專利名稱：抗水稻白背飛虱的枯草芽胞桿菌工程菌及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業微生物學技術領域，具體涉及一種水稻內生枯草芽胞桿菌，同時還涉及一種枯草芽胞桿菌工程菌的制備方法，還涉及一種抗水稻白背飛虱的枯草芽胞桿菌工程菌的用途。
背景技術：
稻飛虱是我國水稻最重要的害蟲，對我國當前水稻生產已形成嚴重威脅。稻飛虱為同翅目害蟲，刺吸水稻的汁液，受害植株由于輸導組織的破壞，養分不能正常上送，影響生長和發育，造成莖稈細弱，植株矮小，籽粒不飽滿，禾苗逐漸枯萎以致死亡。此外稻飛虱通過口器刺入時產生傷口，通過傷口傳播多種病毒，而造成水稻的嚴重損失。植物內生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內，被感染的宿主植物不表現出外在病癥，并且可以分離到或者可以從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生。植物內生菌包括植物內生細菌、內生真菌和內生放線菌。人們發現植物體內存在大量有益的內生菌在植物體內能產生多種生物學作用，例如可以提供植物所需要的營養物質如氮源及一些激素，能夠促進植物快速生長，參與植物的防衛功能，增強植物抗逆境、抗病害、抗動物危害的的能力等。已發現內生菌對宿主植物的有益作用有固氮作用、促生長、抗病原真菌和細菌、抗逆境、抗動物攝食及他感作用等。植物內生菌的生物多樣性決定了其產生的活性物質的多樣性。近年來人們從植物內生菌中分離到如下的活性物質生長調節劑、抗菌活性物質、抗蟲活性物質、抗腫瘤活性物質。凝集素是動物和植物細胞都能夠合成和分泌的、能與糖結合的蛋白質，常用的為植物凝集素( 1^切叫81此111，？嫩)，它是一類非免疫原的，含有1個或多個可與單糖或寡聚糖特異可逆結合的非催化結構域的植物蛋白。PNA分布廣泛，高等植物中約有14%的植物含有凝集素。人們已經從豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科、石蒜科、天南星科等植物中發現了 1000多種PNA。目前已克隆了 200多個PNA基因，對它們的性質、結構、功能進行了大量研究，發現有些凝集素對鱗翅目害蟲、鞘翅目害蟲及同翅目害蟲如蚜蟲、稻飛虱、葉蟬等刺吸式口器害蟲具有明顯的致死作用。半夏凝集素(Pinellia ternate agglutinin,PTA) 是從三葉半夏中分離的凝集素蛋白，抗蟲實驗表明，PTA粗提液對刺吸式口器的同翅目害蟲具有明顯的抗蟲性。半夏總蛋白在lmg/ml時對褐飛虱的抑制作用達80%，見參考文獻 (梁永恒，劉小川，傅強，兩種半夏蛋白及凝集素抑制褐飛虱與番茄花葉病毒初報，湖南農業科學，2007，2 :93-95)。pta是一種有重要應用價值的抗蟲基因。將pta基因改造后導入其它植物體內，將PTA的抗蟲性賦予作物，目前轉pta基因植物主要有水稻、煙草、中草藥菘藍、百合等。轉基因植物雖已應用于多種農作物的品種改良中，但仍存在一些弊端，如轉基因沉默、基因漂移、某些植物組培技術和轉基因技術難于操作，如水稻、棉花等。而用植物內生菌作為載體，構建重組菌，在植物體內表達外源蛋白，從而賦予植物新的特征是另一種較好的選擇，具有如下優點內生菌相對植物，易于進行遺傳操作；內生菌易于發酵，進行批量生產，可大規模應用于農業生產；內生菌使用方便，操作簡單，可通過灌根、浸種等方式施用于田間；內生菌在植物體內可大量繁殖，可達到106_108CFU/g，有利于外源蛋白的大量表達。目前，已有多種抗性蛋白在植物內生菌中實現了表達，如蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白 cry3A 轉化入甘蔴內生固氮菌 Gluconacetobacter diazotrophicus,Herbaspirillum seropedicae中，用于控制鞘翅目和鱗翅目昆蟲，見參考文獻(Salles，J. F.，Gitahy，P. M.， Sk0t, L.，Baldani, J. I. , 2000. Use of endophytic diazotrophic bacteria as a vector to express the cry3A gene from Bacillus thuringiensis. Braz. J. Microbiol. 31, 155-161)。我們將有殺蟲活性的pta基因導入水稻內生菌中，以構建兼具殺蟲作用、且持效期長的內生工程菌，該重組菌將對同翅目害蟲有顯著抗性，并且由于該菌株是一類植物內生菌，在植物體內定殖后，能長期發揮功效，具有穩定、持效期長的優點，該項研究一方面順應了利用現代生物技術開發新型生物農藥的大趨勢，另一方面，也將給我國生物農藥的開發研制注入新的活力和新的競爭力。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，是在于提供了一種抗水稻白背飛虱的枯草芽胞桿菌工程菌，該菌能分泌表達半夏凝集素蛋白，可作為抗水稻白背飛虱的有效成分。 申請人:從水稻根部分離得到了這株目的菌株。試驗表明分離的這株細菌屬于一株枯草芽胞桿菌，它能以灌根，浸種及接種無菌苗等方法回接水稻，在水稻體內長期定殖。并可在小麥、 玉米、油菜、紅菜苔、蘿卜等多種植物體內定殖。利用半夏凝集素(PTA)構建分泌表達穿梭載體，轉入水稻內生菌枯草芽胞桿菌中，進行抗蟲實驗分析結果表明PTA可以明顯的抑制白背飛虱的群體增長量。本發明的另一個目的是在于提供了一種抗水稻白背飛虱的枯草芽胞桿菌的制備方法，方法易行，操作簡便，液體培養后，發酵液稀釋10倍后，灌根處理水稻，用于盆栽試驗，防治水稻白背飛虱，防治效果為73.2%，顯著抑制了白背飛虱的繁殖率和存活率。表明該菌可有效防治水稻白背飛虱，且與化學農藥相比，對環境無污染，對人畜不會造成傷害。 該菌可用于防治水稻白背飛虱，有利于生產綠色水稻。本發明的再一個目的是在于提供了一種抗水稻白背飛虱的枯草芽胞桿菌在防治水稻白背飛虱中的應用。該菌的主要優點有枯草芽胞桿菌是從水稻中分離的內生菌，可通過浸種、灌根等方式接種水稻，并能在水稻植株中從根部向莖、葉地上部分傳播，在水稻體內進行繁殖，菌體濃度可達到2X 104CFU/g，并可在水稻體內長期定殖，從而長期穩定地發揮抗蟲活性。將枯草芽胞桿菌菌液施用于水稻根部后，抗蟲活性分析表明，枯草芽胞桿菌表達的PTA可以明顯的抑制白背飛虱的群體增長量。19天時群體數量達到最大值，此時對照的白背飛虱的群體數量是接種枯草芽胞桿菌工程菌WH2的98. 7倍。到沈天時對照組水稻苗全部死亡，而枯草芽胞桿菌與枯草芽胞桿菌工程菌WH2試驗苗生長正常。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施一種水稻內生枯草芽胞桿菌的制備方法，其步驟是1.枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)的篩選分離從水稻田取分蘗期的中花11 水稻植株，用自來水充分沖洗表面泥土。剪成2cmX2cm或4cm小塊，先用75% (ν/ν)乙醇漂洗5min，加入0. 2% (v/v) HgCl2表面消毒5min，后用無菌水沖洗4_6次。在無菌條件下， 將組織充分研磨，然后在2000g，離心4-6min。取上清涂于LB培養基(含IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl，20g瓊脂，pH7.0-7. 2，加蒸餾水至1L)上于37°C培養48h，獲得單菌落。2.細菌的分類鑒定對分離的細菌進行16SrRNA和形態鑒定。用常規方法提取細菌的基因組DNA，見參考文獻(薩姆布魯克等著，金冬雁等譯.分子克隆實驗指南第二版.北京科學出版社，1999)，以16SrRNA的通用引物進行PCR。擴增產物進行序列測定后在NCBI中經Blast比較分析確定為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。3.枯草芽胞桿菌內生性的檢測枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)(分離自水稻葉片)通過灌根回接水稻后， 可在水稻中穩定定殖，澆菌后一天回收到2X104CFU/g，隨著時間的延長(1-30天)，回收到的菌數量逐漸減少，但是不會消失。澆菌后一個月后仍能從中分離到。枯草芽胞桿菌 (Bacillus subtilis)可以在玉米、小麥、油菜、紅菜苔、蘿卜、小白菜中定殖，接種100天后，仍能從作物中分離到該菌。結果表明，該菌可以且能夠在多種作物中長期定殖。4.枯草芽胞桿菌對植物的促生長作用枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)對水稻有促生長作用，用內生菌枯草芽胞桿菌的菌體浸種Mh，30天后對水稻苗生長的影響結果分析表明，苗的鮮重比對照增加了 62. 16%，干重比對照增加了 21. 33%，處理組的株高比對照增加了 9. 42%，根長比對照增加了 2. 97%。由此可見，經內生菌枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)浸種處理后，對水稻有明顯的促生長作用。一種枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2的制備方法，其步驟是1.表達半夏凝集素的重組載體的構建利用半夏凝集素(PTA)構建分泌表達穿梭載體pP43NMK-pta (來自于實驗室構建的重組質粒，將載體pP43NMK和半夏凝集素基因pta 分別用I3St I和Hind III雙酶切消化后，連接后獲得重組載體)。將PP43NMK(來自于實驗室保存的分子載體，見參考文獻(張曉舟.枯草桿菌新型表達系統和遺傳操作體系的建立及應用.南京農業大學博士學位論文，2006)與半夏凝集素編碼基因(pta)(從半夏葉片中克隆分離獲得，提取半夏葉片RNA，根據甘露糖結合凝集素的保守氨基酸序列和甘露糖結合位點設計合成特異引物，并利用RACE克隆技術分離半夏凝集素基因)分別經I^st I和 Hind III雙酶切消化，通過酶連成功構建了含有半夏凝集素編碼基因(pta)的pP43NMK-pta 載體。2.構建枯草芽胞桿菌工程菌WH2 將構建的pP43NMK_pta質粒采用Spizizen 法轉化上述一種水稻內生枯草芽胞桿菌的制備方法中分離的水稻內生菌枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)，質粒的轉化方法見參考文獻(張曉舟.枯草桿菌新型表達系統和遺傳操作體系的建立及應用.南京農業大學博士學位論文，2006和Spizizen J. Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate. Proc Natl Acad Sci USA，1958，44 :1072-1078)。利用半夏凝集素基因的特異引物，對轉化子進行菌體PCR，擴增產物與半夏凝集素編碼基因(pta)大小相同， 擴增產物測序發現，其與半夏凝集素編碼基因(Pta)的序列完全相同。提取重組菌的菌體蛋白和上清液蛋白，進行SDS-PAGE及Wfestern Blot分析，檢測枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)工程菌WH2轉化子的菌體蛋白和上清中的重組蛋白半夏凝集素蛋白(PTA)，發現枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)WH2上清中可檢測到MkD特異蛋白，與半夏凝集素蛋白(PTA)大小相似，說明該工程菌可以分泌表達半夏凝集素蛋白(PTA)。該菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)WH2菌株，該菌株已于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年7月四日，保藏編號CCTCCN0 :M2011273，分類命名枯草芽胞桿菌 WH2 Bacillus subtilis WH2。3.細菌培養和保存方法培養枯草芽胞桿菌的條件為LB培養基(含IOg蛋白胨， 5g酵母粉，IOg NaCl, 20g瓊脂，ρΗ7· 0-7. 2，加蒸餾水至1L)，37°C培養。菌株保存方法取培養好的枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)菌液添加滅菌甘油至終濃度25%于_80°C保存。一種分離的枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2的基因，其序列為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。該序列在上述一種水稻內生枯草芽胞桿菌的制備方法步驟2細菌的分類鑒定中獲得，用常規方法提取細菌的基因組DNA，以16SrRNA的通用引物進行PCR擴增。擴增產物進行序列測定后的獲得SEQ ID NO :1中所示的核苷酸序列。一種枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2 (Bacillus subtilis)的菌學特征枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2菌體桿狀，菌體大小0. 7-0. 8 μ mX 2_3 μ m，著色均勻。周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢中間生，芽胞形成后菌體不膨大。在LB培養基(含IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOgNaCl, 20g瓊脂，ρΗ7· 0-7. 2，加蒸餾水至1L)平板上形成白色不規則菌落，表面干燥有褶皺，中間塌陷，邊緣呈波狀，菌落直徑3-6mm，菌落表面褶皺下有粘稠物質產生，37°C生長明顯快于^°C。在牛肉膏培養基(含3g牛肉膏，IOg蛋白胨， 5gNaCl，20g瓊脂，蒸餾水lL，pH 7.4-7. 6)平板上形成白色菌落，菌落大小較LB平板上小， 培養M小時，菌落形狀較為規則，表面干燥，中間塌陷，邊緣平整，菌落直徑2-4mm，48小時后菌落表面有褶皺。一種枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2在制備治療或預防水稻白背飛虱藥物中的應用，其應用步驟是1.水稻植株接種枯草芽胞桿菌工程菌WH2 將水稻種子放在濕潤的墊有紗布的培養皿中，置于光照培養箱發芽，發芽后10天挑選水稻植株生長勢一致的植株轉移到盆(直徑7. 5cmX高8. 5cm)中，每盆放入2_3棵植株。于光照培養箱中培養，濕度75%，25°C/16h、 20°C/8h，白天、夜間交替循環。3天后用枯草芽胞桿菌工程菌WH2菌液(lX108CFU/ml)澆灌于根部，每棵苗接種2ml菌液。2天后分離內生菌確定定殖。2.抗蟲實驗分析澆菌后3天接白背飛虱于水稻苗中，并將接過蟲子的盆子用自制的罩子罩起來，每盆植株上接10頭2齡白背飛虱若蟲，每隔1天觀察統計白背飛虱的群體數量共觀察26天。統計實驗數據，分析抗蟲結果。實施結果16SrRNA序列通過NCBI Blast比較，結果表明分離的內生菌與枯草芽胞桿菌 (Bacillus subtilis)有100%的相似性，通過16SrRNA分析和形態觀察確定申請人分離的菌株為一枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。定殖分析和促生長結果以灌根的方法回接水稻，定殖回收結果表明內生菌枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)能在水稻體內長期定殖，且可在小麥、玉米、油菜、紅菜苔、蘿卜等多種植物體內定殖，在三個月后仍可以從上述植物中分離到該菌。經該菌株浸種 30天后水稻的鮮重比對照增加了 62. 16%，干重比對照增加了 21. 33%，株高比對照增加了 9. 42%，根長比對照增加了 2.97%。由此可見，經枯草芽胞桿菌菌液浸種處理后，對水稻有明顯的促生長作用。SDS-PAGE及^festern blot分析表明，枯草芽胞桿菌工程菌WH2可分泌表達半夏凝集素蛋白。SDS-PAGE電泳檢測，發現枯草芽胞桿菌工程菌WH2上清中可分泌表達PTA蛋白，大小約為MkD。Western blot分析發現WH2上清中一種蛋白與PTA分子量大小相似， 且可以與半夏凝集素特異抗體反應和顯色，說明該菌可分泌PTA蛋白。抗蟲分析將枯草芽胞桿菌工程菌WH2通過灌根的方式接種水稻，澆菌后3天接白背飛虱于水稻苗中，觀察統計白背飛虱的群體數量的變化。結果表明PTA可以明顯地抑制白背飛虱的群體增長量。19天時群體數量達到最大值，此時對照組的白背飛虱的群體數量是WH2的98.7倍。到沈天時對照組水稻苗全部死亡，而接種內生菌枯草芽胞桿菌與枯草芽胞桿菌工程菌WH2的水稻苗生長正常。說明枯草芽胞桿菌工程菌WH2對白背飛虱有致死效應，即PTA能降低白背飛虱存活能力，對水稻上的白背飛虱有明顯的抑制作用。上述結果表明該株水稻內生枯草芽胞桿菌能穩定地在植物體內定殖，并具有促生長作用，重組菌WH2 有明顯的抗白背飛虱活性。因此植物內生菌可作為載體，表達抗蟲蛋白，用于抗刺吸式口器同翅目害蟲。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果稻飛虱是我國水稻最重要的害蟲，對我國當前水稻生產已形成嚴重威脅。稻飛虱為同翅目害蟲，刺吸水稻的汁液，受害植株由于輸導組織的破壞，養分不能正常上送，影響生長和發育，造成莖稈細弱，植株矮小，籽粒不飽滿，禾苗逐漸枯萎以致死亡。此外稻飛虱通過口器刺入時產生傷口，通過傷口導致多種病毒，而造成水稻的嚴重損失。損失一般在 10% -30%，嚴重時達50% -70%，甚至個別田地顆粒無收。自80年代轉基因植物研究興起以來，抗蟲植物基因工程研究進展迅速，其中包括以抗鱗翅目害蟲為主的蘇云金桿菌毒蛋白基因、以抗鞘翅目害蟲為主的巰基蛋白酶抑制劑基因等及針對同翅口害蟲(如蚜蟲、褐飛虱及葉蟬等)的植物凝集素(雪花蓮凝集素、半夏凝集素)抗蟲基因，均已轉入多種農作物(大豆、馬鈴薯、油菜、玉米、水稻等)中用于防治害蟲。然而，由于轉入的外源基因并非來自于傳統基因庫，轉抗蟲基因植物可能帶來的生態安全和環境問題已成為國際社會關注的熱點。近年來，有關抗蟲基因漂移、靶標害蟲對轉抗蟲基因植物抗性風險評估、轉抗蟲基因植物對非靶標生物及生物多樣性影響的評價等已有大量石if究 艮道，見參考文獻(Wolfenbarger，L. L.，Phifer，P. R. The ecological risks and benefits of genetically engineered plants· Science，2000，290 :2088-2093)。作為一種替代轉基因植物防治病蟲害的策略和方法，將抗蟲基因轉入植物內生菌中，通過回接植物，伴隨內生菌在植物體內的繁殖和生長，內生菌表達抗蟲蛋白，從而增強植物的抗蟲活性，已成為一種構建新型生物農藥的新方法。植物內生菌是一類重要的微生物資源，內生菌與宿主植物形成了密切的互惠共生關系，某些內生菌還可以產生抗菌、抗蟲等多種生物活性物質。多項關于植物內生菌在防治病害、促進植物生長發育以及固氮方面的作用的研究均表明內生菌對防治植物病害具有潛在的應用和開發價值。在農業生產上， 人們常利用內生菌增強宿主植物抗逆境、抗病蟲害等作用，對植物施用植物內生菌產生的抗菌劑、抗蟲劑，既減少了化學農藥對環境的污染，又保證了植物產品的品質。本發明利用現代生物學技術將有殺蟲活性的半夏凝集素編碼基因(pta)導入水稻內生菌中，以構建具有殺蟲作用的內生工程菌，該重組菌對同翅目害蟲有顯著抗性，并且由于該菌株是一類植物內生菌，在植物體內定殖后，能長期發揮功效，具有持效期長、蟲病兼治的優點。該項研究一方面順應了利用現代生物技術開發新型生物農藥的大趨勢，另一方面，也將給我國生物農藥的開發研制注入新的活力和新的競爭力。與將抗蟲蛋白轉化入植物基因組中，獲得具有抗蟲活性的轉基因植物相比，將半夏凝集素轉入水稻內生菌枯草芽胞桿菌中，通過枯草芽胞桿菌工程菌回接植物，以提高植株的抗蟲活性，具有以下優點 接種內生菌時，植物基因組并未發生改變，而在轉基因植物中，外源基因整合入植物基因組中，植物基因組發生了變化；構建重組內生菌需要的時間相對比較短，而為了獲得轉基因植物，特別是轉基因純合體，常常需要幾個月或1-2年的時間；經過改造的內生菌不會傳播入接種植物的種子中，而是嚴格存在于植物體內，不會傳播入植物下一代或其他植物，相對于轉基因植物存在的基因漂移等現象更加安全；由于內生菌能定殖于不同植物中，如枯草芽胞桿菌WH2能定殖于水稻、小麥、蘿卜、小白菜中，該菌可廣泛用于多種農作物和蔬菜害蟲的防治，即一種內生菌可應用于多種植物以防治多種害蟲，而為了獲得具有抗蟲活性的以上轉基因植物，則需要分別將外源基因轉入不同的植物中，需要花費較多的人力、較長的時間；此外，內生菌能在植物體內大量繁殖，常可達到106-108CFU/g，因此其抗蟲活性可達到或高于轉基因植物。相對于轉基因植物，遺傳改造的內生菌提供了一種將外源基因導入植物中而賦予植物新的特性的新方法，如提高其抗蟲活性。重組內生菌可用于提高植物對病蟲害的抗性，具有多種轉基因植物無法比擬的優點，是一種較新穎的生物農藥，可用于農作物生產中。本發明構建的重組枯草芽胞桿菌可用于水稻白背飛虱及其他同翅目害蟲的防治，具有較顯著的抗蟲活性，施用方法簡易，在苗期施用1-2次即可在植物整個生育期發揮功效。將枯草芽胞桿菌工程菌WH2在水稻幼苗期通過灌根的方式接種水稻，結果表明PTA 可以明顯地抑制白背飛虱的群體增長量。19天時群體數量達到最大值，此時對照組的白背飛虱的群體數量是WH2的98. 7倍。到沈天時對照組水稻苗全部死亡，而接種內生菌枯草芽胞桿菌與枯草芽胞桿菌工程菌WH2的水稻苗生長正常。表明重組枯草芽胞桿菌施用于水稻苗，能有效控制稻飛虱的繁殖和生存，具有較顯著的抗蟲活性。


圖1為一種枯草芽胞桿菌WH2透射電鏡照片示意圖。WH2具周生鞭毛。圖2為一種pP43NMK_pta載體的構建示意圖。pP43NMK與pta基因經I3St I和Hind III雙酶切消化，通過酶連成功構建了含有半夏凝集素的pP43NMK-pta載體，重組質粒經I^st I和Hind III雙酶切，如圖2所示，發現可以分為約6. 6kb與750bp的兩條片段。1，λ -Hind III Marker片段由大到小依次為23Kb、 9. 4Kb、6. 5Kb、4. 3Kb、2. 3Kb、2Kb、564bp 和 125bp ；2，3，pP43NMK-pta 經 Pst I 和 Hind III雙酶切消化的產物；4，DL2000 Marker片段由大到小依次為2Kb、lKb、750bp、500bp、250bp及 IOObp。圖3為一種枯草芽胞桿菌及重組菌WH2回接水稻苗后重新分離的菌株。
從圖3可以看出，枯草芽胞桿菌及其轉化子，在水稻中均可以定殖。圖3A為從水稻苗中重新分離得到的枯草芽胞桿菌；圖:3B為從水稻苗中重新分離的重組菌WH2。圖4為一種SDS-PAGE電泳及^festern blot分析重組WH2表達的半夏凝集素蛋白。圖4A為Wfestern blot檢測重組菌WH2發酵上清中表達的PTA蛋白。1，重組菌WH2上清；2，枯草芽胞桿菌上清；3，從半夏球莖中純化的PTA蛋白。圖4B為SDS-PAGE檢測重組菌WH2發酵上清中表達的PTA蛋白。1，蛋白Marker 片段大小依次為97KD、66KD、45KD、;35KD、27KD、20KD和14. 4KD ；2，重組菌WH2上清蛋白；3， 枯草芽胞桿菌上清蛋白。圖5為一種枯草芽胞桿菌工程菌WH2回接水稻后抗蟲活性分析結果示意圖。CK為未接種菌的對照水稻苗上白背飛虱數量動態變化；BS為接種內生菌枯草芽胞桿菌的水稻苗上白背飛虱數量動態變化；WH2為接種枯草芽胞桿菌工程菌WH2的水稻苗上白背飛虱數量動態變化。圖6為一種抗白背飛虱水稻試驗苗示意圖。圖6A為一種未接種菌的對照水稻苗；圖6B為一種接種枯草芽胞桿菌的水稻苗；圖6C為一種接種枯草芽胞桿菌工程菌WH2的水稻苗。
具體實施例方式實施例1 一種水稻內生菌枯草芽胞桿菌的制備方法，其步驟是1、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)的篩選分離從中國湖北省武漢市華中農業大學水稻田取分蘗期的中花11健康水稻，用自來水充分沖洗表面泥土，剪成2cmX 2cm或4cm小塊，先用75% (ν/ν)乙醇漂洗5min，加入
0.2 % HgCl2 (ν/ν)表面消毒5min，后用無菌水沖洗5次。在無菌條件下，將組織充分研磨，然后在2000g，離心5min。取上清涂LB培養基(含IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOgNaCl，20g瓊脂， PH 7.0-7. 2，加蒸餾水至1L)上于37°C培養48h，挑取細菌單菌落，見參考文獻(Misaghi,
1.J.，Donndelinger, C. R.，Endophytic bacteria in symptom-free cotton plants. Phytopatho,1990,80 :808-811)。2、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)的分類鑒定對分離的細菌進行16SrRNA和形態鑒定。以LB液體培養基過夜培養分離到的細菌，用常規方法提取細菌的基因組DNA，見參考文獻0!i，G.F.，Zhu, F. Y.，Du, P.，et al. Lipopeptide induces apoptosis in fungal cells by a mitochondria-dependent pathway. Peptides,2010, 31 :1978-1986)，以測定 16SrRNA 的通用引物(primer F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；primer R :AAGGAGGTGATCCAGCCGCA，由上海生工生物工程技術有限公司合成)進行PCR擴增，PCR反應體系為雙蒸水18.3μ 1，10XPCR緩沖液2.5μ 1，通用正反引物，dNTP各1μ 1，Taq酶0.2μ 1 (PCR反應試劑均為廣東東盛生物科技有限公司產品)。反應程序94°C 4min，30 循環的 94°C 45s, 52 °C 45s, 72 °C 90s，再 72°C 10min),l% (w/v)瓊脂糖電泳檢測成功擴增到大小大約為1. 5kb的DNA片段，由上海生工生物工程技
9術有限公司進行序列測定后在NCBI中經Blast比較分析確定為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)ο一種枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2的制備方法，其步驟是1、表達載體的構建pta基因的擴增從pET-pta(來自于本實驗室構建和保存的分子載體，將半夏凝集素基因及分子載體pET-28a用HindΠI BamHI酶切消化后，連接后獲得重組質粒)中擴增出Pta基因，擴增體系為去離子水36. 5 μ 1，IOXBuffer with Mg2+ 5. 0μ 1, pxf (5 '-CGCCAAGCTTTTAATTCACCCTCTC-3 ‘)和 pxr (5 ‘ -TCAGCTGCAGT GGGCACCAATTAC-3 ‘) 各 2yl，dNTPs 2.0μ1，質粒 DNA 2. O μ 1，Taq 酶 0. 5 μ 1。反應循環94°C，3min ;30 個循 3^，94°C，4s，62°C，45s，72°C，45s ；72°C，lOmin，見參考文獻(Yao, J. H.，Sun, X. F.，Tang, K. X. Molecular cloning of lectin gene from Pinellia ternata. J Fudan University, 2001,40 :461-464)。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，AxyGenDNA膠回收試劑盒回收。其中 pxf包含Hind III酶切位點，pxr包含I^st I酶切位點，去除了半夏凝集素本身的信號肽序列。用I^st I和Hind III雙酶切消化質粒和pta擴增產物，反應體系為去離子水 20μ 1，pP43NMK (來自于實驗室保存的分子載體)或pta擴增產物5. 0 μ 1，10ΧΜ Buffer 3.0 μ 1, Hind III 1.0μ l,Pst I 1. 0 μ 1。于 37 °C 溫育 2h。瓊脂糖凝膠電泳檢測，用 AxyGen DNA試劑盒切膠回收酶切產物。pta與pP43NMK (來自于實驗室保存的分子載體)連接體系去離子水7 μ 1，T4DNA 連接緩沖液2.0 μ 1，pta 6.0 μ 1，ρΡ43ΝΜΚ(來自于實驗室保存的分子載體)4. 0 μ 1，Τ4 DNA Iigase 1. 0 μ 1，于16°C溫育過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α (該菌是目前普遍使用)。重組質粒pP43NMK-pta經PCR擴增和測序后驗證在pP43NMK (來自于實驗室保存的分子載體)載體中正確插入了 Pta基因。PP43NMK為大腸桿菌-枯草桿菌穿梭分泌表達載體，該載體中的啟動子P43是枯草桿菌可識別強啟動子，見參考文獻(Wang，P. Ζ.，Doi, R. H. Overlapping promoters transcribed by Bacillus subilis σ 55 and σ 37 RNA polymerase holoenzymes during growth and stationary phase. J Biol Chem,1984， 259(13) :8619-8625)，載體中的信號肽SP即nprB是分泌率較高的信號肽序列，可以實現 PTA在枯草桿菌中的表達，見參考文獻(張曉舟.枯草桿菌新型表達系統和遺傳操作體系的建立及應用.南京農業大學博士學位論文，2006)。2、重組載體轉化枯草芽胞桿菌枯草芽胞桿菌的轉化方法參照Spizizen的方法，見參考文獻(Spizizen J. Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate. Proc Natl Acad Sci USA，1958，44 :1072-1078)。將枯草芽胞桿菌菌種接種在LB斜面上37°C培養2天，使其孢子形成率接近100% ；用接種環接一環孢子于5ml GMI溶液(含1 X最低鹽溶液95ml，50% (w/v)葡萄糖lml, 5% (w/v)酸水解酪蛋白0. 4ml， 10% (w/v)酵母汁 lml，ang/ml L-色氨酸 2. 5ml)，30°C，100/rmin 振蕩過夜；次日取 2ml 轉接至Ij 18ml GMI 中，37°C，200r/min 培養 3. 5h ；再取 IOml 轉接到 90ml GM II (含 1 X 最低鹽溶液97. 5ml，50% (w/v)葡萄糖lml, 5% (w/v)酸水解酪蛋白0. 08ml, 10% (w/v)酵母汁 0. 04ml，0. 5mol/L MgCl2 0. 5ml, 0. lmol/L CaCl2 0.5ml，2mg/ml L-色氨酸 0. 5ml)中，37°C慢搖床，80r/min，培養90min，于5000g/min，10min離心收集菌體；用IOml GM II重新輕輕懸浮菌體，懸浮后的菌體即為感受態細胞可以直接用來轉化。在0. 5ml感受態細胞中加入 12μ1 pP43NMK-pta DNA(ly g/ml) ；37°C，80r/min，保溫30min后涂布到含抗生素Kna 20 μ g/ml的LB培養基(含IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl，20g瓊脂，pH 7.0-7. 2，加蒸餾水至1L)平板上，37°C培養過夜，通過PCR擴增和測序驗證轉化子。獲得轉pP43NMK-pta 質粒的枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)工程菌WH2菌株。該菌株屬于芽孢桿菌屬 (Bacillus)，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis) WH2菌株，該菌株已于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCCNO :M2011273。3、SDS-PAGE 電泳及 Western blot 分析菌體蛋白樣品的制備挑枯草芽胞桿菌工程菌WH2單菌落與5ml LB液體培養基 (含IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl,pH 7. 0-7. 2，加蒸餾水至1L)中，200r/min震蕩培養， 分別培養1天與4天；取Iml培養液，12 000r/min離心Imin ；去上清，收集菌體，用25 μ 1 1 χ加樣緩沖液重懸菌體，沸水煮5min后備用。上清蛋白樣品的提取與制備挑枯草芽胞桿菌工程菌WH2單菌落于5ml LB液體培養基中，200r/min震蕩培養，分別培養1天與4天；取Iml培養液，12 000r/min離心Imin ； 取200μ 1上清，用蛋白濃縮試劑盒II (Protein Recovery Kit)方法提取；將提取的蛋白樣品用10μ 1 IX加樣緩沖液重懸樣品，沸水煮5min后備用。采用常規方法進行SDS-PAGE電泳分析菌體蛋白和上清蛋白，見參考文獻(薩姆布魯克等著，金冬雁等譯.分子克隆實驗指南第二版.北京科學出版社，1999)。Western blot分析將蛋白經SDS-PAGE電泳分離，取出凝膠，按照常規方法進行電轉，見參考文獻(薩姆布魯克等著，金冬雁等譯.分子克隆實驗指南第二版.北京科學出版社，1999)，100V轉移池；取出PVDF膜，加封閉液，4°C搖床過夜；將封閉液傾去，加入稀釋8000倍的一抗(抗PTA血清)，室溫Q2-25°C，以下相同)搖池；加稀釋400倍有生物素標記的二抗室溫，室溫溫育lh，用TBST洗五次；加稀釋400倍的鏈霉親和素(Avidin)室溫Ih ；用TBST洗五次；加DAB顯色液，帶顯色后用去離子水終止，照相。電鏡樣品的制備和觀察挑取單菌落在PSA培養基(含200g馬鈴薯，20g蔗糖，蒸餾水定容至1L)的斜面上劃線，培養1-2天后，加入Iml去離子水，不要刮菌體靜置lh-2h， 取IOyL液體備用。將樣品送到華中農業大學電鏡(電鏡型號為H-7650)平臺中心用透射電鏡進行觀察并拍照。一種分離的枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2的基因，其序列為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。該序列在上述一種水稻內生枯草芽胞桿菌的制備方法步驟2細菌的分類鑒定中獲得，用常規方法提取細菌的基因組DNA，以16SrRNA的通用引物進行PCR擴增。擴增產物進行序列測定后的獲得SEQ ID NO :1中所示的核苷酸序列。實施例2 —種枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2在制備治療或預防水稻白背飛虱藥物中的應用，其具體步驟是1、定殖分離及定殖范圍測定枯草芽胞桿菌工程菌WH2接種于30ml LB中震蕩培養24h后，8 000r/min離心 5min，棄上清液，用無菌水懸浮菌體，配制菌體濃度為8X106CFU/ml的菌液。
水稻種子用無菌水于室溫Q2-25°C )下浸泡30h，以稀釋1 000倍的多菌靈稀釋液于37°C浸泡后，75% (ν/ν)酒精消毒lmin，最后用(ν/ν)升汞處理:3min并用無菌水清洗，播種于PSA培養基(含200g馬鈴薯，20g蔗糖，蒸餾水定容至1L)上，光照培養箱培養，濕度75%，25°C /16h、20°C /8h，白天、夜間交替循環，待種子發芽后，再培養5天確定 PSA平板上無菌長出，無菌苗制備好用于接種實驗。無菌苗移載到裝有無菌土的盆中，取枯草芽胞桿菌工程菌WH2菌液分別澆灌于植株(水稻、小麥、玉米、油菜、蘿卜、菜苔、小白菜) 根部周圍的土壤中，每棵苗澆灌Iml菌液，每隔7天取其莖葉分離內生細菌。檢測能否回收到枯草芽胞桿菌工程菌WH2。2、促生長實驗配制枯草芽胞桿菌工程菌WH2菌液(濃度為8 X 106CFU/ml)將水稻種子浸泡24h 后，播種于室內裝有無菌土的盆中，重復三次，每組10棵苗，20天后測定苗的鮮重、苗高、根長，并于80°C烘干汕后稱干重。3、枯草芽胞桿菌工程菌WH2在水稻中定殖及抗白背飛虱實驗分析將水稻種子放在濕潤的墊有紗布的培養皿中，置于光照培養箱發芽，發芽后10天挑選水稻植株生長勢一致的植株轉移到盆(直徑7. 5cmX高8. 5cm)中，將珍珠巖、播種育苗基質與土，按1 2 1用水攪拌均勻，稱取160g作為每盆的培養基質，移栽2-3棵水稻。 光照培養箱培養，濕度75%，25°C /16h、20°C /8h，白天、夜間交替循環。移栽3天后用濃度為1 X 108CFU/ml的枯草芽胞桿菌工程菌WH2菌液或無菌水澆灌于根部(^iil/株)，確定定殖后，澆菌后3天接白背飛虱于水稻苗中，并將接過蟲子的盆子用自制的罩子罩起來，每盆植株上接10頭2齡白背飛虱若蟲，每隔1天觀察統計白背飛虱的群體數量，共觀察沈天， 統計實驗數據分析抗蟲結果。
權利要求
1.一種枯草芽胞桿菌工程菌菌株冊2，其特征在于枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)m2, CCTCC，N0:M2011273。
2.權利要求1所述的一種枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2，其特征在于所述的枯草芽胞桿菌中含有一種分離的枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2的基因，其序列為SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
3.權利要求1所述的一種枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2的制備方法，其步驟是A、表達半夏凝集素的重組載體的構建利用半夏凝集素構建分泌表達穿梭載體 pP43NMK-pta，將pP43NMK與半夏凝集素編碼基因分別經I ^Hind III雙酶切消化，通過酶連成功構建了含有半夏凝集素編碼基因的pP43NMK-pta載體；B、構建枯草芽胞桿菌工程菌WH2將構建的pP43NMK-pta質粒采用Spizizen法轉化一種水稻內生枯草芽胞桿菌的制備方法中分離的水稻內生菌枯草芽胞桿菌，質粒的轉化后獲得枯草芽胞桿菌工程菌WH2，利用半夏凝集素基因的特異引物，對轉化子進行菌體PCR，擴增產物與半夏凝集素編碼基因大小相同，擴增產物測序，其與半夏凝集素編碼基因的序列完全相同，提取重組菌的菌體蛋白和上清液蛋白，進行SDS-PAGE及Western Blot分析，檢測枯草芽胞桿菌工程菌WH2轉化子的菌體蛋白和上清中的重組蛋白半夏凝集素蛋白，枯草芽胞桿菌WH2上清中檢測到MkD特異蛋白，與半夏凝集素蛋白大小相似，工程菌表達半夏凝集素蛋白。
4.權利要求1所述的一種枯草芽胞桿菌工程菌菌株WH2在制備治療或預防水稻白背飛虱藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗水稻白背飛虱的枯草芽胞桿菌工程菌及制備方法和應用，其步驟A、枯草芽胞桿菌的篩選分離；B、細菌的分類鑒定對分離的細菌進行16SrRNA和形態鑒定；C、表達半夏凝集素的重組載體的構建利用半夏凝集素構建分泌表達穿梭載體，將pP43NMK與半夏凝集素編碼基因經PstⅠ和HindⅢ雙酶切消化，構建了含有半夏凝集素編碼基因的載體；D、構建枯草芽胞桿菌工程菌WH2將構建的pP43NMK-pta質粒采用Spizizen法轉化枯草芽胞桿菌。具有較顯著的抗蟲活性，方法簡易，枯草芽胞桿菌能穩定在植物體內定殖，重組菌枯草芽胞桿菌有明顯的抗白背飛虱活性；E、細菌培養和保存方法培養枯草芽胞桿菌用LB培養基，保存取培養的枯草芽胞桿菌WH2菌液添加甘油至終濃度保存。
文檔編號A01P7/04GK102277328SQ201110227130
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月9日 優先權日2011年8月9日
發明者張獻芳, 張翼, 王圣英, 祁高富, 趙秀云 申請人:華中農業大學