專利名稱：通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法
通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法技術領域
本發明屬于農業領域，特別涉及矮牽牛通過花藥培養獲得再生植株的方法。
技術背景
矮牽牛(Petunia hybrida Vilm)，又名碧科茄、靈芝牡丹，屬茄科矮牽牛屬的多年生草本植物，因其色彩豐富艷麗、品種繁多、花色多變、花期長、適應性強、粗放型管理，是當前我國優良的重要花壇綠化草花，亦可以作盆栽花卉。矮牽牛較為耐熱是我國夏秋季節常用的綠化草花。由于矮牽牛具有明顯的雜種優勢，觀賞性強，目前市面上銷售的矮牽牛種子多為Fl代，并且主要從國外進口。利用雜交優勢進行雜交育種的關鍵是獲得優良性狀的純系父母本(自交系)。為了獲得自交系，按常規的自交方法，需要耗費大量的田間土地、時間和勞力，一般需要5-6年的時間，而且手續十分繁瑣，最終的純度也不夠理想。而采用花藥培養獲得單倍體再加倍的方法，只需1年時間就可以獲得和多代自交效果相同的純系，可以極大地縮短雜交育種年限，提高育種效率(王成社，西安聯合大學學報(自然科學自版)， 2000,3(4) :7-10)。目前，有關矮牽牛花藥培養的研究在國外有一定的研究基礎，但在國內僅有3篇相關的論文報道，并且再生率相當低。此外，筆者按照其所述方法并沒有得到經花藥培養的矮牽牛再生植株。發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法， 通過本發明可對矮牽牛進行花藥培養產生單倍體植株，再經常規的秋水仙素加倍或經自然加倍能夠產生純合自交系，可為矮牽牛通過雜交獲得Fl代種子提供優良的親本材料。
為了解決上述技術問題，本發明提供一種通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法，依次包括以下步驟
A)、低溫預處理和消毒選取矮牽?；ɡ?，并于3 7°C中進行低溫預處理2 4 天；低溫預處理后進行消毒處理；
B)、將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝去花萼和花瓣，取出花藥，將花藥去凈花絲后接種在誘導愈傷組織培養基上；培養溫度為25士 1°C，培養條件為暗培養；每13 17天更換一次新鮮的誘導愈傷組織培養基，待愈傷組織形成后將愈傷組織轉接到新鮮的誘導愈傷組織培養基上進行繼代培養；繼代培養至少2次；
C)、將步驟B)繼代培養所得的愈傷組織轉接到分化培養基上進行不定芽的分化培養；培養室溫度25士 1°C，光照培養，光照強度為180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照時間為 13 1 ( 一般可選擇在5 00-19 00進行光照)；當所得的不定芽達到3 5cm時，停止分化培養；
上述分化培養一般需要4 6周，此時會形成較多的芽叢；
D、再生苗的生根培養
將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉接到生根培養基上進行生根培養，直至小苗上長出至少3條且長度> 2cm的不定根(一般需要20天左右)；得可出瓶種植的種苗，該可出瓶種植的種苗為再生植株；培養條件25士 1°C，需光培養，光照強度為200 300mol m_2 · s—1 ；
上述步驟Α) D)均在無菌環境中進行。
作為本發明的通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法的改進
誘導愈傷組織培養基為=Nitsch基本培養基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. 5 2. 0mg/L6-BA+0. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 為 5·8 ；
上述誘導愈傷組織培養基的制備方法為在每L Nitsch基本培養基上添加7g的瓊脂、20g 的麥芽糖、0. 5 2. Omg 的 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤，6-Benzylaminopurine)、0. 2mg 的 2，4-DQ，4- 二氯苯氧乙酸，2，4-dichlorophenoxyacetic acid)和 0. 5mg 的 ΝΑΑ(α -萘乙酸，1-naphthlcetic acid)；然后用濃度為lmol/L的NaOH溶液或lmol/L的HCl溶液調節PH值為5.8。
分化培養基為=Nitsch基本培養基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. 1 0. 5mg/ LIBA+1. 0 2. Omg/L 6-BA+ 水解酪蛋白 0. 5g/L, pH 為 5. 8 ；或者為Nitsch 基本培養基 +7g/L 瓊脂 +20g/L 麥芽糖 +0. 1 0. 5mg/L IBA+1. 0 2. Omg/L TDZ(噻苯隆， thidiazuron) + 水解酪蛋白 0. 5g/L, pH 為 5. 8 ；
上述該分化培養基的制備方法為在每L Nitsch基本培養基上添加7g的瓊脂、 20g 的麥芽糖、0. 1 0. 5mg 的 IBA (吲哚丁酸，3-indolebutyric acid)、1. 0 2. Omg 的 6-BA 和0. 5g水解酪蛋白，然后用濃度為lmol/L的NaOH溶液或lmol/L的HCl溶液調節pH值為 5. 8 ；或者為在每L Nitsch基本培養基上添加7g的瓊脂、20g的麥芽糖、0. 1 0. 5mg的 IBA、1. 0 2. Omg的TDZ和0. 5g水解酪蛋白，然后用濃度為lmol/L的NaOH溶液或lmol/L 的HCl溶液調節pH值為5. 8 ；
生根培養基為=Nitsch基本培養基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值為 5.8 ；
上述生根培養基的制備方法為在每L Nitsch基本培養基上添加7g瓊脂、30g蔗糖、0. 2mg的NAA，然后用濃度為lmol/L的NaOH溶液或lmol/L的HCl溶液調節pH值為5. 8。
作為本發明的通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法的進一步改進步驟A) 中低溫預處理和消毒為依次進行以下步驟
1)、在晴天的上午，選取縱徑長度在0. 8cm 1. 3cm的矮牽牛的花蕾，
2)、將上述花蕾裝入塑料袋中，放入3 7°C冰箱中低溫預處理2 4天；
3)、將上述低溫預處理后的花蕾先放在自來水下沖洗，再用蒸餾水沖洗2 4次后用吸水紙吸干水分；然后放在超凈工作臺上，用體積濃度為70 80%的酒精滅菌0. 5 1. 5min ；接著用無菌蒸餾水沖洗2 4次后用質量濃度為0. 05 0. 15 %的HgCl2溶液進行消毒8 12min，消毒完后用無菌蒸餾水沖洗3 5次。
通過本發明方法獲得的矮牽牛再生植株，連同步驟D)所用的培養容器(例如培養瓶)以及培養容器內原裝有的生根培養基一起從培養室內取出后放入溫室內進行煉苗， 此時先不打開培養容器的蓋子，2 3天后打開蓋子(即敞開瓶口)，并加入少量水(加水的量一般控制在生根培養基上有一層水即可)煉苗2 3天后進行移栽，溫室內的環境為 25士2°C，自然光照。
在本發明中，所用到的培養容器、培養基(為配制完成后的誘導愈傷組織培養基、 分化培養基和生根培養基)、蒸餾水以及花蕾消毒滅菌用裝置要在使用前進行滅菌，滅菌條件在1. 1個大氣壓、121°c條件下滅菌20分鐘。
本發明對矮牽牛的花藥進行離體培養，花藥內小孢子發育為單倍體植株，單倍體植株經染色體加倍，只需一個世代就可獲得遺傳上穩定的純系，與常規自交方法獲得遺傳穩定純系需6-7代時間相比，采用花藥培養獲得單倍體而獲得純系是有效加速育種材料的純化與育種進程的一條途徑，可以極大地縮短雜交育種年限，提高育種效率。
本發明中經花藥培養獲得再生植株實為矮牽牛單倍體和雙倍體(或多倍體)的混合植株。諸多研究表明植物花藥培養的后代是不同倍植株的混合體(花藥培養成的單倍體植株多經自然加倍成二倍體或多倍體)，我們在研究中發現獲得的再生植株有一些生長正常，形態表現為莖桿較粗、葉片較大(圖1A)，而有一些植株生長徒長，形態表現為莖桿很細、葉片較小(圖1B)。對兩種類型的植株進行根尖細胞染色體鏡檢分析表明A植株的染色體數為7條，而B植株為2n = 2X = 14條染色體。同時通過流式細胞儀分別對花藥培養原植株和花藥培養獲得再生植株的細胞DNA含量分析也表明矮牽牛花藥培養獲得的再生植株為單倍體和雙倍體(或多倍體)的混合體。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。
圖1是本發明所獲得的矮牽牛不同倍性的植株。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步的描述。
實施例1、一種通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法，依次進行以下步驟
Α)低溫預處理和消毒，依次進行以下步驟
1)、所選用的矮牽牛材料為梅林系列紅色，于12月份播種育苗，次年4月下旬開始，在晴天的上午，選取縱徑長度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾(此時期的花蕾多處于單核靠邊期)，
2)、將上述花蕾裝入塑料袋中，放入5°C冰箱中低溫預處理2天；
3)、將上述低溫預處理后的花蕾先放在自來水下沖洗5min，再用蒸餾水沖洗3次后用吸水紙吸干水分；然后放在超凈工作臺上，用體積濃度為75%的酒精滅菌Imin ；接著用無菌蒸餾水沖洗3次后用質量濃度為0. 1 %的HgCl2溶液進行消毒lOmin，消毒完后用無菌蒸餾水沖洗4次。
B)、在超凈工作臺上，將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝去花萼和花瓣，取出花藥，將花藥去凈花絲后接種在誘導愈傷組織培養基上培養；培養室溫度為25士 1°C，培養條件為暗培養；每15天更換一次新鮮的誘導愈傷組織培養基，待愈傷組織(即初代愈傷組織)形成后，及時將愈傷組織轉接到新鮮的誘導愈傷組織培養基上進行繼代培養；繼代培養2次， 繼代培養條件同上，此時可形成比較多的淡綠色、質地較硬的愈傷組織。
所用的誘導愈傷組織培養基為=Nitsch基本培養基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖 +0. 5mg/L 6-BA+O. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 為 5.8。
上述初代愈傷組織的誘導培養一般需20 30天，繼代培養每次需要30天左右。
C)、將步驟B)繼代培養所得的愈傷組織轉接到分化培養基上進行不定芽的分化；培養室溫度25士 1°C，光照培養，光照強度為180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照時間為 14h (5:00-19:00，其余時間為暗培養)；當所得的不定芽達到3 5cm時，停止分化培養；
上述分化培養的時間一般需要4 6周；
上述分化培養基為=Nitsch基本培養基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. lmg/L IBA+1. Omg/L TDZ+ 水解酪蛋白 0. 5g/L，pH 值為 5. 8。
D)、再生苗的生根培養
將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉接到生根培養基上進行生根培養，直至小苗上長出至少3條且長度彡2cm的不定根(需要20天左右)；得可出瓶種植的種苗，該可出瓶種植的種苗即為再生植株；培養條件25士小時需光培養，光照強度為200 250mol m_2 · s—1 ；
生根培養基為=Nitsch基本培養基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值為 5. 8。
上述步驟A) D)均在無菌環境中進行。
該例愈傷組織誘導率可達40 %，愈傷組織分化率可達45 %。
注誘導率=(形成愈傷組織的花藥數/接種的花藥總數)X 100%。
分化率=(分化出芽的愈傷組織數/接種的愈傷組織總數)X 100%。
將上述實施例1所得的再生植株(即可出瓶種植的種苗)連同培養瓶(包括培養瓶內的生根培養基)從培養室內取出放在溫室內進行煉苗，此時不打開瓶蓋，2-3天后敞開瓶口，并加入少量水(加水的量一般控制在生根培養基上有一層水即可)煉苗2-3天后進行移栽，溫室內的環境為25士2°C，自然光照。
在溫室內對矮牽牛再生苗進行移栽，移栽時洗去根部的培養基，將苗移栽到營養缽中(土質為營養土和珍珠巖重量比例為8 1)。待小苗長到5cm以上高度(一般需要 20 30天)時，帶基質移栽至6 X IOcm的塑料花盆中，并放于單體棚中，單體棚的環境為 自然光照，溫度25-30°C。移栽后要適當遮蔭并定時澆水，成活率可達70%以上。注成活率指的是培養瓶中的小苗移到花盆中，在田間種植最后的成活率。
實施例2、一種通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法，依次進行以下步驟
A)、低溫預處理和消毒，依次進行以下步驟
1)、所選用的矮牽牛材料為梅林系列藍色，于12月份播種育苗，次年4月下旬開始，在晴天的上午，選取縱徑長度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾(此時期的花蕾多處于單核靠邊期)，
2)、將上述花蕾裝入塑料袋中，放入5°C冰箱中低溫預處理3天；
3)、將上述低溫預處理后的花蕾先放在自來水下沖洗5min，再用蒸餾水沖洗3次后用吸水紙吸干水分；然后放在超凈工作臺上，用體積濃度為75%的酒精滅菌Imin ；接著用無菌蒸餾水沖洗3次后用質量濃度為0. 1 %的HgCl2溶液進行消毒lOmin，消毒完后用無菌蒸餾水沖洗4次。
B)、在超凈工作臺上，將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝去花萼和花瓣，取出花藥，將花藥去凈花絲后接種在誘導愈傷組織培養基上培養；培養室溫度為25士 1°C，培養條件為暗培養；每15天更換一次新鮮的誘導愈傷組織培養基，待愈傷組織(即初代愈傷組織)形成后，及時將愈傷組織轉接到新鮮的誘導愈傷組織培養基上進行繼代培養；繼代培養2次， 繼代培養條件同上，此時可形成比較多的淡綠色、質地較硬的愈傷組織。
所用的誘導愈傷組織培養基為=Nitsch基本培養基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖 +1. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 為 5.8。
上述初代愈傷組織的誘導培養一般需20 30天，繼代培養每次需要30天左右。
C)、將步驟B)繼代培養所得的愈傷組織轉接到分化培養基上進行不定芽的分化；培養室溫度25士 1°C，光照培養，光照強度為180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照時間為 14h (5:00-19:00，其余時間為暗培養)；當所得的不定芽達到3 5cm時，停止分化培養；
上述分化培養的時間一般需要4 6周；
上述分化培養基為=Nitsch基本培養基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0.5mg/L IBA+1. Omg/L 6-BA+ 水解酪蛋白 0. 5g/L，pH 值為 5. 8。
D)、再生苗的生根培養
將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉接到生根培養基上進行生根培養，直至小苗上長出至少3條且長度彡2cm的不定根(需要20天左右)；得可出瓶種植的種苗，該可出瓶種植的種苗即為再生植株；培養條件25士小時需光培養，光照強度為220 MOmol m_2 · s—1 ；
生根培養基為=Nitsch基本培養基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值為 5. 8。
上述步驟A) D)均在無菌環境中進行。
該例愈傷組織誘導率可達35 %，愈傷組織分化率可達30 %。
將上述實施例2所得的再生植株(即可出瓶種植的種苗)連同培養瓶(包括培養瓶內的生根培養基)從培養室內取出放在溫室內進行煉苗，此時不打開瓶蓋，2-3天后敞開瓶口，并加入少量水(加水的量一般控制在生根培養基上有一層水即可)煉苗2-3天后進行移栽，溫室內的環境為25士2°C，自然光照。
在溫室內對矮牽牛再生苗進行移栽，移栽時洗去根部的培養基，將苗移栽到營養缽中(土質為營養土和珍珠巖重量比例為8 1)。待小苗長到5cm以上高度(一般需要 20 30天)時，帶基質移栽至6 X IOcm的塑料花盆中，并放于單體棚中，單體棚的環境為 自然光照，溫度25-30°C。移栽后要適當遮蔭并定時澆水，成活率可達70%以上。
實施例3、將實施例1步驟C中的分化培養基改成=Nitsch基本培養基+7g/L瓊脂 +20g/L麥芽糖+0. lmg/L IBA+1. Omg/L 6-BA+水解酪蛋白 0. 5g/L，pH值為 5. 8。即將 1. Omg/ LTDZ改成了 1. Omg/L 6-BA。其余同實施例1。
所得結果為
該例愈傷組織誘導率可達40%，愈傷組織分化率可達33%。成活率可達70%以上。
對比例1、將實施例1中的選取縱徑長度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾改成選取徑長度在 1. 4cm-1. 6cm的花蕾；其余同實施例1。
所得結果為不能獲得花藥愈傷組織。
對比例2、將實施例1中的選取縱徑長度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾改成選取徑長度在0. 5cm-0. 7cm的花蕾；其余同實施例1。
所得結果為不能獲得花藥愈傷組織。
對比例3、將實施例1步驟A)中的放入5°C冰箱中進行低溫預處理2天改成放入 8°C冰箱中進行低溫預處理2天；其余同實施例1。
所得結果為
該例愈傷組織誘導率可達35%，愈傷組織分化率可達40%。
對比例4、將實施例1步驟A中的放入5°C冰箱中進行低溫預處理2天改成放入 2°C冰箱中進行低溫預處理2天；其余同實施例1。
所得結果為
該例愈傷組織誘導率可達18 %，愈傷組織分化率可達30 %。
對比例5、將實施例1步驟C)分化培養基中的麥芽糖改成蔗糖(濃度不變)；其余同實施例1。
所得結果為
該例愈傷組織誘導率可達40 %，愈傷組織分化率可達15 %。
對比例6、將實施例1步驟B)的誘導愈傷培養基中的6-BA改成IBA (濃度不變)； 其余同實施例1。
所得結果為不能獲得花藥愈傷組織。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法，其特征是依次包括以下步驟A)、低溫預處理和消毒選取矮牽?；ɡ?，并于3 7°C中進行低溫預處理2 4天；低溫預處理后進行消毒處理；B)、將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝去花萼和花瓣，取出花藥，將花藥去凈花絲后接種在誘導愈傷組織培養基上；培養溫度為25士 1°C，培養條件為暗培養；每13 17天更換一次新鮮的誘導愈傷組織培養基，待愈傷組織形成后將愈傷組織轉接到新鮮的誘導愈傷組織培養基上進行繼代培養；繼代培養至少2次；C)、將步驟B)繼代培養所得的愈傷組織轉接到分化培養基上進行不定芽的分化；培養室溫度25士 1°C，光照培養，光照強度為180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照時間為13 15h ； 當所得的不定芽達到3 5cm時，停止分化培養；D)、再生苗的生根培養將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉接到生根培養基上進行生根培養，直至小苗上長出至少3條且長度> 2cm的不定根；得可出瓶種植的種苗，所述可出瓶種植的種苗為再生植株；培養條件25 士 1°C，需光培養，光照強度為200 300mol πΓ2 · s—1 ；上述步驟Α) D)均在無菌環境中進行。
2.根據權利要求1所述的通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法，其特征是所述誘導愈傷組織培養基為=Nitsch基本培養基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. 5 2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 為 5·8 ；所述分化培養基為=Nitsch基本培養基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. 1 0. 5mg/ LIBA+1. 0 2. Omg/L 6-BA+水解酪蛋白0. 5g/L，pH為5. 8 ；或者為=Nitsch基本培養基 +7g/L 瓊脂 +20g/L 麥芽糖 +0. 1 0. 5mg/L IBA+1. 0 2. Omg/L TDZ+ 水解酪蛋白 0. 5g/L， PH 為 5. 8 ；所述生根培養基為=Nitsch基本培養基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值為 5. 8。
3.根據權利要求2所述的通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法，其特征是所述步驟A)中低溫預處理和消毒為依次進行以下步驟1)、在晴天的上午，選取縱徑長度在0.8cm 1. 3cm的花蕾；2)、將上述花蕾裝入塑料袋中，放入3 7°C冰箱中低溫預處理2 4天；3)、將上述低溫預處理后的花蕾先放在自來水下沖洗，再用蒸餾水沖洗2 4次后用吸水紙吸干水分；然后放在超凈工作臺上，用體積濃度為70 80%的酒精滅菌0. 5 1. 5min ；接著用無菌蒸餾水沖洗2 4次后用質量濃度為0. 05 0. 15 %的HgCl2溶液進行消毒8 12min，消毒完后用無菌蒸餾水沖洗3 5次。
全文摘要
本發明公開了一種通過花藥培養獲得矮牽牛再生植株的方法，依次包括以下步驟A)、矮牽?；ɡ俚蜏仡A處理和消毒；B)、將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝去花萼和花瓣，取出花藥，將花藥去凈花絲后接種在誘導愈傷組織培養基上；C)、將步驟B)繼代培養所得的愈傷組織轉接到分化培養基上進行不定芽的分化；當所得的不定芽達到3～5cm時，停止分化培養；D)、將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉接到生根培養基上進行生根培養，直至小苗上長出至少3條且長度≥2cm的不定根；得可出瓶種植的種苗；上述步驟A)～D)均在無菌環境中進行。
文檔編號A01H4/00GK102499091SQ201110351730
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月9日 優先權日2011年11月9日
發明者傅巧娟, 劉輝, 沈國正, 沈蓮佳, 陳一 申請人:杭州市農業科學研究院