專利名稱：改善銀杏葉飼喂適口性及提高其產品生物活性的方法
技術領域：
本發明涉及一種飼料添加劑的制備方法及其產品，尤其涉及一種以銀杏葉、食用菌廢菌渣和豆粕為主要原料，采用微生物將其發酵轉化，以及發酵產物與香味劑進行復配得到一種生物飼料添加劑的方法和由該方法得到的產品，本發明還涉及該產品在養殖業中的應用，屬于飼料領域。
背景技術：
為了片面追求養殖效率或為了防病抗病、減少高密度養殖過程中畜禽的發病率， 養殖戶會大劑量使用一些化學合成的促生長劑、抗生素。這些物質會殘留在畜禽產品內，經食物鏈進入人體，導致人類的一系列疾病；而且這些物質的大量使用，使動物和人體中的細菌產生了較強的耐藥性，并且造成畜禽產品品質下降。近幾年來，人們對安全、衛生、健康、生態、環保等問題日益關注，世界上許多國家紛紛禁止或限制在飼料中使用化學合成物、抗生素。與此同時，在全球范圍內研究、開發與生產無污染、無藥物殘留、既能促進動物生長又能防治動物疾病并可替代抗生素、激素、類激素的天然添加劑倍受重視，而且發展迅速。迄今為止，應用現代高新技術開發、生產出來的天然添加劑主要有動物微生態制劑、飼用酶制劑、飼用低聚糖、中草藥等。但研究表明，若將兩種或兩種以上的生物飼料添加劑按一定比例混合起來制成的產品，可以明顯地提高畜禽的防病抗病能力和促生長作用。銀杏葉除具有一般樹葉的營養外，更重要的是含有黃酮類、萜內酯類、聚戊烯醇類化合物以及生物堿和多糖等活性成分。所以，銀杏葉及其提取物可以作為一種天然的畜禽免疫調節劑和生長促進劑。目前，國內外對銀杏葉的開發利用主要集中在醫藥、生物農藥、 食品、化裝品等方面。盡管也有直接利用銀杏葉作為飼料添加劑的研究報道，但其適口性較差、生物活性不顯著、纖維素、半纖維素等大分子難以被單胃動物利用。近年來的動物應用試驗表明，大豆異黃酮具有促進動物生長、增強機體免疫力、提高動物泌乳、增加產蛋量和蛋重及提高繁殖機能等多種營養生理功能。豆粕是食用油加工中產生的副產品，大豆異黃酮主要殘留在豆粕中，并主要以糖苷型為主的異黃酮形式存在。 豆粕用作飼料時，由于細胞壁的作用大豆異黃酮不易被動物消化吸收，而且研究表明，在動物體內糖苷型的異黃酮不能直接被吸收，而是先被小腸的β -葡萄糖苷酶水解后脫去糖基進入血液中，才能發揮各種生理作用。而小腸的葡萄糖苷酶由于個體差異，活性有很大的差別。如果直接利用苷元型異黃酮，則能迅速發揮作用。因此，提高豆粕中異黃酮的利用率以及把以糖苷型為主的異黃酮轉化為具有更高生理活性的苷元型異黃酮具有重要的意義。另一方面，食用菌廢菌渣指的是食用茵被采收后殘留在栽培瓶或栽培袋內的培養料。培養料中具有生物活性的營養素和酶可以作為天然的抗氧化劑和抗炎藥物，利用食用菌廢菌渣來提高家禽的免疫力、減少抗生素使用量、預防和控制家禽流行性傳染病將有著廣闊的應用前景。

發明內容
解決的技術問題本發明一是克服將銀杏葉和豆粕直接作為畜禽飼料或飼料添加劑使用所存在的適口性差、活性成分利用率低及其生理活性不顯著等缺陷，將銀杏葉和豆粕進行微生物發酵處理和添加香味劑，由其制備得到的產品適口性明顯改善，動物的采食量明顯提高。發酵后，銀杏葉和豆粕中的糖苷型黃酮類化合物分別轉化為相應的苷元型黃酮類化合物，顯著增強了它們的生物活性；二是解決養殖業中動物內源酶不足、飼料轉化率低等問題，通過微生物發酵，同時產生纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶等多組分的復合酶；三是通過在發酵基料中使用食用菌廢菌渣，使得產品中活性物質成分更加多樣化。因此，本發明產品對畜禽具有顯著的促生長和防病抗病等多種功效。技術方案
一種改善銀杏葉飼喂適口性及提高其產品生物活性的方法，包括以下步驟
(1)將固體發酵原料與微生物的營養鹽溶液混合均勻，滅菌，得到固體發酵基料；其中，所述的固體發酵原料由以下重量份的各成分組成銀杏葉5 8份、食用菌廢菌渣1 4份、豆粕1 4份、不超過2份的麩皮或農林廢棄物；
(2)以產葡萄糖苷酶的微生物為菌種，將該菌種擴培后接種到步驟(1)所制備的固體發酵基料中進行發酵；
(3)完成發酵后的物料干燥，粉碎；
(4)加入香味劑混合均勻，即得產品。步驟(1)中所述固體發酵原料的各組成成分的重量份為粉碎后的銀杏葉6 8 份、食用菌廢菌渣2 3份、豆粕1 2份、不超過1. 5份的麩皮。所述的農林廢棄物選自稻草、花生殼、山芋藤或玉米芯中的任意一種或一種以上按任意比例所組成的混合物。步驟(1)所述的微生物營養鹽溶液主要采用改進的察氏培養基，組成和質量百分數為葡萄糖或蔗糖 1 %，NaNO3 0. 2 %, K2HPO4. 3Η20 0. 1 %，MgSO4. 7Η20 0. 05 %，余量為蒸餾水；其中，所述的微生物營養鹽溶液的PH值為4 7，優選5. 0。步驟(1)中將固體發酵原料與微生物的營養鹽溶液按照Ig 1. 2 2. OmL的配比比例進行混合。步驟(2)中所述的產β-葡萄糖苷酶的微生物包括黑曲霉Usper識7ΛΛ5 niger) 或米曲霉(Aspergillus oryzae)。這些微生物不但能產生β -葡萄糖苷酶，還能產生纖維素酶、半纖維素酶、葡聚糖酶、蛋白酶、糖化酶等復合酶；這些微生物可以從自然界中篩選、誘變獲得，也可以從商業途徑購買得到(例如可以購自于中國工業微生物菌種保藏管理中心，網址:http://www. china-cicc. org/)。步驟(2)中，所述的接種為利用孢子進行接種或利用液體種子進行接種；其中，用孢子接種時，當制成的孢子懸浮液中孢子的含量為5 X IO6個/mL時，按體積分數計，接種量為0. 5 5 % ；用液體種子接種時，按體積比計，接種量為1 5% ；發酵條件為濕度80 90%，溫度洸 32°C，發酵時間48 96小時。步驟(4)中所述的香味劑組成及在發酵產品中的質量含量包括檸檬酸0.5-4%、 香蘭素0. 5-3%、乙基麥芽酚0. 1-2%、乙酸乙酯0. 1-0. 5%、椰子醛0. 1-0. 5%和甜味劑 0. 1-0. 5%O上述任何一項制備方法所得到的產品。上述產品作為飼料添加劑的應用，包括按w/w計，在基礎日糧中添加0.01 1.0%的所述產品，混合均勻，用于牛、豬或雞等畜禽養殖用的飼料。有益效果本發明以銀杏葉、食用菌廢菌渣和豆粕為主要原料，以產葡萄糖苷酶的微生物為菌種，通過生物轉化，使得銀杏葉的青氣、藥味減弱或消失并產生花果香味； 使得銀杏葉的糖苷型黃酮類化合物轉化為黃酮醇、豆粕中的糖苷型異黃酮轉化為苷元型異黃酮，增強了生物活性，達到了脫苦的效果，同時添加的香味劑進一步改善了銀杏葉飼喂適口性，提高了動物的采食量。此外，本發明生物飼料添加劑所含的多組分復合酶和具有多種生物活性的營養素，可提高飼料轉化率，消除抗營養因子，補充動物內源酶的不足，能促進機體自身免疫的增強作用，對多種病毒、細菌和寄生蟲有普遍的抵抗作用。本發明產品適口性好，富含多種活性成分，對畜禽具有顯著的促生長和防病抗病作用，并能顯著提高畜禽產品的品質。應用試驗表明，本發明飼料添加劑對畜禽具有顯著的促生長和防病抗病作用。能顯著促進仔豬和乳豬的生長，對其腹瀉疾病的防治具有明顯的效果；能較好地提高蛋雞的產蛋性能并降低雞蛋膽固醇的含量；對奶牛乳房炎具有較好的預防和輔助治療作用；
本發明飼料添加劑的使用方法和用量在基礎日糧中添加0. 01 1. 0% (w/w)本發明飼料添加劑，混合均勻，用于牛、豬、雞等動物養殖的飼料，按常規飼喂方法和用量投喂。
具體實施例方式下面通過實施例子對本發明作進一步說明。應當指出，這些實施例子僅僅是對本發明的例證，不應該理解為對本發明的限制。實驗所用的微生物菌種
1、黑曲霉Usper識7ΛΛ5眾·#)，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；商品編號 CICC 2158 ；
2、米曲霉(As/^r^/Bmorj^ae)，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；商品編號 CICC 2014 ；
實施例1
(1)試驗菌的選用與擴培以黑曲霉Us/^r^/BMniger )為菌種，利用察氏培養基 (察氏培養基各組分及其重量百分比為葡萄糖或蔗糖2 3 %, NaNO3 0. 2 %，K2HPO4. 3H20 0. 1 %，MgSO4. 7H20 0. 05 %，KCl 0. 05%, FeSO4. 7H20 0. 001%，余量為蒸餾水)的斜面或茄子瓶培養黑曲霉獲得黑曲霉孢子，加生理鹽水制成孢子懸浮液，孢子的含量為5X106f/mL ；
(2)微生物的營養鹽溶液的配制按葡萄糖(即每IL營養鹽溶液中含葡萄糖10g， 下同)、NaNO3 0. 2 %、K2HPO4. 3H20 0. 1 %、MgSO4. 7H20 0. 05 % 的量依次稱取并溶解于 50mM、PH5. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配成營養鹽溶液；
(3)發酵基料的制備發酵基料的制備發酵原料按粉碎后的銀杏葉食用菌廢菌渣 豆粕麩皮=7. 5 1.0 1.0 0. 5的重量比例稱取；按固液比1 :1. 6(即IOOg發酵原料中加 Al60mL營養鹽溶液)的比例將發酵原料與營養鹽溶液混合，攪拌均勻；將配制好的發酵基料在121°C下滅菌50min，取出，冷卻；
(4)發酵按常規的微生物無菌操作要求，將擴培后的黑曲霉種子接入所制備的發酵基料中，接種量為5%vt，攪拌均勻，在濕度90%、溫度28 °C條件下發酵72小時；
(5)發酵完成后的物料干燥，粉碎。(6)加入香味劑香味劑組成及在發酵產品中的質量百分比含量為檸檬酸2%、香蘭素1%、乙基麥芽酚1%、乙酸乙酯0. 25%、椰子醛0. 25%和甜味劑0. 25%。實施例2
(1)試驗菌的選用與擴培以米曲霉Us/^rgiBMoryzae)為菌種，利用察氏液體培養基(察氏培養基各組分及其重量百分比為葡萄糖或蔗糖 2 3 %, NaNO3 0.2 %， K2HPO4. 3H20 0.1 %, MgSO4. 7H20 0. 05 %, KCl 0. 05%, FeSO4. 7H20 0· 001%，余量為蒸溜水)制備米曲霉的液體種子，培養時間為48h ；
(2)微生物的營養鹽溶液的配制按葡萄糖1.0%(即每IL營養鹽溶液中含葡萄糖10g， 下同)，NaNO3 0. 2 %、K2HPO4. 3H20 0. 1 %、MgSO4. 7H20 0. 05 % 的量依次稱取并溶解于 50mM、 pH5. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配成營養鹽溶液；
(3)發酵基料的制備發酵原料按粉碎后的銀杏葉食用菌廢菌渣豆粕麩皮=7.0 1.5 1.0 0. 5的重量比例稱取；按固液比1 1.8 (即IOOg發酵原料中加入180mL營養鹽溶液)的比例將發酵原料與營養鹽溶液混合，攪拌均勻；將配制好的發酵基料在121°C下滅菌50min，取出，冷卻；
(4)發酵按常規的微生物無菌操作要求，將擴培后的米曲霉種子接入所制備的發酵基料中，接種量為8%vt，攪拌均勻，在濕度90%、溫度30 °C下培養72h ；
(5)發酵完成后的物料干燥，粉碎。(6)加入香味劑香味劑組成及在發酵產品中的含量為檸檬酸3%、香蘭素1%、乙基麥芽酚0. 5%、乙酸乙酯0. 3%、椰子醛0. 2%和甜味劑0. 2%。實施例3
(1)試驗菌的選用與擴培以黑曲霉Us/^r^/BMniger )為菌種，利用察氏培養基 (察氏培養基各組分及其重量百分比為葡萄糖或蔗糖2 3 %, NaNO3 0. 2 %，K2HPO4. 3H20 0. 1 %，MgSO4. 7H20 0. 05 %，KCl 0. 05%, FeSO4. 7H20 0. 001%，余量為蒸餾水)的斜面或茄子瓶培養黑曲霉獲得黑曲霉孢子，加生理鹽水制成孢子懸浮液，孢子的含量為5X106f/mL ；
(2)微生物的營養鹽溶液的配制按葡萄糖1.0%(即每IL營養鹽溶液中含葡萄糖10g， 下同)，NaNO3 0. 2 %、K2HPO4. 3H20 0. 1 %、MgSO4. 7H20 0. 05 % 的量依次稱取并溶解于 50mM、 pH5. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配成營養鹽溶液；
(3)發酵基料的制備發酵原料按粉碎后的銀杏葉食用菌廢菌渣豆粕麩皮=6.0 2.0 1.0 1.0的重量比例稱取；按固液比1 2. 0 (即IOOg發酵原料中加入180mL營養鹽溶液)的比例將發酵原料與營養鹽溶液混合，攪拌均勻；將配制好的發酵基料在121°C下滅菌50min，取出，冷卻；(4)發酵按常規的微生物無菌操作要求，將擴培后的黑曲霉種子接入所制備的發酵基料中，接種量為2%vt，攪拌均勻，在濕度90%、溫度沈°C條件下發酵96小時；
(5)發酵完成后的物料干燥，粉碎。(6)加入香味劑香味劑組成及在發酵產品中的含量為檸檬酸1%、香蘭素2%、乙基麥芽酚0. 8%、乙酸乙酯0. 3%、椰子醛0. 2%和甜味劑0. 5%。試驗例1本發明飼料添加劑的有關性能試驗
供試樣品本發明實施例1、2和3所制備的動物飼料添加劑，分別編號為產品1、2和3。一、本發明飼料添加劑風味品質及糖苷型黃酮類化合物含量的檢測試驗檢測方法
采用水蒸汽蒸餾法在相同的條件下分別制得銀杏葉發酵前和發酵后(供試樣品)樣品的精油。采用GC/MS對精油化學成分進行分析。各化合物的相對含量由GC面積歸一化法計算。香氣物質含量以所含的主要代表物β -芳樟醇、橙花叔醇、β -桉葉醇、β -紫羅蘭酮的總量計。采用HPLC法測定銀杏葉發酵前后黃酮醇(糖苷型黃酮類化合物含量)和黃酮醇苷類(苷元型黃酮類化合物)的變化。色譜柱為Cw柱，檢測波長為370nm，流動相為甲醇-水-磷酸(55:45:0.5)。采用標準品(槲皮素、山萘酚、異鼠李素、蘆丁)并結合指紋圖譜分析。糖苷型黃酮類化合物含量主要以蘆丁含量計；苷元型黃酮類化合物的含量主要以槲皮素、山萘酚、異鼠李素計。大豆異黃酮及其糖苷型異黃酮和苷元型異黃酮的測定也采用 HPLC法。色譜柱為C18柱，檢測波長為260nm,以1. 5%乙酸-甲醇-乙腈(70 22. 5 7. 5) 為流動相等度洗脫，檢測波長260nm。檢測結果見表1。
表1本發明銀杏葉飼料添加劑風味品質及苷元型黃酮類化合物含量的變化
權利要求
1.一種改善銀杏葉飼喂適口性及提高其產品生物活性的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將固體發酵原料與微生物的營養鹽溶液混合均勻，滅菌，得到固體發酵基料；其中，所述的固體發酵原料由以下重量份的各成分組成銀杏葉5 8份、食用菌廢菌渣1 4份、豆粕1 4份、不超過2份的麩皮或農林廢棄物；(2)以產葡萄糖苷酶的微生物為菌種，將該菌種擴培后接種到步驟(1)所制備的固體發酵基料中進行發酵；(3)完成發酵后的物料干燥，粉碎；(4)加入香味劑混合均勻，即得產品。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述固體發酵原料的各組成成分的重量份為粉碎后的銀杏葉6 8份、食用菌廢菌渣2 3份、豆粕1 2份、不超過1.5份的麩皮。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的農林廢棄物選自稻草、花生殼、山芋藤或玉米芯中的任意一種或一種以上按任意比例所組成的混合物。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的微生物營養鹽溶液主要采用改進的察氏培養基，組成和質量百分數為葡萄糖或蔗糖1 %，NaNO3 0.2 %， K2HPO4. 3Η20 0.1 %，MgSO4. 7Η20 0. 05 %，余量為蒸餾水；其中，所述的微生物營養鹽溶液的 PH值為4 7。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中將固體發酵原料與微生物的營養鹽溶液按照Ig :1. 2 2. OmL的配比比例進行混合。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的產β-葡萄糖苷酶的微生物包括黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中，所述的接種為利用孢子進行接種或利用液體種子進行接種；其中，用孢子接種時，當制成的孢子懸浮液中孢子的含量為5 X IO6個/mL時，按體積分數計，接種量為0.5 5 % ；用液體種子接種時，按體積比計，接種量為1 5% ；發酵條件為濕度80 90%，溫度沈 32°C，發酵時間48 96小時。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述的香味劑組成及在發酵產品中的質量含量包括檸檬酸0. 5-4%、香蘭素0. 5-3%、乙基麥芽酚0. 1-2%、乙酸乙酯 0. 1-0. 5%、椰子酸 0. 1-0. 5% 和甜味劑 0. 1-0. 5%O
9.權利要求1-8任何一項制備方法所得到的產品。
10.權利要求9所述的產品作為飼料添加劑的應用，包括按w/w計，在基礎日糧中添加0. 01 1. 0%的權利要求9所述的產品，混合均勻，用于牛、豬或雞等畜禽養殖用的飼料。
全文摘要
改善銀杏葉飼喂適口性及提高其產品生物活性的方法，將銀杏葉、食用菌廢菌渣、豆粕等組成的固體發酵原料與微生物的營養鹽溶液混合均勻，滅菌，得到固體發酵基料；以產β-葡萄糖苷酶的微生物為菌種，將該菌種擴培后接種到所制備的固體發酵基料中進行發酵；完成發酵后的物料干燥，粉碎；加入香味劑混合均勻，即得產品。應用試驗表明，本發明飼料添加劑對畜禽具有顯著的促生長和防病抗病作用。能顯著促進仔豬和乳豬的生長，對其腹瀉疾病的防治具有明顯的效果；能較好地提高蛋雞的產蛋性能并降低雞蛋膽固醇的含量；對奶牛乳房炎具有較好的預防和輔助治療作用。
文檔編號A23K1/16GK102318743SQ20111029216
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者曹福亮, 汪貴斌, 趙林果 申請人:南京林業大學