專利名稱：一種富含dha的華貴櫛孔扇貝新品系的培育方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種貝類遺傳育種研究中選擇育種和遺傳改良技術，具體地說，是一種富含DHA的華貴櫛孔扇貝新品系的培育方法及其應用。
背景技術：
二十二碳六烯酸(DHA)，俗稱“腦黃金”，是人體必需的一種長鏈多價不飽和脂肪酸，是大腦細胞膜的重要構成成分，參與腦細胞的形成和發育，對神經細胞軸突的延伸和新突起的形成有重要作用，可維持神經細胞的正常生理活動，參與大腦思維和記憶形成過程。DHA還是視網膜光受體中最豐富的長鏈多價不飽和脂肪酸，是視網膜的重要構成成分，對促進視網膜組織的發育，促進視功能的發展，改善視敏銳性等具有重要作用。DHA同維生素、礦物質一樣也是人體的必需營養物質，在人體大腦皮層中含量高達20%，在眼睛視網膜中所占比例最大，約占50%。因此，對胎嬰兒智力和視力發育至關重要，同時也可有效地預防老年 癡呆、視力衰退等。近年研究表明，DHA還能夠降低膽固醇、抑制血小板聚集，從而預防心血管疾病。此外，DHA還具有很強的抗氧化功能，能夠提高機體免疫力、阻止腫瘤細胞的增生。然而，人體不能夠自己合成DHA，必須從食物中獲得。因此，如何提高食物中的DHA含量越來越引起人們的重視。華貴柿孔扇貝(Chlamys nobilis Reeve)以其貝殼具有橙色、橙紫色、紫色、褐色等多種絢麗的色彩而聞名，以營養豐富、味道鮮美、肉質細嫩而著稱，其閉殼肌制成的干品俗稱“干貝”，是著名的海產八珍之一。已有研究表明，通過人工選育能夠培育出色澤美觀、商品價格高的新品種。鑒于DHA對人類健康的重要作用和人類對其需求的日益增加，如果能夠培育出既美觀又富含DHA的貝類新品種，其產品價格將被成倍地提高。這樣不僅解決了目前華貴櫛孔扇貝養殖業遭遇的產品價格賤、產值低等問題，而且也可以進一步豐富我國海水養殖業的多品種需求。在貝類，利用人工選擇改良生長、存活等性狀一直都有大量的報道，但一直沒有利用人工選擇培育富含DHA的貝類新品種的報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種富含DHA的華貴櫛孔扇貝新品系的培育方法，該方法經過2代定向選育，培育的新品系性狀穩定，色澤美觀貝殼、閉殼肌、外套膜均為橙色，而且體內組織還富含DHA。本發明的富含DHA的華貴櫛孔扇貝新品系的培育方法包括選種、培育第一代(Fl代)家系和培育第二代(F2代)新品系，其特征在于，選種步驟為選擇年齡為1-2齡、健康且性腺發育飽滿，貝殼、閉殼肌和外套膜的顏色均為橙色的雌、雄種貝；培育F2代新品系的步驟為從Fl代家系中篩選貝殼、閉殼肌、外套膜的色澤純度均達95%以上的橙色家系作為種貝，建立F2代家系和群體，培育出性狀穩定、富含DHA的橙色F2代新品系。其中，培育Fl代家系的步驟包括單個個體催產、單配授精建立Fl代家系、Fl代幼蟲培育、Fl代稚貝養成。具體地，該培育方法包括下列步驟(I)選種選擇年齡為1-2齡、健康且性腺發育飽滿，貝殼、閉殼肌和外套膜的顏色均為橙色的雌、雄種貝；(2)單個個體催產將(I)中雌、雄種貝陰干后，向所述雌、雄種貝的卵巢和精巢內注射5-羥色胺溶液，使雌、雄種貝產卵、排精，分別收集卵子和精子；(3)單配授精建立Fl代家系用單個個體少量的精子與單個個體全部的卵子進行單配授精，孵化受精卵至D形幼蟲，收集幼蟲，建立Fl代家系；(4) Fl代幼蟲培育、Fl代稚貝養成； (5)培育F2代新品系對Fl代家系進行顏色純度檢查，從Fl代家系中篩選貝殼、閉殼肌、外套膜的色澤純度均達95%以上的橙色家系作為種貝，按步驟(2) (4)通過家系內單配交配和隨機交配建立F2代家系和群體，培育出性狀穩定、富含DHA的橙色F2代新品系O上述培育方法中，步驟(2)為將(I)中雌、雄種貝陰干后，向所述雌、雄種貝的卵巢和精巢內注射5-羥色胺溶液，再立即將雌、雄種貝單個地放入盛有砂濾海水的不同容器中，該雌、雄種貝產卵、排精后分別收集卵子和精子。步驟(4)為Fl代幼蟲培育、Fl代稚貝養成將(3)中收集的幼蟲分別放入培育桶中進行培育，幼蟲培育的初始密度為2-3個/ml，水溫為23-28°C，鹽度為28-33，每天全換水一次，連續充氣；幼蟲館料第I周為球等鞭金藻(Isochrysis galbana), I周后為球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和青島大扁藻(Platymonas subcordiformis. (wille)Hazen)(體積比為1:1);日投餌量隨幼蟲的生長而逐漸增加，第I天總投餌量為3000-4000個藻類細胞/ml/天，5天后逐漸增加到每天總投餌量50000-60000個藻類細胞/ml/天，投餌次數第I天為2次/天，5天后逐漸增加到6次/天；每天取樣鏡檢幼蟲的攝食和生長情況，每兩天對幼蟲培養密度進行定量，并通過調節培養水體以使每個培育桶中的幼蟲密度基本一致，幼蟲培育期間不加抗生素，當20% -30%的幼蟲出現眼點時，投放處理好的棕繩采苗器，投放量按每根棕繩附著2000-3000粒苗，當水體中的浮游幼蟲全部附著變態后，繼續在室內培養一周，然后將附有稚貝的棕繩放入聚乙烯網中，做好標記后，在天氣晴朗的下午出池，掛到海上進行稚貝養成；稚貝放到海上養殖后，定期檢查稚貝的生長和存活情況，及時分苗并更換養殖籠，隨著稚貝的生長，養殖密度由初始的300-400個/層逐漸減少到100個/層，最后的養殖密度為30-40個/層；網目也由初始的60目逐漸更換為20目，由孔徑I. 3cm的養殖籠更換為3cm的養殖籠。步驟(5)為培育F2代新品系對Fl代家系進行顏色純度檢查，在扇貝生長到3-4cm時，檢查每個家系中貝殼顏色；在扇貝生長到5-6cm時，檢查每個家系中閉殼肌顏色和外套膜顏色；WF1代家系中篩選貝殼、閉殼肌、外套膜的色澤純度均達95%以上的橙色家系做為種貝，按步驟(2廣(4)通過家系內單配交配和隨機交配建立F2代家系和群體，培育出性狀穩定、富含DHA的橙色F2代新品系。其中，步驟(2)中5-羥色胺溶液的濃度為0.02-lmM，注射量為O. 1-0. 5ml/枚種貝。
步驟(3)中孵化的水溫為23_28°C，鹽度為28-33。優選地，步驟(2)中5-羥色胺溶液的濃度為O. 06mM，注射量為O. 3ml/枚種貝。優選地，步驟(3)中孵化的水溫為26°C，鹽度為30。優選地，步驟(4)中幼蟲培育的初始密度為3個/ml，水溫為26°C，鹽度為30。日投餌量第I天總投餌量為3500個藻類細胞/ml/天，5天后逐漸增加到總投餌量為55000個藻類細胞/ml/天。當30%的幼蟲出現眼點時，投放處理好的棕繩采苗器，投放量按每根棕繩附著2500粒苗。養殖密度由初始的350個/層逐漸減少到100個/層，最后的養殖密度為35個/層。優選地，步驟(5)中對Fl代家系進行顏色純度檢查，在扇貝生長到3. 5cm時，檢查每個家系中貝殼顏色；在扇貝生長到5. 5cm時，檢查每個家系中閉殼肌顏色和外套膜顏色。 對培育出的富含DHA的橙色F2代新品系進行DHA含量測定測定的組織包括閉殼肌和外套膜。從橙色F2代新品系中各取15個雌性個體和雄性個體，活體解剖取其閉殼肌和外套膜，真空冷凍干燥并研磨粉碎，然后按Folch等的A simple method forthe isolationand purification of total lipids from animal tissues.J BiolChemj 1957，226，497—509 的方法提取總脂肪;再按 Morrison 等的 Preparation offattyacid methyl esters and dimethylacetals from lipids with boronfIuoride-methanoI.J Lipid Res, 1964，5，600-608的方法進行甲酯化，然后用氣相色譜測定閉殼肌和外套膜中的DHA含量。同時從養殖群體中也各取15個其他殼色的雌性個體和雄性個體作為對照，活體解剖取其閉殼肌和外套膜，按上述程序測定閉殼肌和外套膜中的DHA含量。本發明的另一目的是提供上述培育方法在其他貝類新品種培育中的應用。華貴櫛孔扇貝是我國南方沿海重要的海水養殖種類之一，其普通群體中絕大多數個體的貝殼是褐色的、閉殼肌和外套膜是白色的，其閉殼肌的DHA平均含量在
20.0%-22. 5%、外套膜的DHA平均含量在18. 0%_20. 0% ;但存在極少數(〈1%)個體不但貝殼為橙色，其閉殼肌、外套膜也均為橙色，這種橙色的閉殼肌、外套膜等組織中DHA的含量較高，其閉殼肌的DHA平均含量在22. 5%-24. 0%、外套膜的DHA平均含量在22. 0%-23. 0%。通過測定連續選育Fl和F2選育家系中的DHA含量，發現DHA能夠穩定地遺傳。本發明的培育方法培育出的華貴櫛孔扇貝F2代新品系富含更高含量的DHA，并且也能夠穩定遺傳，可用其來直接繁育富含DHA的華貴櫛孔扇貝。本發明的富含DHA的華貴櫛孔扇貝新品系的培育方法的優點如下I)本發明的培育方法通過2代選育就能夠獲得理想的目標性狀，加速了新品系培育進程。2)本發明從感官色澤、營養角度培育養殖貝類新品系，開辟了貝類品種培育的新途徑，為其他貝類新品種的培育起到了示范作用。3)本發明的培育方法培育的新品系性狀穩定，色澤美觀貝殼、閉殼肌、外套膜均為橙色，而且體內組織還富含DHA，F2代新品系閉殼肌和外套膜組織中的DHA含量分別提高了 10%以上和20%以上，更有利于人類的健康，具有顯著的經濟價值、保健價值和藥用價值，提高了產品的附加值，市場銷售價格成倍增長，增加了養殖企業和養殖戶的收入，市場前景廣闊。4)本發明的培育方法培育出的富含DHA的華貴櫛孔扇貝F2代新品系能夠穩定遺傳，可用其來直接繁育富含DHA的華貴櫛孔扇貝。5)通過本發明的培育方法可提高扇貝的質量和市場價格，有效地遏制養殖業產品價格賤、產值低等問題，為扇貝養殖業的發展提供一條新途徑。、6)本發明的培育方法不需要通過轉基因、藥物處理等復雜技術，在短時間內即可培育出新品系，且對生物和環境安全沒有影響。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。DHA含量檢測測定的組織包括閉殼肌、外套膜兩部分。從Fl代家系或F2代新品系或其他殼色的養殖群體中隨機各取15個雌性個體和雄性個體，活體解剖取其閉殼肌和外套膜，真空冷凍干燥并研磨粉碎，然后按Folch等(1957)方法提取閉殼肌和外套膜中的 總脂肪；再按Morrison等(1964)的方法對脂肪進行甲酯化，然后用氣相色譜測定閉殼肌和外套膜中的DHA含量。實施例I時間2008年4月-2010年4月，地點汕頭大學南澳臨海海洋生物試驗站。種貝I齡，殼長58. 2mm、殼高62. 4臟、殼寬20. 2mm、活體重34. 8g。通過選種，單個個體催產、單配授精建立Fl代家系、Fl代幼蟲培育、Fl代稚貝養成、培育F2代新品系，測定DHA含量得到富含DHA的華貴櫛孔扇貝新品系，其操作步驟為(I)選種2008年4月，挑選年齡為I齡，健康且性腺發育飽滿，貝殼、閉殼肌和外套膜的顏色均為橙色的雌、雄種貝各24個，所有種貝來自于同一個養殖群體。(2)單個個體催產將(I)中雌、雄種貝陰干10分鐘后，用微量注射器向每枚種貝的卵巢或精巢內注射O. 06mM的5-羥色胺溶液O. 3ml，再立即將雌、雄種貝單個地放入盛有砂濾海水的不同容器中，10分鐘后產卵、排精，分別收集卵子和精子。(3)單配授精建立Fl代家系用單個個體少量的精子與單個個體全部的卵子進行單配授精，受精卵放在60L的塑料桶中孵化。孵化的水溫為26°C，適宜鹽度為30。受精后18 24h，D形幼蟲孵出，收集幼蟲后分別放入220L的培育桶中進行幼蟲培育，共建立起9個Fl代家系。從Fl代家系中隨機取15個雌性個體和雄性個體，活體解剖取其閉殼肌和外套膜，真空冷凍干燥并研磨粉碎，然后按Folch等(1957)方法提取閉殼肌和外套膜中的總脂肪；再按Morrison等(1964)的方法對脂肪進行甲酯化，然后用氣相色譜測定閉殼肌和外套膜中的DHA含量。其中，閉殼肌的DHA含量為23. 05%±0. 36%，外套膜的DHA含量為22. 45%±0. 23%。(4) Fl代幼蟲培育、Fl代稚貝養成將(3)中收集的幼蟲分別放入培育桶中進行培育，幼蟲培育的初始密度為3個/ml，水溫為26°C，鹽度為30，每天全換水一次，連續充氣；幼蟲館料第I周為球等鞭金藻(Isochrysis galbana), I周后為球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和青島大扁藻(Platymonas subcordiformis. (wille)Hazen)(體積比為 I I)；日投餌量隨幼蟲的生長而逐漸增加，第I天總投餌量為3500個藻類細胞/ml/天，5天后逐漸增加到每天總投餌量為55000個藻類細胞/ml/天，投餌次數第I天為2次/天，5天后逐漸增加到6次/天；每天取樣鏡檢幼蟲的攝食和生長情況，每兩天對幼蟲培養密度進行定量，并通過調節培養水體以使每個培育桶中的幼蟲密度基本一致。幼蟲培育期間不加抗生素，而是適時地添加8ppm大蒜浸出液用來預防水體中病原微生物的繁殖。當30%的幼蟲出現眼點時，投放處理好的棕繩采苗器，投放量按每根棕繩附著2500粒苗。當水體中的浮游幼蟲全部附著變態后，繼續在室內培養一周，然后將附有稚貝的棕繩放入60目的聚乙烯網中，做好標記后，在天氣晴朗的下午出池并掛到海上進行稚貝養成。共培育Fl代稚貝55.8萬粒。稚貝放到海上養殖后，進入Fl代稚貝養成階段。定期檢查稚貝的生長和存活情況，并及時分苗、更換養殖籠。隨著稚貝的生長，養殖密度有初始的350個/層逐漸減少到100個/層，最后的養殖密度為35個/層；網目也由初始的60目逐漸更換為20目、由孔徑
I.3cm的養殖籠更換為3cm的養殖籠。到2009年4月，共生產I齡Fl代成貝44. 6萬枚。
(5)培育F2代新品系對Fl代家系進行顏色純度檢查，包括貝殼顏色、閉殼肌顏色和外套膜顏色。在扇貝生長到3. 5cm時，檢查所有Fl代家系中貝殼顏色、橙色個體平均達94% ;在扇貝生長到5. 5cm時，檢查閉殼肌的顏色和外套膜的顏色，閉殼肌是橙色的個體平均達90%，外套膜是橙色的個體平均達100%。2009年4月，從貝殼、閉殼肌、外套膜的色澤純度均達95%以上的Fl代家系中篩選雌、雄種貝各25枚，殼長57. 6mm、殼高60. 6mm、殼寬20. 4臟、活體重33. 6g。按步驟(2廣
(4)通過家系內單配交配和家系內隨機交配共建立起8個F2家系和I個F2群體。到2010年4月，共生產出F2代橙色成貝176萬枚。(6) DHA含量檢測測定的組織包括閉殼肌、外套膜兩部分。從F2代新品系中各取15個雌性個體和雄性個體，活體解剖取其閉殼肌和外套膜，真空冷凍干燥并研磨粉碎，然后按Folch等(1957)方法提取閉殼肌和外套膜中的總脂肪；再按Morrison等(1964)的方法對脂肪進行甲酯化，然后用氣相色譜測定閉殼肌和外套膜中的DHA含量。同時，從養殖群體中也各取15個褐殼色的雌性個體和雄性個體作為對照，活體解剖取其閉殼肌和外套膜，按上述程序測定閉殼肌和外套膜中的DHA含量。F2代新品系閉殼肌和外套膜的DHA含量分別為23. 82%±0. 77%和22. 98%±0. 59%，對照組閉殼肌和外套膜的DHA含量分別為
21.36%土 I. 07%和18. 88%±0. 71%。F2代新品系閉殼肌和外套膜組織中的DHA含量分別被提高了 11. 52% 和 21. 72%。以上實施例說明，通過2代連續選育不僅能夠使新品系的感官色澤(質量性狀)得到純化，而且通過測定連續選育世代的DHA含量，發現DHA含量(數量性狀)也能夠穩定遺傳、并且能夠通過選育得到提高；通過選種、單個個體催產和單配授精等技術能夠快速地培育出富含DHA的華貴櫛孔扇貝新品系。本發明的培育方法培育出的富含DHA的華貴櫛孔扇貝F2代新品系能夠穩定遺傳，可用其來直接繁育富含DHA的華貴櫛孔扇貝。雖然，上文中已經用一般性說明具體實施方式
及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的修改或改進，如凡通過感官色澤(質量性狀)與DHA含量(數量性狀)培育貝類新品系的方法，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種富含DHA的華貴櫛孔扇貝新品系的培育方法，該培育方法包括選種、培育Fl代家系和培育F2代新品系，其特征在于，選種步驟為選擇年齡為1-2齡、健康且性腺發育飽滿，貝殼、閉殼肌和外套膜的顏色均為橙色的雌、雄種貝； 培育F2代新品系的步驟為從Fl代家系中篩選貝殼、閉殼肌、外套膜的色澤純度均達95%以上的橙色家系作為種貝，建立F2代家系和群體，培育出性狀穩定、富含DHA的橙色F2代新品系。
2.根據權利要求I所述的培育方法，其特征在于，培育Fl代家系的步驟包括單個個體催產、單配授精建立Fl代家系、Fl代幼蟲培育 、Fl代稚貝養成。
3.根據權利要求2所述的培育方法，其特征在于，該培育方法包括下列步驟 (1)選種選擇年齡為1-2齡、健康且性腺發育飽滿，貝殼、閉殼肌和外套膜的顏色均為橙色的雌、雄種貝； (2)單個個體催產將(I)中雌、雄種貝陰干后，向所述雌、雄種貝的卵巢和精巢內注射5_羥色胺溶液，使雌、雄種貝產卵、排精，分別收集卵子和精子； (3)單配授精建立Fl代家系用單個個體少量的精子與單個個體全部的卵子進行單配授精，孵化受精卵至D形幼蟲，收集幼蟲，建立Fl代家系； (4)Fl代幼蟲培育、Fl代稚貝養成； (5)培育F2代新品系對？1代家系進行顏色純度檢查，從Fl代家系中篩選貝殼、閉殼肌、外套膜的色澤純度均達95%以上的橙色家系作為種貝，按步驟(2) (4)通過家系內單配交配和隨機交配建立F2代家系和群體，培育出性狀穩定、富含DHA的橙色F2代新品系。
4.根據權利要求3所述的培育方法，其特征在于，步驟(2)中5-羥色胺溶液的濃度為0.02-lmM，注射量為0. 1-0. 5ml/枚種貝。
5.根據權利要求3所述的培育方法，其特征在于，步驟(3)中孵化的水溫為23-28°C，鹽度為28-33。
6.根據權利要求3所述的培育方法，其特征在于，在步驟(4)中，Fl代幼蟲培育的初始密度為2-3個/ml，水溫為23-28°C，鹽度為28-33，幼蟲餌料第I周為球等鞭金藻，I周后為球等鞭金藻和青島大扁藻(體積比為1:1);日投餌量隨幼蟲的生長而逐漸增加，第I天總投餌量為3000-4000個藻類細胞/ml/天，5天后逐漸增加到每天總投餌量50000-60000個藻類細胞/ml/天，投餌次數第I天為2次/天，5天后逐漸增加到6次/天；當20% -30%的幼蟲出現眼點時，投放處理好的棕繩采苗器，投放量按每根棕繩附著2000-3000粒苗； Fl代稚貝養成時養殖密度由初始的300-400個/層逐漸減少到100個/層，最后的養殖密度為30-40個/層；網目也由初始的60目逐漸更換為20目，由孔徑I. 3cm的養殖籠更換為3cm的養殖籠。
7.根據權利要求4所述的培育方法，其特征在于，步驟(2)中5-羥色胺溶液的濃度為0.06mM,注射量為0. 3ml/枚種貝。
8.根據權利要求5所述的培育方法，其特征在于，步驟(3)中孵化的水溫為26°C，鹽度為30。
9.根據權利要求6所述的培育方法，其特征在于，在步驟(4)中，幼蟲培育的初始密度為3個/ml，水溫為26°C，鹽度為30，日投餌量第I天總投餌量為3500個藻類細胞/ml/天，5天后逐漸增加到每天總投餌量55000個藻類細胞/ml/天，當30%的幼蟲出現眼點時，投放處理好的棕繩采苗器，投放量按每根棕繩附著2500粒苗；養殖密度由初始的350個/層逐漸減少到100個/層，最后的養殖密度為35個/層。
10.權利要求I至9中任一項所述的育種方法在其他貝類新品種培育中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種富含DHA的華貴櫛孔扇貝新品系的培育方法及其應用。該培育方法包括選種、培育F1代家系和培育F2代新品系，經過2代定向選育，培育出富含DHA的華貴櫛孔扇貝新品系。本發明還提供了所述育種方法在其他貝類新品種培育中的應用。本發明從感官色澤、營養角度培育養殖貝類新品系，培育的華貴櫛孔扇貝新品系不僅色澤美觀，貝殼、閉殼肌和外套膜均為橙色，而且體內組織富含DHA，具有顯著的經濟價值、保健價值和藥用價值，市場前景廣闊。
文檔編號A01K61/00GK102960276SQ20121047268
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月20日 優先權日2012年11月20日
發明者鄭懷平, 劉合露, 張濤, 張博 申請人:汕頭大學