽流感病毒是Η5Ν1病毒。
25.一種藥物組合物，其特征在于，它含有有效量的權利要求1-17任一所述的合分子，以及藥學上可接受的載體。
26.如權利要求25所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物還含有有效量的其它抗流感藥物，選自烷胺類藥物或流感病毒神經氨酸酶抑制劑。
27.如權利要求26所述的藥物，其特征在于，所述的烷胺類藥物包括金剛烷胺或金剛乙胺；或 所述的流感病毒神經氨酸酶抑制劑包括奧司他韋或扎那米韋。
28.權利要求1-17任一所述的結合分子的用途，用于制備鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒。
29.一種預防、緩解或治療禽流感病毒感染的方法，其特征在于，所述的方法包括給予患者有效量的權利要求1-17任一所述的結合分子。
30.一種鑒定禽流感病毒的方法，所述方法包括將權利要求1-17任一所述的結合分子與待檢測樣品接觸，觀察所述的結合分子與待檢測樣品的結合情況，若所述的結合分子與待檢測樣品發生結合，則該樣品中存在禽流感病毒。
31.一種抗禽流感病毒的免疫原，其包含有一段能與權利要求1-17任一所述的結合分子結合的抗原表位。
32.如權利要求31所述的免疫原，其特征在于，所述的抗原表位包含 相對于血球凝集素的氨基酸序列第121位的Ser ;和 相對于血球凝集素的氨基酸序列第162位的Arg。
33.如權利要求32所述的免疫原，其特征在于，所述的抗原表位還包含 相對于血球凝集素的氨基酸序列第117位的Ile ； 相對于血球凝集素的氨基酸序列第118位的Ρι·ο ； 相對于血球凝集素的氨基酸序列第161位的Lys ； 相對于血球凝集素的氨基酸序列第164位的Tyr ;或 相對于血球凝集素的氨基酸序列第167位的Thr。
全文摘要
本發明涉及高致病性禽流感的中和分子及其制備方法。公開了新的抗禽流感病毒的中和分子，所述的中和分子對于禽流感病毒具有良好的中和作用；還公開了所述結合分子在禽流感病毒血球凝集素上的結合位點。
文檔編號A61K39/42GK103030693SQ201210376959
公開日2013年4月10日 申請日期2012年9月28日 優先權日2011年9月30日
發明者周保羅, 胡紅星, 周伯平 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所, 深圳市第三人民醫院