專利名稱：：高致病性禽流感病毒h5n1-ha基因的改造及其重組腺相關(guān)病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種禽流感病毒重組疫苗，具體而言本發(fā)明提供了改造優(yōu)化的H5m-HA基因，以及在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的禽流感病毒H5m的重組疫苗，即含上述兩種基因的重組腺病毒及重組腺相關(guān)病毒的疫苗。
背景技術(shù)：
：禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)屬于正粘病毒科、流感病毒屬、甲型流感病毒。自然宿主是禽類，對(duì)人存在種屬屏障。1997年首次在香港報(bào)道的人感染禽流感病毒H5W中，18例感染者中有6例死亡。之后病毒感染人數(shù)和傳播范圍不斷擴(kuò)大，截至2009年9月24日，WHO確證了15個(gè)國(guó)家的人感染H5m病例共442例，其中死亡262例。我國(guó)確診感染38例，死亡25例。雖然感染人數(shù)在過去幾年里總量相對(duì)較低，但不可忽視的是，病毒的致死性仍大于50%。此外，雖然目前僅在少數(shù)幾個(gè)國(guó)家發(fā)現(xiàn)病毒在家族內(nèi)部有限的人傳人傳播，但是禽流感病毒H5W近幾年表現(xiàn)出來的基因快速進(jìn)化和毒力時(shí)有改變，以及在野生鳥類和家禽中持續(xù)傳播，提示病毒對(duì)人們健康的威脅不斷增大。疫苗一直是抵御病毒感染的最主要的防線之一。病毒的血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)在病毒吸附及穿膜過程中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，HA可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，是AIV中最為重要的保護(hù)性抗原。因而，HA—向是禽流感疫苗研制的熱點(diǎn)。另外，國(guó)外的禽流感H5m疫苗相關(guān)研究大多是以歐美的流行株為基礎(chǔ)的。由于流感病毒的高變異性，不同流行株疫苗之間的交叉反應(yīng)有限，因此本發(fā)明選擇我國(guó)有代表性的禽流感病毒流行株A/Anhui/1/2005的HA基因(GI:87137936)。腺病毒載體具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)宿主范圍廣范，對(duì)人類致病性低；(2)可感染分裂期及靜止期細(xì)胞并表達(dá)外源基因；(3)復(fù)制效率高，可達(dá)到很高的滴度；(4)外源基因容量大；(5)外源基因產(chǎn)物可進(jìn)行正確的折疊及翻譯后加工；(6)不會(huì)產(chǎn)生插入突變，以染色體外形式存在；(7)可同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因。腺病毒載體在疫苗方面的應(yīng)用中，以同時(shí)能夠誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫為特點(diǎn)。因此，我們考慮將AdV載體和HA基因聯(lián)合起來同時(shí)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫。我們參照人的優(yōu)勢(shì)密碼子使用原則對(duì)HA基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化，明顯提高了HA抗原的表達(dá)量，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了AdV疫苗。此外，腺相關(guān)病毒(Adeno-associatedVirus,AAV)載體因其本身的特點(diǎn)也越來越受人矚目。AAV是一種復(fù)制缺陷型病毒，在正常細(xì)胞中并不發(fā)生產(chǎn)毒性感染，只有在與輔助病毒共同感染時(shí)才發(fā)生產(chǎn)毒性感染。與其他病毒載體相比，這類載體更象DNA載體載體中不含任何AAV的結(jié)構(gòu)基因，載體基因組中含有的唯一病毒序列是非編碼的反向末端重復(fù)序列(ITR)。因而轉(zhuǎn)導(dǎo)后不合成天然的病毒蛋白，確保免疫反應(yīng)主要由轉(zhuǎn)移基因引起。另外，AAV載體還具有以下優(yōu)點(diǎn)①安全性好，在臨床前動(dòng)物模型及人體臨床試驗(yàn)研究已經(jīng)多年；②宿主范圍廣，不僅可以轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞，而且可以轉(zhuǎn)染靜止期細(xì)胞；③可長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。AAV載體在疫苗方面的應(yīng)用中，在刺激機(jī)體的體液免疫應(yīng)答方面已經(jīng)表現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已證明多種病毒基因的AAV載體疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更高的和更持久的抗體反應(yīng)。而HA抗原的特點(diǎn)就是能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗原。鑒于此，我們也考慮將AAV載體和HA基因聯(lián)合來增強(qiáng)疫苗的體液免疫效果。我們?cè)趯?duì)HA基因進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，又對(duì)HA蛋白裂解位點(diǎn)附近的核苷酸序列進(jìn)行改造來減少連續(xù)的堿性氨基酸，從而降低HA抗原的細(xì)胞毒性和增加HA疫苗的安全性，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了AAV疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供人用的重組禽流感病毒疫苗。另外，研究發(fā)現(xiàn)，HA首先是作為單一多肽(HAO)被合成，HAO裂解成HAl和HA2是禽、流感病毒感染的先決條件(KlenkHD,RottR,OrlichM,etal.ActivationofinfluenzaAvirusesbytrypsintreatment.Virology，1975，68:426_439·)。HA對(duì)細(xì)胞蛋白酶的易感性和這些酶在宿主組織里的分布是病毒泛嗜性的決定因素。低致病力毒株由于HAO裂解位點(diǎn)的氨基酸缺乏精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸的重復(fù)，切割率極低，不易裂解。而禽流感病毒H5W的HAO裂解位點(diǎn)含有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，導(dǎo)致可裂解它的蛋白酶種類更多，從而致病性更強(qiáng)。此外，裂解位點(diǎn)的多個(gè)連續(xù)堿性氨基酸殘基還給常規(guī)的雞胚生產(chǎn)疫苗方式帶來困難。基于以上的考慮，本發(fā)明人通過常規(guī)的反向遺傳學(xué)技術(shù)，對(duì)來自禽流感病毒H5W的HA裂解位點(diǎn)進(jìn)行了改造。因此，本發(fā)明對(duì)經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的HA基因進(jìn)行了改造。一方面，本發(fā)明提供了一種改造后的優(yōu)化的禽流感病毒HA基因，其編碼氨基酸序列中裂解位點(diǎn)附近的連續(xù)堿性氨基酸殘基數(shù)目減少，減小了表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述改造后的優(yōu)化的禽流感病毒HA基因的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。將改造后的優(yōu)化HA基因轉(zhuǎn)染到BHK細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改造后的優(yōu)化的HA基因仍可有效表達(dá)蛋白，與單純優(yōu)化的HA基因相比，切割位點(diǎn)的改造未對(duì)蛋白表達(dá)量造成明顯影響。另一方面，本發(fā)明還提供了另一種用于防治高致病性禽流感病毒的疫苗組合物，其中含有本發(fā)明所述的重組腺相關(guān)病毒和一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體和/或佐劑，該重組腺相關(guān)病毒包含腺相關(guān)病毒載體和經(jīng)過改造后的優(yōu)化的禽流感病毒HA基因。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的腺相關(guān)病毒載體為AAV-1，所述的改造后的優(yōu)化的禽流感病毒HA基因具有如SEQIDNO2所示的核苷酸序列。用本發(fā)明所述的含有改造后的禽流感病毒HA基因的重組腺相關(guān)病毒免疫小鼠后，通過血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)來監(jiān)測(cè)疫苗的中長(zhǎng)期體液免疫效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疫苗能夠激發(fā)較高的抗體水平，并且抗體維持較長(zhǎng)時(shí)間。(參見附圖3)另一方面，本發(fā)明還提供了所述改造優(yōu)化的HA基因在在制備用于防治高致病性禽流感病毒的藥物或疫苗組合物中的用途，其中所述高致病性禽流感病毒優(yōu)選為禽流感病毒H5m另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述的重組腺病毒及含有其的疫苗組合物在制備用于防治高致病性禽流感病毒的藥物中的用途。本發(fā)明中所述的涉及pDC315質(zhì)粒，用于重組AdV疫苗的包裝。該質(zhì)粒由MCMV啟動(dòng)子、SV40polyA翻譯終止信號(hào)、氨芐抗性基因、AdV相關(guān)序列及真核重組酶等元件組成，共3913bp。該載體和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxΔEl，3cre均是Microbix公司產(chǎn)品，兩者共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞后，可以得到含有目的基因的重組病毒。本發(fā)明中所述的還涉及pSNAV質(zhì)粒，用于重組AAV疫苗的包裝。該質(zhì)粒由CMV啟動(dòng)子、SV40polyA翻譯終止信號(hào)、氨芐抗性基因、新霉素抗性基因、原核細(xì)胞復(fù)制起點(diǎn)等常規(guī)元件組成，共7015bp。該載體是本元正陽(yáng)公司產(chǎn)品。該載體可采用新霉素抗性基因來篩選長(zhǎng)期表達(dá)目的基因的真核細(xì)胞克隆。再通過輔助病毒HSV感染的方式，得到含有目的基因的重組病毒。圖1為含有優(yōu)化型HA基因的重組AdV疫苗肌肉免疫BALB/c小鼠后用HI方法檢測(cè)體液免疫結(jié)果。圖中各點(diǎn)用HI滴度log2的均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖2為含有優(yōu)化型HA基因的重組AdV疫苗肌肉免疫BALB/c小鼠后用ELISPOT方法檢測(cè)細(xì)胞免疫結(jié)果。圖中各點(diǎn)用IXIO6脾細(xì)胞中斑點(diǎn)數(shù)的均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖3所示的是含有改造后優(yōu)化型HA基因的重組AAV疫苗肌肉免疫BALB/c小鼠后HI滴度的監(jiān)測(cè)結(jié)果。圖中各點(diǎn)用HI滴度log2的均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)之處在于1.疫苗毒株的選擇國(guó)外的禽流感H5W疫苗相關(guān)研究大多是以歐美的流行株為基礎(chǔ)的。由于流感病毒的高變異性，不同流行株疫苗之間的交叉反應(yīng)有限，因此本發(fā)明選擇我國(guó)有代表性的禽流感病毒流行株A/Anhui/1/2005為疫苗株，該毒株是WHO推薦的唯一來自國(guó)內(nèi)的高致病性禽流感H5W疫苗株。2.HA基因的優(yōu)化本發(fā)明對(duì)!《^(Α/ΑηΙη/ΛΟΟδ)的HA基因(GI=87137936)全長(zhǎng)編碼區(qū)的核苷酸序列參照人的優(yōu)勢(shì)密碼子使用原則進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)證明，優(yōu)化后的HA基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)量明顯提高，并成功包裝出重組AdV病毒。3.含優(yōu)化型HA基因的AdV疫苗，能夠同時(shí)激發(fā)出較高的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。4.HA裂解位點(diǎn)的改造本發(fā)明對(duì)H5m(A/Anhui/1/2005)的HA蛋白裂解位點(diǎn)及其附近的核苷酸序列進(jìn)行改造，來減少連續(xù)的堿性氨基酸，實(shí)驗(yàn)證明，改造后的HA基因能夠在真核細(xì)胞中高效表達(dá)，并成功包裝出AAV重組病毒。5.由改造后的HA基因構(gòu)建的AAV疫苗，能夠激發(fā)出較高效和持久的體液免疫應(yīng)答。除另有說明外，本申請(qǐng)中的所有科技術(shù)語(yǔ)的都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本申請(qǐng)中描述類似或等同的方法及材料都可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但是下文仍還是對(duì)合適的方法和材料進(jìn)行了描述。本申請(qǐng)中引用的全部出版物、專利申請(qǐng)、專利及其他參考文獻(xiàn)其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。如有抵觸，包括定義，以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方式，而決不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行改動(dòng)得到的技術(shù)方案都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。實(shí)施例在本申請(qǐng)中，如無(wú)特別說明，本發(fā)明的實(shí)施都使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有詳細(xì)地描述Sambrook等人編著的MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(1989)；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins編著，1984)；TranscriptionandTranslation(B.D.Hames禾口S.J.Higgins編著，1984)；ImmnochemicalMethodsinCellAndMolecularBiology(AcademicPress,London)。實(shí)施例IHA基因的優(yōu)化1.1HA基因的優(yōu)化參照人的優(yōu)勢(shì)密碼子使用原則(http://www.kazusa.or.ip/codon/),在不改變氨基酸序列的前提下，對(duì)H5m(A/Anhui/1/2005)(參見,ShuYL,YuHJ,LiDX.LethalavianinfluenzaA(H5N1)infectioninapregnantwomaninAnhuiProvince,China.NEnglJMed2006；354(13)-.1421-1422.)的HA基因全長(zhǎng)編碼區(qū)核苷酸序列(1704bp)(GI=87137936)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后利用軟件核查設(shè)計(jì)的序列氨基酸序列比對(duì)一致，并確認(rèn)序列中不含有克隆需要的酶切位點(diǎn)(EcoRI和BamHI)。將最終序列委托北京利嘉富誠(chéng)生物技術(shù)有限公司合成。經(jīng)TaKaRa公司測(cè)序驗(yàn)證正確，最終得到優(yōu)化后的HA基因序列，命名為Mod.HA，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。1.2將船(1.擬基因克隆入？0〇315載體用EcoRI和BamHI雙酶切含Mod.HA基因的質(zhì)粒和pDC315質(zhì)粒(購(gòu)自Microbix公司)，回收1.7kb左右Mod.HA片段和3.9kb左右的線性化pDC315片段，將二者連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定得到含Mod.HA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，命名為pDC315-Mod.HA。1.3質(zhì)粒pDC315-Mod.HA的體外表達(dá)鑒定293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照4XIO5/孔的細(xì)胞量將其接種到六孔板中，每孔含2ml細(xì)胞懸液，在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使其密度達(dá)到70%-90%。按照FuGENEHD(購(gòu)自羅氏公司)的說明書，將質(zhì)粒pDC315_Mod.HA和含有野生型HA基因(Wt.HA)的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的量分別是2yg和6μ1。轉(zhuǎn)染后48-72h，收獲細(xì)胞。每孔細(xì)胞加入100μ1的細(xì)胞裂解液(Tris-Cl50mMpH8.0，NaCl150mM,SDS0.1%，NP-401%，去氧膽酸鈉0.5%，抑肽酶1μg/ml，苯甲基磺酰氟(PMSF)100μg/ml(臨用前加入))冰上5-lOmin裂解細(xì)胞，12000r/min離心5min后，取上清加1/2體積的3X加樣緩沖液，沸水中煮5-lOmin。取20μ1進(jìn)行12%SDS-APGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜后，使用兔抗H5W全病毒多抗(國(guó)家流感中心制備，11000稀釋)和兔抗β-actin多抗(博奧森生物技術(shù)有限公司，1300稀釋)為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體(12000稀釋)為二抗，DAB顯色。Westernblotting方法來檢測(cè)和比較HA蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，Wt.HA和Mod.HA基因均可檢測(cè)到HA蛋白條帶(包括HAO和HAl條帶)。將Westernblotting結(jié)果掃描后使用TotalLab1.0軟件進(jìn)行分析，用β-actin的條帶進(jìn)行上樣量的校準(zhǔn)后發(fā)現(xiàn)，Mod.HA基因比Wt.HA基因的表達(dá)量提高了約50倍。說明Mod.HA基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)量明顯提高。實(shí)施例2含Mod.HA基因的重組AdV病毒的獲得構(gòu)建含優(yōu)化型HA基因的重組AdV病毒。2.1含Mod.HA基因的重組AdV病毒的包裝將293細(xì)胞按照4XIO5/孔接種細(xì)胞到六孔板中，每孔含2ml細(xì)胞懸液，在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使其密度達(dá)到70%-90%以上。按照FuGENEHD(購(gòu)自羅氏公司)的說明書，將上述1.2中制備的質(zhì)粒pDC315-Mod.HA和骨架質(zhì)粒pBHGloxAEl，3Cre(購(gòu)自Microbix公司)各2μg和轉(zhuǎn)染試劑12μ1共轉(zhuǎn)染每一孔細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后7_10天，收獲細(xì)胞。在-80°C和37°C條件下反復(fù)凍融3次。離心后收集上清。取少量上清再感染293細(xì)胞，觀察細(xì)胞出現(xiàn)病變，確認(rèn)獲得重組病毒。2.2重組AdV病毒的鑒定PCR檢測(cè)Mod.HA基因的插入，PCR檢測(cè)上游引物5‘-GAATTCGCCGCCACCATGAACCCCAACCAG-3‘，下游引物5‘-GTCGACTTATCACTTGTCGATGGTGAAGG-3‘，擴(kuò)增的片段大小約1.7kb。同時(shí)，取部分病毒感染293細(xì)胞，至細(xì)胞幾乎完全病變時(shí)收獲。細(xì)胞的裂解方法同實(shí)施例1中所述。Westernbloting鑒定Mod.HA基因的表達(dá)，使用兔抗H5m全病毒多抗(11000稀釋)，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔多抗(11000稀釋)為二抗，BCIP/NBT顯色。結(jié)果顯示，包裝出的重組AdV病毒PCR能夠擴(kuò)增出約1.7kb的Mod.HA目的基因條帶；westernblotting能夠檢測(cè)到HA蛋白(包括HAO和HAl)表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)說明，我們獲得了含有含優(yōu)化后HA基因的AdV重組病毒，命名為rAdV-Mod.HA。實(shí)施例3重組病毒rAdV-Mod.HA免疫小鼠實(shí)驗(yàn)3.1小鼠免疫和分組BALB/c小鼠隨機(jī)分成2組，每組8只，在第0天和第28天免疫兩次，肌肉注射。第35天檢測(cè)免疫反應(yīng)。具體免疫內(nèi)容和劑量見表1。表1小鼠分組和免疫劑量組別名稱免疫內(nèi)容和劑量1PBSPBS，100μ1/次2AdVrAdV-Mod.HA,2.5xl08TCID50/100/xl/次3.2免疫小鼠中H5mHA體液免疫反應(yīng)的檢測(cè)初免后第35天采集小鼠的靜脈血，分離血清。參見人感染高致病性禽流感診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS284-2008)中的血凝抑制檢測(cè)，每份血清取10μ1，加入4倍體積(40μ1)的受體破壞酶(RDE)于37°C水浴中18h，然后再放入56°C水浴中30min滅活RDE。之后加濃馬紅血球去除血清中的非特異性凝集素，離心后，將上清倍比稀釋后依次加入96孔U型板，同時(shí)做陰性血清對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)診斷血清對(duì)照，然后每孔加入等體積滅活的流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)(來自國(guó)家流感中心)(含4個(gè)血凝單位)，混勻，室溫孵育60min。每孔再加入的馬紅細(xì)胞懸液，混勻后室溫孵育60min，觀察結(jié)果。將抑制紅細(xì)胞凝集出現(xiàn)時(shí)血清的最高稀釋度記為結(jié)果值。檢測(cè)結(jié)果見圖1。rAdV-Mod.HA疫苗的HI滴度的幾何均值達(dá)到1810。3.3免疫小鼠中Η5^ΗΑ細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測(cè)初免后第35天頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠脾臟，用淋巴細(xì)胞分離液分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)方法檢測(cè)分泌IFN-Y的T淋巴細(xì)胞，具體方法如下取50μ14X106/ml的小鼠脾淋巴細(xì)胞和等量的4μg/ml肽(HA526_543IGTYQILSIYSTVASSLA，是我們之前實(shí)驗(yàn)中篩得的反應(yīng)最好的肽段)加入已包被抗小鼠IFN-γ抗體并封閉過的ELISPOT板中，每只小鼠做復(fù)孔，另外，每只小鼠的陰性對(duì)照孔只加等量的細(xì)胞不加肽，陽(yáng)性對(duì)照孔加入細(xì)胞和終濃度為20μg/ml的刀豆蛋白(ConA)。37°C培養(yǎng)箱孵育3648h，棄掉培養(yǎng)液，PBST洗滌ELISPOT板后分別經(jīng)過生物素標(biāo)記的一抗和鏈霉親和素HRP的二抗進(jìn)行反應(yīng)，最后加入AEC顯色液顯色。檢測(cè)結(jié)果見圖2。rAdV-Mod.HA疫苗免疫后的1XIO6的小鼠脾淋巴細(xì)胞中細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)達(dá)到1750。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，rAdV-Mod.HA疫苗能在BALB/c小鼠體內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)較高的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。實(shí)施例4Mod.HA基因的改造為了進(jìn)一步降低HA蛋白的細(xì)胞毒性，增加疫苗的安全性，本實(shí)施例對(duì)Mod.HA核苷酸序列進(jìn)行改造，減少HA蛋白裂解位點(diǎn)及其附近的氨基酸序列中的連續(xù)的堿性氨基酸。4.1Mod.HA基因的改造將HA蛋白切割位點(diǎn)附近的氨基酸序列(PLRERRRKR丨GLF)通過缺失和點(diǎn)突變改造成為PQRETR丨GLF。相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列(5'-CTGAGAGAGAGAAGAAGAAAGAGA-3‘)改造成為(5‘-CAGAGAGAGACCAGA-3‘)。具體的改造包括9個(gè)核苷酸位點(diǎn)的缺失和3個(gè)核苷酸位點(diǎn)的點(diǎn)突變，委托上海生工完成。再由英駿公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，得到改造的優(yōu)化型HA基因，命名為ΔMod.HA，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。4.2ΔMod.HA基因構(gòu)建到pSNAV載體用EcoRI和SalI雙酶切含有AMod.HA基因的質(zhì)粒和pSNAV質(zhì)粒(購(gòu)自本元正陽(yáng)公司)，回收1.7kb的AMod.HA片段和7.Ikb的線性化pSNAV片段，將兩者連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切和測(cè)序鑒定后，得到構(gòu)建正確的pSNAV-ΔMod.HA質(zhì)粒。4.3質(zhì)粒pSNAV-ΔMod.HA的體外表達(dá)鑒定BHK細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前1天，將細(xì)胞按照4XIO5細(xì)胞/孔的量接種細(xì)胞到六孔板中，每孔含2ml2%胎牛血清的培養(yǎng)基。次日，細(xì)胞達(dá)到70-90%匯合度，按照FuGENEHD的說明書，將質(zhì)粒pSNAV-ΔMod.HAl.5μg和轉(zhuǎn)染試劑4μ1轉(zhuǎn)染1孔細(xì)胞。同時(shí)做Wt.HA和Mod.HA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染后72h，收獲細(xì)胞(具體操作同實(shí)施例1中所述)。Westernblotting鑒定分別使用兔抗H5W全病毒多抗(11000稀釋)及GAPDH單克隆抗體(購(gòu)自ProteinTech公司，內(nèi)參抗體，11000稀釋)為一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔多抗(11000稀釋)為二抗，BCIP/NBT顯色。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wt.HA、Mod.HA和ΔMod.HA基因均可檢測(cè)到HAO目的蛋白條帶(大小約75kD)，其中Mod.HA和AMod.HA基因還能夠檢測(cè)到HAl蛋白條帶(大小約50kD)，兩者表達(dá)HA水平相近，均明顯高于野生型HA基因的表達(dá)。說明AMod.HA基因能夠有效表達(dá)蛋白，切割位點(diǎn)的改造未對(duì)蛋白表達(dá)量造成明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明獲得的AMocLHA基因能夠在真核細(xì)胞中有效表達(dá)HA蛋白。實(shí)施例5含有AMod.HA基因的重組AAV病毒的獲得構(gòu)建含有改造后HA基因的重組AAV病毒。5.1質(zhì)粒pSNAV-ΔMod.HA壓BHK細(xì)胞系及篩選單克隆實(shí)驗(yàn)前1天，按照6.5XIO4細(xì)胞/孔的量接種BHK細(xì)胞到24孔板中，每孔含0.5ml2%胎牛血清的培養(yǎng)基。次日，細(xì)胞達(dá)到70-90%匯合度，按照FuGENEHD的說明書，將質(zhì)粒PSNAV-ΔMod.HAO.4μg和轉(zhuǎn)染試劑1.2μ1轉(zhuǎn)染1孔細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24h，補(bǔ)加G418至終濃度為800μg/ml。轉(zhuǎn)染后14天，收獲部分細(xì)胞進(jìn)行PCR檢測(cè)(具體方法同實(shí)施例2中所述)；同時(shí)取一部分細(xì)胞傳到六孔板，次日加丁酸鈉至終濃度為20mM，培養(yǎng)72h收獲細(xì)胞，做westernblotting檢測(cè)HA蛋白表達(dá)，具體操作同實(shí)施例1中所述。Westernblotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)細(xì)胞株(細(xì)胞株1和2)檢測(cè)到了與陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)粒pDC315-Mod.HA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的樣品)位置一致的HAO目的蛋白，說明篩選到表達(dá)HA蛋白的BHK細(xì)胞株。將細(xì)胞株1進(jìn)行單克隆篩選，使用96孔板有限稀釋的方法。具體來說，先在96孔板的每孔加入100μ1含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液，將消化后的細(xì)胞株1稀釋成103/ml的濃度，使用12孔排槍加入到96孔板的第1排中，每孔加入100μ1，混勻后再吸出100μ1細(xì)胞懸液加入第2排，依次加入到96孔的每一排，最后的100μ1懸液棄掉。37°C培養(yǎng)的第710天，取鏡下含單個(gè)細(xì)胞團(tuán)的孔進(jìn)行消化，放大到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，之后取部分細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定(操作同前)，同時(shí)取一部分細(xì)胞加丁酸鈉刺激，用免疫熒光法(細(xì)胞滴片后用丙酮固定，一抗使用兔抗流感病毒H5W多抗，1100稀釋，二抗使用FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗，1100稀釋)鑒定HA蛋白表達(dá)。根據(jù)免疫熒光的強(qiáng)弱，我們選擇了1C3強(qiáng)表達(dá)克隆進(jìn)行病毒包裝。5.2含有AMod.HA基因的重組AAV病毒包裝及鑒定使用HSV病毒感染含HA基因的細(xì)胞克隆1C3，獲得重組AAV病毒。提取病毒DNA，PCR擴(kuò)增方法來鑒定HA基因(具體操作同實(shí)施例2中所述)。另外，將病毒感染BHK細(xì)胞，加入丁酸鈉刺激基因表達(dá)，48-72h后做免疫熒光鑒定HA基因的表達(dá)(具體操作同本實(shí)施例5.1中所述)。結(jié)果證明重組病毒中的HA基因能夠有效表達(dá)目的蛋白。上述實(shí)驗(yàn)說明，我們獲得了含有AMod.HA基因的重組AAV病毒，命名為rAAV-ΔMod.HA。實(shí)施例6重組病毒rAAV-ΔMod.HA免疫小鼠實(shí)驗(yàn)6.1小鼠免疫和分組BALB/c小鼠隨機(jī)分成2組，每組8只，單次免疫，肌肉注射。具體免疫內(nèi)容和劑量見表2。表2小鼠分組和免疫劑量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>6.2免疫小鼠中Η5^ΗΑ體液免疫反應(yīng)的檢測(cè)初免后第28、42、56和70天從免疫小鼠的眼眶靜脈叢取少量血，分離血清。HI檢測(cè)方法同實(shí)施例3中所述。檢測(cè)結(jié)果見圖3。由圖可見，AAV疫苗在各檢測(cè)點(diǎn)的HI滴度均明顯高于PBS組。免疫后AAV疫苗的HI滴度緩慢升高，在免疫后第56天達(dá)到最高值640，之后有所下降，在70天時(shí)可檢測(cè)到HI滴度在190。所有檢測(cè)點(diǎn)的HI的幾何平均滴度均高于80。而研究認(rèn)為，季節(jié)性流感疫苗的HI滴度在40以上時(shí)即對(duì)免疫人群中的50%個(gè)體有保護(hù)作用。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，AAV-HA疫苗能在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗體水平和較長(zhǎng)時(shí)間的抗體反應(yīng)。序列表<110>曾毅馬晶張曉光<120>高致病性禽流感病毒H5m_HA基因的改造及其重組腺相關(guān)病毒疫苗<130><160>2<170>PatentInversion3.4<210>1<211>1704<212>DNA<213>人工合成<220><221>基因<222>(1)..(1704)<400>1atggagaagatcgtgctgctgctggctatcgtgagcctggtgaagagcgaccagatctgc60atcggataccacgctaacaacagcaccgagcaggtggacaccatcatggagaagaacgtg120accgtgacccacgctcaggacatcctggagaagacccacaacggaaagctgtgcgacctg180gacggagtgaagcctctgatcctgagagactgcagcgtggctggatggctgctgggaaac240cctatgtgcgacgagttcatcaacgtgcctgagtggagctacatcgtggagaaggctaac300cctgctaacgacctgtgctaccctggaaacttcaacgactacgaggagctgaagcacctg360ctgagcagaatcaaccacttcgagaagatccagatcatccctaagagcagctggagcgac420cacgaggctagcagcggagtgagcagcgcttgcccttaccagggaacccctagcttcttc480agaaacgtggtgtggctgatcaagaagaacaacacctaccctaccatcaagagaagctac540aacaacaccaaccaggaggacctgctgatcctgtggggaatccaccacagcaacgacgct600gctgagcagaccaagctgtaccagaaccctaccacctacatcagcgtgggaaccagcacc660ctgaaccagagactggtgcctaagatcgctaccagaagcaaggtgaacggacagagcgga720agaatggacttcttctggaccatcctgaagcctaacgacgctatcaacttcgagagcaac780ggaaacttcatcgctcctgagtacgcttacaagatcgtgaagaagggagacagcgctatc840gtgaagagcgaggtggagtacggaaactgcaacaccaagtgccagacccctatcggagct900atcaacagcagcatgcctttccacaacatccaccctctgaccatcggagagtgccctaag960tacgtgaagagcaacaagctggtgctggctaccggactgagaaacagccctctgagagag1020agaagaagaaagagaggactgttcggagctatcgctggattcatcgagggaggatggcag1080ggaatggtggacggatggtacggataccaccacagcaacgagcagggaagcggatacgct1140gctgacaaggagagcacccagaaggctatcgacggagtgaccaacaaggtgaacagcatc1200atcgacaagatgaacacccagttcgaggctgtgggaagagagttcaacaacctggagaga1260agaatcgagaacctgaacaagaagatggaggacggattcctggacgtgtggacctacaac1320gctgagctgctggtgctgatggagaacgagagaaccctggacttccacgacagcaacgtg1380aagaacctgtacgacaaggtgagactgcagctgagagacaacgctaaggagctgggaaac1440ggatgcttcgagttctaccacaagtgcgacaacgagtgcatggagagcgtgagaaacgga1500acctacgactaccctcagtacagcgaggaggctagactgaagagagaggagatcagcgga1560gtgaagctggagagcatcggaacctaccagatcctgagcatctacagcaccgtggctagc1620agcctggctctggctatcatggtggctggactgagcctgtggatgtgcagcaacggaagc1680ctgcagtgcagaatctgcatctga1704<210>2<211>1695<212>DNA11<213>人工合成<220><221>基因<222>(1)..(1695)<400>2atggagaagatcgtgctgctgctggctatcgtgagcctggtgaagagcgaccagatctgc60atcggataccacgctaacaacagcaccgagcaggtggacaccatcatggagaagaacgtg120accgtgacccacgctcaggacatcctggagaagacccacaacggaaagctgtgcgacctg180gacggagtgaagcctctgatcctgagagactgcagcgtggctggatggctgctgggaaac240cctatgtgcgacgagttcatcaacgtgcctgagtggagctacatcgtggagaaggctaac300cctgctaacgacctgtgctaccctggaaacttcaacgactacgaggagctgaagcacctg360ctgagcagaatcaaccacttcgagaagatccagatcatccctaagagcagctggagcgac420cacgaggctagcagcggagtgagcagcgcttgcccttaccagggaacccctagcttcttc480agaaacgtggtgtggctgatcaagaagaacaacacctaccctaccatcaagagaagctac540aacaacaccaaccaggaggacctgctgatcctgtggggaatccaccacagcaacgacgct600gctgagcagaccaagctgtaccagaaccctaccacctacatcagcgtgggaaccagcacc660ctgaaccagagactggtgcctaagatcgctaccagaagcaaggtgaacggacagagcgga720agaatggacttcttctggaccatcctgaagcctaacgacgctatcaacttcgagagcaac780ggaaacttcatcgctcctgagtacgcttacaagatcgtgaagaagggagacagcgctatc840gtgaagagcgaggtggagtacggaaactgcaacaccaagtgccagacccctatcggagct900atcaacagcagcatgcctttccacaacatccaccctctgaccatcggagagtgccctaag960tacgtgaagagcaacaagctggtgctggctaccggactgagaaacagccctcagagagag10200152]0800153]1400154]2000155]2600156]3200157]3800158]4400159]5000160]5600161]6200162]6800163]695accagaggactgttcggagctatcgctggattcatcgagggaggatggcagggaatggtggacggatggtacggataccaccacagcaacgagcagggaagcggatacgctgctgacaaggagagcacccagaaggctatcgacggagtgaccaacaaggtgaacagcatcatcgacaagatgaacacccagttcgaggctgtgggaagagagttcaacaacctggagagaagaatcgagaacctgaacaagaagatggaggacggattcctggacgtgtggacctacaacgctgagctgctggtgctgatggagaacgagagaaccctggacttccacgacagcaacgtgaagaacctgtacgacaaggtgagactgcagctgagagacaacgctaaggagctgggaaacggatgcttcgagttctaccacaagtgcgacaacgagtgcatggagagcgtgagaaacggaacctacgactaccctcagtacagcgaggaggctagactgaagagagaggagatcagcggagtgaagctggagagcatcggaacctaccagatcctgagcatctacagcaccgtggctagcagcctggctctggctatcatggtggctggactgagcctgtggatgtgcagcaacggaagcctgcagtgcagaatctgcatctga權(quán)利要求一種用于防治禽流感病毒的疫苗組合物，其中含有一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒和一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體和/或佐劑，該復(fù)制缺陷型重組腺病毒包含復(fù)制缺陷型腺病毒載體和改造后的禽流感病毒HA基因。2.權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中所述的禽流感病毒為高致病性禽流感病毒。3.權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中所述的高致病性禽流感病毒為高致病性禽流感病毒H5m。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其中所述的HA基因具有如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。5.一種改造后的禽流感病毒HA基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。6.權(quán)利要求5所述基因在在制備用于防治禽流感病毒的藥物或疫苗組合物中的用途。7.權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其中所述的禽流感病毒為高致病性禽流感病毒。8.權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其中所述的高致病性禽流感病毒為高致病性禽流感病毒H5m。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明提供了一種改造優(yōu)化的高致病性禽流感病毒HA基因，及含有其的重組腺病毒疫苗。本發(fā)明所述改造優(yōu)化的HA基因不僅顯著提供了表達(dá)量，而且減少了毒性。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒疫苗能同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生很強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可有效防治高致病性禽流感病毒感染。文檔編號(hào)C12N15/44GK101822842SQ20101010402公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年1月29日優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日發(fā)明者張曉光,曾毅,舒躍龍,馬晶申請(qǐng)人:曾毅;馬晶;張曉光