專利名稱：一種華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法
技術領域：
本發明屬于貝類育種技術領域，具體涉及一種華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法。
背景技術：
華貴櫛孔扇貝[Chlamys(Minachlamys)nobilis (Reeve，1852)]為暖水性貝類，自然分布于日本的本州、四國、九州，中國的南海及印度尼西亞等地。在廣東省沿海的海門、 遮浪、大亞灣、大鵬灣、間坡等地均有分布。華貴櫛孔扇貝為雌雄異體型海洋雙殼貝類，1年左右達性成熟，雌性性腺為橘黃色，雄性性腺為乳白色，繁殖期在廣東沿海為5-10月，以 5-6月為繁殖盛期，可產卵300-1500萬粒。廣泛存在雌雄同體及性轉換現象。周年內進行性轉換的比例占總數的4. 47%，其中雄性進行轉換的比例是5. 17%，雌性進行轉換的比例是 4. 0%。雌、雄同體及性轉換主要的發生時間在12-2月和7-8月。目前，理論上有兩種方法進行生物體純合體的構建培育，其中基因純化速度最快的是通過雌核發育或雄核發育，但目前對貝類的雄核發育研究尚無報道，對貝類的雌核發育雖有一些研究，但在技術方面難度很大，目前尚不能在實際研究中進行應用。另外一種方法是近親繁殖，包括自交、全同胞交配、半同胞交配、回交等多種交配策略。其中，近親繁殖中親緣關系最近的交配方式是自交，自交的基因純化速率遠遠快于其它的近交方式，自交主要是利用雌雄同體或性轉變現象建立自交系，在技術上可有兩種方法一是利用精子低溫冷藏技術和性轉現象結合進行自交建立自交系，但目前海水貝類的精子低溫冷藏技術研究還處于初期階段，該技術的應用還需以時日；另一種較可行的方法是利用雌雄同體個體的成熟精卵通過自體受精建立自交系。太平洋牡蠣是一種雌雄異體型貝類，Hedgecock等 (1995)利用少數的雌雄同體個體的雌雄配子進行自體受精建立了自交系，王梅芳等(2006) 對馬氏珠母貝雌雄同體個體的自體受精及其早期胚胎發育進行了研究，發現自體受精的受精率明顯低于異體受精，發育過程中有較多的卵裂球解體，部分胚胎可發育成D型幼蟲，但未能培育出幼苗。張國范等(2003)成功地利用雌雄同體型的海灣扇貝構建了自交家系。對于雌雄異體型貝類，其雌雄配子同體個體的比例較低，而且其雌、雄配子同時發育成熟的情況更是少見。在華貴櫛孔扇貝，雖然通過組織切片觀察到了雌雄同體現象的存在，但利用該現象構建自交系的方法并沒有報道，而且也未見通過解剖法進行人工授精方法的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法。本發明采取如下方案達到上述目的從華貴櫛孔扇貝中選擇出雌雄同體的個體， 采用自交的方法建立和培育自交系。所述的自交的方法為挑選性腺成熟的、外觀上為雌性的華貴櫛孔扇貝，顯微鏡檢查性腺組織，挑選出同時含有卵和精子的個體，即雌雄同體型個體，對其進行誘導催產，每個個體在相互隔離的條件下獨立排放精、卵，并使同一個個體所產的精、卵進行自體受精， 然后按該物種的常規技術進行胚胎孵化、幼蟲培育及養成，在操作過程中采取常規的隔離措施，避免自交系以外的個體混入其中。其操作步驟如下
雌雄同體個體的鑒別將性腺飽滿的、顏色為橘黃色的貝編號，每一個貝用注射器針穿刺性腺組織，涂抹在載玻片上并滴一滴海水，將載玻片上置于顯微鏡下觀察，如樣品中含有卵和精子，則該個體為雌雄同體型。催產和授精將挑選出的雌雄同體個體陰干30-60分鐘后，流水沖20-30分鐘， 將每個貝單獨放入一個容器中，每個容器中事先加入比原培育水溫高3- 5 ！的海水。觀察貝的精卵排放情況。將同一個個體所產的卵子與精子進行受精，避免其他個體的配子混入。針對精卵排放不同步及數量差異懸殊的具體情況，本發明在催產和受精過程中采取下述措施人為增加或減少精子數量以對水體中精、卵的相對比例進行人工干預和調節 對于先產精后產卵的情況，當含有精子的水體呈現乳白色時，將貝取出置于另一容器中繼續排放，并保留精液；當該貝開始排卵時，即刻將該貝取出并沖洗，然后置于新鮮的過濾海水中讓其產卵，當產卵水體中卵的數量達到10個/mL以上或不再排放時，取樣于顯微鏡下觀察，當50 %以下的卵子外周可觀察的精子數量少于一個時，按體積比1 :100加入該貝的精液，并攪動水體，3- 5分鐘后取樣于顯微鏡下觀察，到90%以上的卵子外周可觀察到 1-2個精子時停止加入精液；30分鐘后用虹吸法換水。對于先產卵后產精的情況，當產卵量達到10個/mL以上時，將貝取出置于另一容器中讓其排精，然后按體積比1 :100加入精液該貝所產卵中。針對產精不產卵或產卵不產精的具體情況，本發明采用解剖性腺法和氨海水刺激法進行人工授精。對于產精不產卵，產卵不產精的個體，在常規催產結束后對親本生殖腺進行解剖，然后將獲得的配子在氨海水中進行人工授精。具體操作方法為用解剖刀剖開貝體，剪取性腺并剪碎，用200-300目篩絹袋擠壓性腺組織，獲得擠壓物。對產精不產卵的情況，將性腺組織擠壓物放入較大容器中，事先盛有50 - 200升的0.002-0. 005%的氨海水， 30分鐘后吸出容器上層2/3的水體，并加入過濾海水，重復3次。對產卵不產精的情況，則將擠壓物置于IL的0. 002-0. 005%的氨海水中，按1 :100的體積比加入已收集的卵中，顯微鏡檢查卵周圍精子的數量，當50%卵周圍的精子少于1個時，添加精液直至90%以上的卵周圍有1-2個精子時停止。按常規技術進行孵化、幼蟲培育和養殖，并防止不同親本間的污染。本發明中關鍵的步驟在于(1)利用華貴櫛孔扇貝自然存在的雌雄同體現象，通過顯微檢查鑒別出雌雄同體個體；(2)通過解剖法獲取通過誘導法不能獲得的配子，并通過氨海水刺激法促進精、卵成熟，并完成受精和胚胎發育；(3)精子數量過多，會導致華貴櫛孔扇貝胚胎發育失敗，本發明采用鏡檢的方法輔助控制精液量的加入，并通過增大水體和換水的方法稀釋精子的密度，調劑精卵的比例。本發明的優點本發明利用雌雄異體型的華貴櫛孔扇貝中的雌雄同體特殊個體建立自交系，可加快華貴櫛孔扇貝基因的純化速度，加快品種選育速度。本發明操作簡便、不使用特殊的化學試劑，容易推廣應用。
具體實施方式
2009 年 11 月
從大鵬灣養殖群體中挑選出兩齡的性腺較飽滿、顏色為橘黃色的華貴櫛孔扇貝70個， 于室內蓄養3天。蓄養期間，每天換水一次，水溫22°C，且投喂充足的餌料，促進性腺進一步發育成生理成熟狀態。將貝排列編號，每一個貝用注射器針穿刺性腺組織，涂抹在載玻片上并滴一滴海水，將載玻片上置于顯微鏡下觀察，發現4個貝的性腺組織中既有卵子又和有精子。將這4個雌雄同體型個體陰干60分鐘后再流水刺激30分鐘，然后將貝分別置于 4個編號的盛有IL海水(26°C，升溫4°C)的玻璃燒杯中。1、2、4號個體約在10分鐘開始排精，當水體呈乳白色時，將貝取出置于另一燒杯中，并加入同樣的升溫海水，當換水3次后，觀察到1、4號個體開始排卵，將貝取出并用過濾海水沖洗，然后置于干凈的盛有約3L過濾海水的5L玻璃缸中，10分鐘后，已收集有大量的卵，同時加入相應編號貝所產的精液1ml，用玻璃棒攪勻水體，取少量水體于顯微鏡下觀察， 精子游動，卵圓形；但1號個體卵周圍的精子數量較多，約有40%的卵周圍的精子達10個以上，而4號個體卵周圍的精子數量僅1-2個。2小時后統計受精率，1、4號個體的受精率分別為30%和78%。對于華貴櫛孔扇貝，除了每個個體所產的精卵質量、成熟度不同，它們會導致不同的受精率外，精子數量也是一個最為關鍵的因素，數量過多會導致孵化失敗，1號個體受精率較低，可能的主要原因是精子數量過多。一般情況下，卵周圍的精子數量控制在1-2 個較合適，如4號個體。10小時后收集上浮幼蟲進行常規培育，1號個體經3天培育后，幼蟲全部死亡；4號個體在第13天時，開始出現眼點并投入采苗器，幼蟲密度為15個/100ml。 2010年3月，4號貝有120個貝存活，大小為2. 32cm。2號個體于30分鐘開始排卵，但數量少，顯微觀察其精子基本不活動，卵形態不規則，放棄。3號個體未產精產卵。2011年5月
從大亞灣養殖群體中挑選出30個性腺飽滿、顏色為橘黃色的華貴櫛孔扇貝，于室內蓄養4天，蓄養水溫25°C。將貝排列編號，每一個貝用注射器針穿刺性腺組織，涂抹在載玻片上并滴一滴海水，將載玻片上置于顯微鏡下觀察，發現1個貝的性腺組織中既有卵子又和有精子。將這個雌雄同體型個體陰干30分鐘后再流水刺激20分鐘，然后將貝置于盛有3L 海水(29°C，升溫4°C)的玻璃缸中。15分鐘后開始排精，60分鐘后仍沒有觀察到排卵，即刻將該改貝取出并用海水沖洗后剖開，用剪刀剪取性腺并剪碎該組織，并置于200目的篩絹網袋中進行擠壓，將擠壓出的黃色液體置于100L的0. 0025%的氨海水中，鏡檢發現精子過多，大部分卵透明，少部分卵圓形，30分鐘后吸去2/3上清液，再加入過濾海水，重復3次后，將沉到容器底部的卵轉入IOL容器中進行孵化，2小時后統計受精率，為73%。8小時后收集上浮幼蟲，并按常規技術進行幼蟲培育，23天后獲得30個300-500um的稚貝。
權利要求
1.一種華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法，其特征在于從華貴櫛孔扇貝中選擇出雌雄同體的個體，采用自交的方法建立和培育自交系；通過解剖法獲取配子，并通過氨海水刺激法促進精、卵成熟，完成受精和胚胎發育。
2.根據權利要求1所述華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法，其特征在于所述的自交的方法為挑選性腺成熟的、外觀上為雌性的華貴櫛孔扇貝，對其進行誘導催產，每個個體在相互隔離的條件下獨立排放精、卵，并使同一個個體所產的精、卵進行自體受精，然后進行胚胎孵化、幼蟲培育及養成；在操作過程中采取隔離措施，避免自交系以外的個體混入其中。
3.根據權利要求1或2所述華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法，其特征在于雌雄同體個體的鑒別方法為用注射器針穿刺性腺組織，涂抹在載玻片上并滴一滴海水，將載玻片上置于顯微鏡下觀察，如樣品中含有卵和精子，則該個體為雌雄同體個體。
4.根據權利要求1或2所述華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法，其特征在于催產和授精的方法為將挑選出的雌雄同體個體陰干30-60分鐘后，流水沖20-30分鐘，將每個貝單獨放入一個容器中，每個容器中事先加入比原培育水溫高3- 5 °C的海水；觀察貝的精卵排放情況；將同一個個體所產的卵與精子進行受精，避免其他個體的配子混入。
5.根據權利要求1或2所述華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法，其特征在于對于先產精后產卵的情況，采取以下措施當含有精子的水體呈現乳白色時，將貝取出置于另一容器中繼續排放，并保留精液；當該貝開始排卵時，即刻將該貝取出并沖洗，然后置于新鮮的過濾海水中讓其產卵，當產卵水體中卵的數量達到10個/mL以上或不再排放時，取樣于顯微鏡下觀察，當50 %以下的卵子外周可觀察的精子數量少于一個時，按體積比1 :100加入該貝的精液，并攪動水體，3- 5分鐘后取樣于顯微鏡下觀察，到90%以上的卵子外周可觀察到1-2個精子時停止加入精液。
6.根據權利要求1或2所述華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法，其特征在于對于先產卵后產精的情況，采取以下措施當產卵量達到10個/mL以上時，將貝取出置于另一容器中讓其排精，然后按體積比1 :100加入精液到該貝所產卵中。
7.根據權利要求1或2所述華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法，其特征在于針對產精不產卵或產卵不產精的情況，采取以下措施對于產精不產卵，產卵不產精的個體，在常規催產結束后對親本生殖腺進行解剖，然后將獲得的配子在氨海水中進行人工授精。
8.根據權利要求7所述華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法，其特征在于用解剖刀剖開貝體，剪取性腺并剪碎，用200-300目篩絹袋擠壓性腺組織，獲得擠壓物；對產精不產卵的情況，將性腺組織擠壓物放入較大容器中，事先盛有50 - 200升的0.002-0. 005%的氨海水，30分鐘后吸出容器上層2/3的水體，并加入過濾海水，重復3次；對產卵不產精的情況， 則將擠壓物置于IL的0. 002-0. 005%的氨海水中，按1 :100的體積比加入已收集的卵中， 顯微鏡檢查卵周圍精子的數量，當50%卵周圍的精子少于1個時，添加精液直至90%以上的卵周圍有1-2個精子時停止。
全文摘要
本發明涉及一種華貴櫛孔扇貝自交系的建立方法，該方法能快速對華貴櫛孔扇貝基因組進行純化，加快其品種選育速度。通過顯微檢查，挑選出外觀上為雌性的含有雌、雄生殖細胞的個體，即雌雄同體型個體，通過誘導催產或解剖授精的方法，使同一個體的精卵受精，并采取措施人為增加或減少精子數量以對水體中雌雄兩種配子的相對比例進行人工干預和調節，按該物種的常規技術進行孵化、培育和養殖，建立自交系。本發明操作簡便、不使用特殊的化學試劑，容易推廣應用。
文檔編號A01K61/00GK102440207SQ20111030367
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月10日 優先權日2011年10月10日
發明者何毛賢, 劉文廣 申請人:中國科學院南海海洋研究所