專利名稱：水稻抗褐飛虱主效基因Bph6的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領域，涉及水稻抗褐飛虱主效基因Bph6的分子標記，本發(fā) 明還涉及該分子標記在選育水稻抗褐飛虱品種中的應用。
背景技術：
水稻是我國主要的糧食作物之一，但近幾十年來水稻受到大面積的病蟲為害，使 水稻生產(chǎn)受到嚴重威脅。褐飛虱是一種水稻單食性害蟲，其成蟲和若蟲以口針刺吸水稻汁 液，引起黃葉或枯死，導致減產(chǎn)或絕收。據(jù)中國農(nóng)業(yè)年鑒記載，1966、1969、1973、1977、1983 和2003年全國性大發(fā)生，1987、1991、2005、2006和2007年全國性特大發(fā)生，褐飛虱危害面 積達到水稻總面積的50%以上，給我國水稻生產(chǎn)造成了嚴重的損失。由于褐飛虱的危害多 發(fā)生在水稻成熟灌漿期，此時大量使用殺蟲劑，對環(huán)境和稻谷的污染也是非常嚴重的問題。 利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中最為經(jīng)濟有效的方法。水稻抗褐飛虱基因的研究始于上世紀70年代初，至今已命名了 21個主效抗蟲 基因(Rahman et al. 2009 High-resolution mapping of two rice brown planthopper resistance genes，Bph20(t) and Bph21(t)，originating from Oryza minuta. Theor Appl Genet 119(7) :1237_1246.)。這些抗蟲基因分別來自不同的野生稻種和栽培稻農(nóng)家品種資 源。除了 Bph5、Bph6、Bph7和Bph8外，其余抗褐飛虱基因均已經(jīng)應用分子標記定位到水稻 染色體上。一些早期研究的抗褐飛虱基因如Bphl、bph2和Bph3已培育成抗蟲品種并在一 些水稻種植區(qū)推廣種植。然而，由于褐飛虱新生物型的產(chǎn)生，抗褐飛虱品種逐漸喪失抗性或 面臨抗性喪失的危險。例如，帶有Bphl的抗蟲品種，經(jīng)過幾年推廣種植后很快就失去抗性， 而攜帶Bphl和bph2兩個基因的品種抗性表現(xiàn)更強并更持久。因此，水稻生產(chǎn)中迫切需要 攜帶新的和多個抗性基因的抗蟲品種。由于抗蟲性鑒定的復雜性，利用常規(guī)育種手段往往難以有效地導入和聚合不同的 抗蟲基因。本發(fā)明是在找到與抗蟲基因緊密連鎖或共分離的分子標記的基礎上，借助分子 標記輔助選擇(Marker-assisted selection,MAS)技術則可以有目的地進行抗蟲基因的導 入和聚合，選育持久抗性品種，延緩抗蟲品種的退化年限和防止褐飛虱新生物型的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻抗褐飛虱主效基因位點Bph6的分子標記，通過檢 測與這些抗褐飛虱主效基因位點連鎖的分子標記，可以預測水稻植株的褐飛虱抗性，加快 抗褐飛虱水稻品種的選擇進度。水稻抗褐飛虱主效基因Bph6的分子標記由下述之一的引物對經(jīng)PCR擴增獲得1)標記引物 RM16994，左端引物序列，TGGCAGTACACACTACAGTACATGC右端引物序列，AGAGGGAGGAGAGAAAGGAAGG；2)標記引物Y19，
左端引物序列，GTACGTGTGCGCCATCT右端引物序列，GAGGAGGAGGTCGTGTTGT；3)標記引物Y9，左端引物序列，TAATAAGCACCATGAAAGACAAAA右端引物序列，GCTAGTTCTCACCAAAATCAAAAT；4)標記引物 RMl 19，左端引物序列，CATCCCCCTGCTGCTGCTGCTG右端引物序列，CGCCGGATGTGTGGGACTAGCG；5)標記引物 RM5757，左端引物序列，CCTGAGACCATATGCTGCTG
右端引物序列，GAGGGAGCATCATTAGCTGG ；6)標記引物 RM16999，左端引物序列，GCTGATGCGGAACAAGGAGACC右端引物序列，GATCAGATCACCACCCGAATGAGC；7)標記引物 RM17004，左端引物序列，GTTATGCCTGGTCCCGTCTGACC右端引物序列，TCTTGACGTACACGCTGATGATGC；或，8)標記引物 RM17008，左端引物序列，TTACCTTCGATTAGCTGCTGTTGC右端引物序列，ATTCCTTGCATTACAGACGGTAGC。本發(fā)明還提供水稻抗褐飛虱主效基因Bph6的分子標記方法，其是用上述之一的 引物對擴增待檢水稻基因組DNA，如果用引物RM16994能夠擴展出238bp的擴增片段，或者 用引物Y19能夠擴增出221bp的擴增片段，或者用引物Y9能夠擴增出227bp的擴增片段， 或者用引物RM119能夠擴增出166bp的擴增片段，或者用引物RM5757能夠擴增出170bp的 擴增片段，或者用引物RM16999能夠擴增出ISObp的擴增片段，或者用引物RM17004能夠擴 增出261bp的擴增片段，或者用引物RM17008能夠擴增出173bp的擴增片段，均標志著水稻 Swarnalata抗褐飛虱主效基因位點Bph6的存在。該基因位點位于水稻基因組第4染色體 長臂的分子標記RM6997和RM5742之間的區(qū)域內(nèi)。本發(fā)明用RM6997和RM5742篩選了 4500 株BC2F2和BC3F2的單株，得到了在這兩個分子標記間有重組的單株。根據(jù)這些重組單株的 基因型和相應家系的抗蟲級別，分子標記Y19和Y9與抗褐飛虱主效基因Bph6最靠近，同時 分子標記 RM16994、RM119、RM5757、RM16999、RM17004 和 RM17008 均能用于篩選含 Bph6 基 因的抗褐飛虱水稻品種。篩選上述標記引物的過程如下(1)在1988年，Kabir&Khush首先利用經(jīng)典的遺傳分析方法鑒定了水稻品 種Swarnalata抗褐飛虱Bangladesh群體(生物型4)，并將該抗褐飛虱基因命名為 Bph6 (Kabir & Khush. 1988Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice, Oryza sativa L. Plant Breeding 100，54_58)。但至Ij 目前為止，Bph6 在水稻染色體 上的具體位置仍不清楚，這給該抗蟲基因在水稻分子輔助育種中的應用帶來很大的困難。 同時，從Bph6的鑒定到現(xiàn)在已經(jīng)過去二十多年了，世界不同水稻種植地區(qū)的褐飛虱群體遺
5傳結(jié)構可能發(fā)生了一些變化。因此，評價水稻品種Swarnalata對我國主要褐飛虱群體的抗 性級別并且利用SSR分子標記精細定位該抗蟲基因是非常必要的，為該基因在我國的水稻 育種應用提供技術支持。因此，本發(fā)明篩選并開發(fā)了基于PCR技術的SSR分子標記。一方 面，根據(jù)gramene網(wǎng)站(http://www. gramene.org/)公布的標記按照比較均勻的遺傳距離 選擇一定數(shù)目分子標記。另一方面，基于該基因最后的定位區(qū)段，比較水稻品種9311及日 本晴相應的基因組序列，利用SSR搜索工具SSRIT (http://www. gramene. org/db/markers/ ssrtool)來尋找SSR基序，并根據(jù)其側(cè)翼序列設計引物，為備選標記。其中，SSRIT設置參 數(shù)為最大基序長度為4聚體，最小重復數(shù)為5，搜索所有的SSR基序。選擇所有大于15個 堿基(基序長度X重復數(shù))的SSR基序。(2)以感褐飛虱秈稻品種9311為母本，抗褐飛虱品種Swarnalata為父本，配制雜 種，構建了 9311/Swarnalata F2分離群體，用于分子標記分析；每個F2單株通過自交獲得相 應的F2:3家系，用于抗蟲鑒定。(3) M CTAB 法(Murray & Thompson， 1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8:4321-4325)提取親本 Swarnalata和9311及F2群體各株系的DNA。用方法(1)獲得的備選標記對兩親本進行多 態(tài)性篩選，PCR反應在PTC-100擴增儀上進行，擴增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電 泳分析，記錄并選擇在親本間具有多態(tài)性的SSR標記用于后續(xù)分析。(4)采用苗期接蟲進行抗蟲性鑒定，褐飛虱為生物型1和生物型2混合群體。兩 葉一心期按8頭/苗的比例接種2-3齡褐飛虱若蟲，當對照感蟲品種Tm全部死亡時， 參照Huang等的方法對每個單株進行0、1、3、5、7、9級的抗性評價(Huang Z et al,2001 Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice. Theor Appl Genet 102，929-934)，對親本材料和群體中的每個家系通過加權平均計算該 家系的抗性級別。(5)根據(jù)F2單株的抗蟲級別，分別選擇10個極端抗蟲單株和10個極端感蟲單株的 DNA混合構建抗感池。同時，利用在親本間有多態(tài)性的引物分別篩選抗感池并獲得在抗感池 之間有多態(tài)性的分子標記，該類多態(tài)性標記表明與抗性性狀是連鎖的。然后，根據(jù)連鎖標記 所在的染色體，選擇該染色體上在親本間有多態(tài)性的引物篩選F2分離群體的各個單株，PCR 程序同上，獲得群體基因型資料。根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用軟件JoinMap 3. O將群體基因型 資料構建水稻的部分遺傳圖譜并獲得各分子標記的遺傳距離。最后，結(jié)合F2群體各個單株 的分子標記基因型資料和相應的褐飛虱抗性鑒定的抗蟲級別，利用MapQTL 5. O軟件復合 區(qū)間作圖法，對目標染色體進行QTL位點掃描。(6)根據(jù)初次QTL鑒定的結(jié)果，本發(fā)明用RM6997和RM5742篩選了 4500株BC2F2和 BC3F2群體的單株，DNA提取及SSR的PCR電泳分析同(2)，得到了 41株在分子標記RM6997 和RM5742之間有重組的單株。結(jié)合41個重組單株的基因型和相應家系的抗蟲級別，得到 與抗褐飛虱主效基因Bph6共分離的分子標記。本發(fā)明的有益效果1.通過本發(fā)明首次用SSR標記精細定位了水稻品種Swarnalata中的抗褐飛虱主 效基因Bph6。2.通過本發(fā)明分子標記定位的主效基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測與該基因位點連鎖的分子標記，即可以預測水稻植株的褐飛虱抗性，用于水稻品種或品系的基 因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有褐飛虱抗性，進而快速篩選抗蟲品種或品系用于 水稻育種。其檢測方便快速，不受環(huán)境影響。3.輔助育種選擇目標明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗蟲基 因的親本與栽培品種進行一系列雜交，而且要對水稻品種進行抗褐飛虱性狀的鑒定并進行 選擇，操作非常復雜，同時還受環(huán)境的影響。此外，在進行抗蟲鑒定之前，首先要獲得蟲源并 飼養(yǎng)繁殖褐飛虱群體，同時還要求接種蟲源與水稻秧苗苗齡較同步，這同樣給育種工作帶 來麻煩，若不能有效地處理好蟲源、秧苗以及環(huán)境之間的關系，抗褐飛虱的表型鑒定結(jié)果可 靠性就很低。因此，抗蟲育種不僅費時，而且難度大，成本高。然而，通過檢測抗褐飛虱主效 基因位點，可以在苗期就鑒定出高抗褐飛虱的單株，淘汰其他植株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且 大大提高抗褐飛虱水稻的選擇效率，極大地縮短水稻品種的育種周期。


圖1.水稻品種Swarnalata抗褐飛虱主效基因Bph6在第4染色體的定位。A，Bph6 初步定位。水平線表示水稻第四染色體，垂直短線表示染色體上的分子標記，括號內(nèi)的數(shù)值 表示標記間的遺傳距離(cM)，η為群體的單株數(shù)目；B，RM6997和RM5742篩選BC2F2和BC3F2 重組單株的結(jié)果，結(jié)合表現(xiàn)型和基因型結(jié)果，Bph6定位于Y19和Y9之間25kb的區(qū)域。η表 示篩選的BC2F2和BC3F2單株總數(shù)。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。實施例1( -)9311/Swarnalata F2群體構建及表型鑒定(1) 1988年Kabir & Khush首先利用經(jīng)典的遺傳分析方法鑒定了水稻品種 Swarnalata抗褐飛虱Bangladesh群體，并由一對顯性基因控制，于是將該抗褐飛虱基因命 名為Bph6 (Kabir & Khush. 1988 Genetic analysis of resistance to brown ρlanthopper in rice, Oryza sativa L. Plant Breeding 100，54_58)。水稻品種來源于中國農(nóng)業(yè)科學 院種質(zhì)資源庫，Swarnalata來源于國際水稻研究所水稻種質(zhì)資源庫。抗蟲鑒定實驗表明， Swarnalata對我國的褐飛虱群體具有高抗特性。為了尋找簡單有效且與Bph6緊密連鎖的 分子標記，本發(fā)明以感蟲品種9311為母本，以抗褐飛虱品種Swarnalata為父本雜交，得到 的F1再自交，從而構建了 F2分離群體；每個F2單株通過自交獲得相應的F2:3家系。(2)采用苗期接種對親本、F2:3家系進行抗蟲性鑒定。為確保親本和F2:3群體中的 每個家系生長一致，所有供試材料在播種前分別浸種催芽。每個家系(品種)各60粒種 子播種于一個長58cm、寬38cm、高9cm，且盛有7cm厚營養(yǎng)土的面包盒中。每盒每個材料播 種3個重復，其中隨機播種親本和TNl (感性對照)各3個重復。播種7天后間苗，淘汰病 弱苗。待苗長到兩葉一心期時，按8頭/苗的比例接種2-3齡褐飛虱若蟲，最后罩上尼龍紗 網(wǎng)。當感蟲品種Tm全部死亡時，參照Huang等(Huang Z et al, 2001Identification andmapping of two brown ρlanthopper resistance genes in rice. Theor Appl Genet 102, 929-934)的方法對每個單株進行0、1、3、5、7或9級的抗性評價(表1)，對親本材料和群體 的每個家系通過加權平均計算該家系的抗性級別，并根據(jù)抗性級別推測此單株基因型。表1 水稻抗褐飛虱性能鑒定的分級標準 (二)9311/Swarnalata F2群體的分子標記分析(1) M CTAB 法(Murray & Thomp son， 1980 Rapid isolation οfhigh-mo 1 ecu 1 ar-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8 4321-4325)F2 群體各單株的基因組DNA。(2)根據(jù)gramene網(wǎng)站(http://www. gramene. org/)公布的標記按照較均勻的 遺傳距離選擇一定數(shù)目分子標記。另外，基于該基因最后的定位區(qū)段，比較水稻品種9311 及日本晴相應的基因組序列，利用SSR搜索工具SSRIT (http //www. gramene. org/db/ markers/ssrtool)來尋找SSR基序，并根據(jù)其側(cè)翼序列設計引物，為備選標記。其中，SSRIT 設置參數(shù)為最大基序長度為4聚體，最小重復數(shù)為5，搜索所有的SSR基序。選擇所有大 于15個堿基(基序長度X重復數(shù))的SSR基序。(3) SSR 標記的分析參照 Temnykh 的方法(Temnykh S et al, 2000. Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice. Theor Appl Genet 100 697-712)。10μ 1 反應體系包括10mM Tris-HCl pH8. 3,50mMKCl, 1. 5mM MgCl2, 50 μ M dNTPs，0. 2μΜ 引物，0. 5U Taq polymerase 和 20ng DNA 模板。擴增反應在 PTC-100 PCR 儀 上進行94°C 2min ;94°C 15sec，55°C 30sec,72°C 1. 5min，35 個循環(huán)；72°C 5min。擴增 產(chǎn)物用6%的非變性PAGE膠分離，通過銀染顯色(Zhu et al，2004 Identification and characterization of a new blast resistance gene located on rice chromosome lthrough linkage and differential analyses. Phytipathology 94:515—519)。擴JH白勺 DNA條帶利用裝有熒光燈的燈箱進行觀察。記錄結(jié)果，親本間有多態(tài)的引物在F2群體中進 行分析，獲取群體基因型資料。(4)根據(jù)F2單株的抗蟲級別，分別選擇10個極端抗蟲單株和10個極端感蟲單株 的DNA混合構建抗感池。同時，利用在親本間有多態(tài)性的引物分別篩選抗感池并獲得在抗 感池之間有多態(tài)性的分子標記，該類多態(tài)性標記表明與抗性是連鎖的。然后，根據(jù)連鎖標記 所在的染色體，選擇該染色體上在親本間有多態(tài)性的引物篩選F2分離群體的各個單株，PCR 程序同上，獲得群體基因型資料。根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用軟件JoinMap 3. O將群體基因型 資料構建水稻的部分遺傳圖譜并獲得各分子標記的遺傳距離。最后，結(jié)合F2群體各個單株
8的分子標記基因型資料和相應的褐飛虱抗性鑒定的抗蟲級別，利用MapQTL 5. 0軟件復合 區(qū)間作圖法，對目標染色體進行QTL位點掃描。(三)利用分子標記篩選9311/SwarnalataBC2F2和BC3F2群體精細定位Bph6基 因根據(jù)QTL的定位結(jié)果，用兩側(cè)的SSR標記RM6997和RM5742篩選了 BC2F2和BC3F2 單株，獲得兩個標記間發(fā)生重組的單株。結(jié)合檢測各單株的基因型和表型，考察標記與抗性 表型共分離的情況。(四)結(jié)果與分析苗期集團接種鑒定顯示Swarnalata和9311的抗蟲級別分別為2. 9和8. 8，這表明 Swarnalata抗褐飛虱而9311感褐飛虱。140個F2:3家系對褐飛虱的抗蟲級別頻率分布呈 連續(xù)分布，最小為1.4，最大為9.0。根據(jù)對褐飛虱的抗蟲級別將F2:3家系分為抗蟲、抗感分 離和感蟲三種表型，而相應的F2單株的基因型則分別記為RR(純合抗蟲)、Rr(雜合抗蟲) 和rr (純合感蟲)三種。F2群體對褐飛虱的抗感分離符合1 2 1的比例(χ2 = 2. 91， X20.05 = 5 . 99)(表 2)根據(jù)gramene網(wǎng)站(http://www. gramene. org/)公布的標記按照比較均勻的遺 傳距離選擇合成一定數(shù)目的分子標記。另外，基于該基因最后的定位區(qū)段，比較水稻品種 9311及日本晴相應的基因組序列，利用SSR搜索工具SSRIT (http://www. gramene. org/db/ markers/ssrtool)來尋找SSR基序，并根據(jù)其側(cè)翼序列設計引物，為備選標記。用親本間有多態(tài)性的SSR標記分析F2單株的基因型，同時結(jié)合各單株的抗性值進 行QTL掃描(表3)。結(jié)果表明第4染色體長臂RM6997和RM5742間存在一個QTL位點，LOD 值為43. 8，貢獻率為77. 5%，該QTL所在的分子標記RM6997和RM5742相距2. 5cM(圖1)。 RM6997和RM5742的選擇正確率可以達到98% -99%。由于RM6997和RM5742之間距離較大，在測序的粳稻品種日本晴上相距約287kb， 為了尋找與Bph6連鎖更緊密的標記，本發(fā)明用RM6997和RM5742篩選了 4500株F2群體。 結(jié)果顯示，共有41個單株在標記RM6997和RM5742之間存在重組(表4)。于是，用這兩個 標記之間的其他的SSR標記檢測重組單株的基因型，并結(jié)合重組單株的抗蟲鑒定結(jié)果，最 后將Bph6定位于Y19和Y9之間。在測序的日本晴品種中，Y19和Y9之間的物理距離僅有 25kb，因此，利用上述分子標記來鑒定Bph6抗性基因的存在具有非常高的效率，這樣也大 大提高我國水稻抗褐飛虱品種的育種進度。表2 9311/Swarnalata F2分離群體140個單株對褐飛虱抗感分離比 aRR,純合抗蟲；Rr雜合抗蟲；rr，純合感蟲；blRR:2Rr Irr適合性檢測值χ2 = 2. 91，X2a05 = 5.99 ；。抗蟲級別值:RS, Resistance Score (抗蟲級別)表3分子標記篩選的F2重組單株的基因型及表現(xiàn)型 a9311和Swarnalata是兩個親本材料；b從表中，可以看到分子標記RMl 19和 RM17004與抗蟲表型是共分離的。表4分子標記篩選的BC2F2，BC3F2部分重組單株的基因型及表現(xiàn)型 3表中所列單株是部分重組單株，通過分析重組單株基因型和抗蟲級別，最終將 Bph6基因定位于Y19和Y9之間。實施例2分子標記的驗證1、材料和方法1. 1 材料陰性品種10份，感蟲品種9311、日本晴、臺中本地1號、931 IXSwarnalata育種組 合中的不抗蟲材料7份。陽性品種高抗品種Swarnalata和9311 X Swarnalata育種組合中的不抗蟲材料 9份。分子標記引物冊16994、Y19、Y9、RM119、RM5757、RM16999、RM17004、RM17008。
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1. 2 方法CTAB抽提法提取水稻樣品基因組DNA(方法同實施例1)。分別用引物RM16994、 Y19、Y9、RM119、RM5757、RM16999、RM17004、RM17008 擴增樣品 DNA。反應體系中包括 0. 10 μ M 的引物、250μΜ (1^1\1\ 0 反應緩沖液(501111 KClUOmM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2)、 IOOng的DNA模板、IUTaq酶。反應程序為94°C預變性5min，循環(huán)(94°C lmin、51_61°C lmin、72°C lmin)41次，最后72°C延伸lOmin。根據(jù)引物的特性，對退火溫度作相應的修改 (退火溫度分別為55°C (RM16994)、58°C (Y19)、55°C (Y9)、62°C (RM119)、50°C (RM5757)、 55°C (RM16999)、52°C (RM17004)、55°C (RM17008))。PCR擴增產(chǎn)物在 6%的變性(或中性) 聚丙烯胺凝膠電泳分離。電泳后用硝酸銀銀染法染色后讀圖分析。2、結(jié)果用上述方法，分別對水稻品種Swarnalata等二十份不同樣本進行擴增。結(jié)果表 明，在陽性樣本中均能分別擴增出相應的238bp片段、221bp片段、227bp片段、166bp片段、 170bp片段、ISObp片段、261bp片段和173bp片段，而在陰性樣本中均不能擴增出這些片段。由此說明，本發(fā)明提供的分子標記方法能夠準確篩選出含有抗褐飛虱的主效基 因，從而大大提高育種效率。
權利要求
水稻抗褐飛虱主效基因Bph6的分子標記，其由下述之一的引物對經(jīng)PCR擴增獲得1)標記引物RM16994，左端引物序列，TGGCAGTACACACTACAGTACATGC右端引物序列，AGAGGGAGGAGAGAAAGGAAGG；2)標記引物Y19，左端引物序列，GTACGTGTGCGCCATCT右端引物序列，GAGGAGGAGGTCGTGTTGT；3)標記引物Y9，左端引物序列，TAATAAGCACCATGAAAGACAAAA右端引物序列，GCTAGTTCTCACCAAAATCAAAAT；4)標記引物RM119，左端引物序列，CATCCCCCTGCTGCTGCTGCTG右端引物序列，CGCCGGATGTGTGGGACTAGCG；5)標記引物RM5757，左端引物序列，CCTGAGACCATATGCTGCTG右端引物序列，GAGGGAGCATCATTAGCTGG；6)標記引物RM16999，左端引物序列，GCTGATGCGGAACAAGGAGACC右端引物序列，GATCAGATCACCACCCGAATGAGC；7)標記引物RM17004，左端引物序列，GTTATGCCTGGTCCCGTCTGACC右端引物序列，TCTTGACGTACACGCTGATGATGC；或，8)標記引物RM17008，左端引物序列，TTACCTTCGATTAGCTGCTGTTGC右端引物序列，ATTCCTTGCATTACAGACGGTAGC。
2.權利要求1所述分子標記在選育抗褐飛虱水稻中的應用。
3.水稻抗褐飛虱主效基因Bph6的分子標記方法，其通過下述之一的引物對擴增待檢 水稻基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物1)標記引物RM16994,左端引物序列，TGGCAGTACACACTACAGTACATGC 右端引物序列，AGAGGGAGGAGAGAAAGGAAGG ；2)標記引物Y19，左端引物序列，GTACGTGTGCGCCATCT 右端引物序列，GAGGAGGAGGTCGTGTTGT ；3)標記引物Y9，左端引物序列，TAATAAGCACCATGAAAGACAAAA 右端引物序列，GCTAGTTCTCACCAAAATCAAAAT ；4)標記引物RMl19，左端引物序列，CATCCCCCTGCTGCTGCTGCTG右端引物序列，CGCCGGATGTGTGGGACTAGCG ；5)標記引物RM5757，左端引物序列，CCTGAGACCATATGCTGCTG右端引物序列，GAGGGAGCATCATTAGCTGG ；6)標記引物RM16999，左端引物序列，GCTGATGCGGAACAAGGAGACC右端引物序列，GATCAGATCACCACCCGAATGAGC ；7)標記引物RMl7004，左端引物序列，GTTATGCCTGGTCCCGTCTGACC右端引物序列，TCTTGACGTACACGCTGATGATGC ；或，8)標記引物RMl7008，左端引物序列，TTACCTTCGATTAGCTGCTGTTGC右端引物序列，ATTCCTTGCATTACAGACGGTAGC如果用引物RM16994能夠擴展出238bp的擴增片段，或者用引物Y19能夠擴增出221bp 的擴增片段，或者用引物Y9能夠擴增出227bp的擴增片段，或者用引物RM119能夠擴增出 166bp的擴增片段，或者用引物RM5757能夠擴增出170bp的擴增片段，或者用引物RM16999 能夠擴增出ISObp的擴增片段，或者用引物RM17004能夠擴增出261bp的擴增片段，或者用 引物RM17008能夠擴增出173bp的擴增片段，則標志著該待檢水稻存在抗褐飛虱主效基因 Bph6。
4. 一種篩選抗褐飛虱水稻的方法，其用權利要求1中所述的引物對之一擴增待檢水稻 基因組DNA，如果用引物RM16994能夠擴展出238bp的擴增片段，或者用引物Y19能夠擴增 出221bp的擴增片段，或者用引物Y9能夠擴增出227bp的擴增片段，或者用引物RM119能 夠擴增出166bp的擴增片段，或者用引物RM5757能夠擴增出170bp的擴增片段，或者用引 物RM16999能夠擴增出180bp的擴增片段，或者用引物RM17004能夠擴增出261bp的擴增 片段，或者用引物RM17008能夠擴增出173bp的擴增片段，則標志著該待檢水稻存在抗褐飛 虱主效基因Bph6的抗褐飛虱水稻。
全文摘要
本發(fā)明提供了水稻抗褐飛虱主效基因Bph6的分子標記及其應用，本發(fā)明通過將水稻抗蟲品種Swarnalata與9311(♀)雜交獲得的F2各單株的基因型，同時結(jié)合F2:3各家系的抗褐飛虱的抗性級別進行遺傳連鎖分析，獲得抗蟲品種Swarnalata抗性基因Bph6并定位于分子標記Y19和Y9之間。與該基因連鎖的分子標記是RM16994、Y19、Y9、RM119、RM5757、RM16999、RM17004、RM17008之一。本發(fā)明分子標記可以有效檢測抗蟲品種Swarnalata及其衍生品種(系)中是否含有該主效基因位點，大大提高抗褐飛虱水稻的選擇效率，獲得含有Bph6基因的抗褐飛虱水稻品種。
文檔編號C12N15/11GK101914531SQ201010260010
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權日2010年8月19日
發(fā)明者何光存, 邱永福, 郭建平 申請人:武漢大學