專利名稱：Fbxl15蛋白抑制劑以及它們的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及FBXL15蛋白抑制劑以及它們的應用。
背景技術：
蛋白質是構成生命體內細胞和組織的基本物質，幾乎所有的蛋白質都處在不斷合成與降解的動態平衡之中。與蛋白質的合成相比，蛋白質的降解同樣重要，機體內短壽命的、錯誤折疊的以及機體自身不需要的蛋白都需要通過降解途徑來清除。其中泛素-蛋白酶體系統⑴biquitin-Proteasome System,UPS)就是真核生物體內普遍存在的具有高度選擇性的蛋白質降解系統，主要由蛋白質泛素化和蛋白酶體降解兩個過程組成。該系統的生物學功能非常廣泛，參與調控細胞內幾乎各個方面的生命活動，其異常與炎癥、癌癥及神經退行性疾病等密切相關。泛素化修飾通過由泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，El)、泛素結合 Sl (ubiquitin conjugating enzyme, E2)禾口泛素連接 Sl (ubi qui tin-protein ligase, E3) 參與介導的酶促級聯反應完成，最后經蛋白酶體降解。其中E3決定底物識別的特異性，是蛋白質泛素化領域的研究熱點。E3可以分為兩大類含有RING(really interesting new gene)鋅指結構和 HECT (homologous to E6AP C-terminus)結構域的 E3(圖 1)。RING類E3中的大多數是基于Cullins蛋白的多亞基復合體，其中基于Cullinl所形成的SCF(Skpl-Cullinl-F-box)復合體是研究最多、最深入的RING類E3復合體。它以支架蛋白Cullinl為中心，C端結合RING鋅指蛋白Rocl，N端結合接頭蛋白Skp 1，Skpl又進一步募集不同的F-box蛋白，F-box蛋白擔當底物識別亞基的角色，這樣SCF復合體就利用不同的F-box蛋白形成不同復合體，從而結合不同的底物，在細胞周期調控、細胞生長及腫瘤發生等多種生物學過程中發揮著重要作用。F-box蛋白是一個大的蛋白家族，其家族成員數量在不同的物種中差別很大，酵母中約有20種，果蠅中有27種，而在人中則有69個成員。人中的F-box蛋白家族根據其C端所含結構域的不同，可以分為三類含有WD40結構域的FBXW亞家族，含有LRR區的FBXL亞家族，以及含有其它結構域的統稱為FBM)亞家族，它們分別通過WD40、LRR及其它結構域與底物蛋白發生相互作用，介導SCF復合體對底物的識別及泛素化修飾。

發明內容
本發明的目的是提供FBXL15蛋白抑制劑以及它們的應用。本發明提供了一種核酸(FBXL15蛋白抑制劑)，為如下(1)至(6)中的任意一種(1)序列表的序列3所示的單鏈核酸；(2)序列表的序列4所示的單鏈核酸；(3)序列表的序列5所示的單鏈核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；
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(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸。本發明還保護FBXL15蛋白的抑制劑在制備骨質疏松動物模型中的應用；所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。本發明還保護一種用于制備骨質疏松動物模型的產品，它的活性成分為所述 FBXL15蛋白的抑制劑。本發明還保護所述FBXL15蛋白的抑制劑在降低所述FBXL15蛋白的編碼基因的表達量中的應用。以上任一所述FBXL15蛋白的抑制劑均可為所述核酸中的任意一種。以上任一所述骨質疏松動物模型的骨小梁密度(BMD)、骨小梁相對骨量(BV/TV)， 骨小梁數量(Tb. N)和骨小梁厚度(Tb. Th)中的至少一種低于所述骨質疏松動物模型的出發動物。以上任一所述動物具體可為大鼠，如SD大鼠。所述FBXL15蛋白的編碼基因可為如下(1)或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA 分子；(3)與⑴限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。本發明還保護所述FBXL15蛋白或所述FBXL15蛋白的編碼基因在參與大鼠體內骨穩態平衡中的應用。大鼠實驗證實，在骨組織中導入所述FBXL15蛋白抑制劑后，可以敲低FBXL15蛋白的編碼基因的表達量，大鼠絕大多數骨指標明顯下降，呈現明顯的骨質疏松表型。


圖1為E3泛素連接酶的組成類型；根據結構組成及泛素轉移方式的不同，E3可分為單體RING類E3，HECT類E3和多亞基RING類E3。圖2為FBXL15蛋白的結構域組成示意圖。圖3為小鼠FBXL15基因的組織表達譜。圖4為各個實驗組經過相應處理后，細胞內FBXL15基因mRNA的相對水平。圖5為大鼠脛骨骨小梁MicroCT參數分析；*表示P < 0. 05 ；BMD的單位為“mg/
ccm，，，BV/TV的單位為“ % ”，Tb. Th的單位為“mm”，Tb. N的單位為“ 1/mm”，Tb. sp的單位為 “_”。圖6為大鼠脛骨骨小梁MicroCT三維重建圖像。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。SD大鼠(健康6月齡雌性Sprague-Dawley大鼠)購自軍事醫學科學院實驗動物中心。UMR106細胞(大鼠成骨樣細胞系)購自美國標準菌種保藏中心(ATCC)，目錄號為 CRL-1661。實施例1、FBXL15蛋白的基本特征描述FBXL15蛋白由F-box結構域和6個亮氨酸富含區(LRR)所組成(結構示意圖見圖 2)。LRR是一大類介導蛋白相互作用的結構域，根據長度及序列特征可以分為6類，FBXL15 蛋白及Skp2蛋白等F-box蛋白屬于其中的CC(cysteine-containing)亞類。FBXL15蛋白在進化上較為保守，在果蠅、瘧蚊等無脊椎動物及魚類、鳥類等脊椎動物以及哺乳動物中都存在FBXL15蛋白的同源基因，其中哺乳動物中FBXL15蛋白高度保守，人與其它哺乳動物的同源性高達95%以上，與魚類、鳥類的同源性在60%左右，與無脊椎動物的進化距離較遠， 只有30%左右。從FBXL15蛋白與其它FBXL亞類的蛋白的進化樹關系分析，FBXL15蛋白分支獨立于大多數FBXL亞類蛋白，提示FBXL15蛋白的功能可能比較保守。在獲得FBXL15抗體后，對FBXL15蛋白的組織和細胞表達譜進行了分析。組織器官來自小鼠，分別為心、肝、脾、肺、腎、腦、骨、肌肉。結果顯示，抗體可以識別鼠源FBXL15蛋白，FBXL15蛋白的組織表達譜比較廣泛，在心、腦組織中呈高表達，在肝、脾、腎、骨、肌肉中表達中等，在肺中表達很弱(在各器官中的表達譜見圖3)。實施例2、SiRNA的設計和合成大鼠FBXL15蛋白如序列表的序列1所示，其編碼基因如序列表的序列2所示。設計如下三條靶向大鼠中FBXL15蛋白的siRNA 1#(序列表的序列；3) :5，-CACCCUUU⑶CAACCUACATT-3，；2#(序列表的序列 4) :5，-CACCCUGGAAUUUCAAAUATT-3，；3#(序列表的序列幻5，-GGCCAAAGCUAGUAAAGCUTT-3，。設計如下陰性對照siRNA :5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3，。以上各條siRNA由上海吉瑪公司負責合成。實施例3、siRNA的應用一、siRNA的敲低效率借助Lipofectamine 2000轉染試劑分別將實施例2合成的l#siRNA(si_l組)、 2#siRNA (si-2 組)、3#siRNA (si_3 組)、陰性對照 siRNA (NC 組)轉染 M 孔板中的 UMR106 細胞(按Lipofectamine 2000轉染試劑的說明書操作；對孔板細胞生長匯合度為70%時轉染細胞，2 μ 1 20 μ M siRNA與1 μ 1轉染試劑混合，siRNA和細胞個數比例約為80nM siRNA 8X104個細胞)；同時設置僅轉染不含有siRNA的轉染試劑的平行處理，作為空白對照(VC 組)。轉染48小時后，收取細胞，提取總RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，通過實時定量PCR檢測siRNA對FBXL15基因的敲低效率(借助GAPDH基因調整各組細胞至濃度)。
檢測GAPDH基因的引物對如下 5’ -CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’ ；5，-CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3，。
檢測FBXL15基因的引物對如下(靶序列約109bp)5，-GCTCAGGTGGGTCCACAGA-3，；5，-CGTCCAACAGCCATTCG-3，。對于各組處理，將FBXL15基因與GAPDH基因的表達量的比值作為FBXL15基因的標準化表達量。以NC組細胞內FBXL15基因的標準化表達量(FBXL15mRNA的標準化表達量)為 100%，計算其它幾組細胞內FBXL15mRNA的相對水平(相對表達量)，見圖4。敲低效率= 1-相對表達量。結果顯示，3條siRNA的敲低效率均超過了 90%，l#siRNA的敲低效率為 96.4%, 2#siRNA的敲低效率為92. 3%，3#siRNA的敲低效率為93. 5%，l#siRNA敲低效率最尚。二、FBXL15參與體內骨穩態的調控目前已知Smurfl最重要的生理功能是參與調控骨平衡，Smurfl-/"小鼠呈現年齡依賴的骨量增加，成骨細胞活性增強。那么FBXL15對Smurfl的調控是否會影響骨形成呢？特異靶向骨組織的遞送系統(BTDQ中的脂質體的制備方法具體方法如下將脂質體 DOTAP (Avanti America,目錄號 890890)，脂質體 DOPE (Avanti America, 850725)，膽固醇(Chol)， DSPE_mPEG2000(Avanti America,880128) ^P DSPE-mPEG2000-MAL(Avanti America,880126)按照摩爾比42 15 38 3 2的比例共同溶解在氯仿中，然后使之揮發干縮至薄膜上，用IOmM PBS(pH 7.4)使之水合，50°C水浴預孵育形成多室脂質體小泡 (MLV)；用Lipoi^ast擠壓器(Lipofast，Avestin，多倫多，加拿大)使MLV依次透過兩層直徑0. 2 μ m和0. 1 μ m的聚碳酸酯膜(分別重復5次)，形成大的單室脂質體小泡(LUV) ；LUV 與N末端為乙酰半胱氨酸殘基的(DSS)6 (ChinaPeptides CO.，LTD, China)室溫孵育2h(N 末端為乙酰半胱氨酸殘基的(DSS)與DSPE-PEG2000-MAL的摩爾比為3 1)，然后用瓊脂糖 CL-4B柱子通過篩析色譜法去掉未結合的(DSQ6，得到脂質體懸液；將脂質體懸液每0. 5ml 分裝成一管，與等體積的含有甘露醇的去離子水混合(甘露醇與脂質體的摩爾比為5 1)， 凍干機(Labconco, Freezezone，美國)處理48小時。尾靜脈注射前，將15 μ mol上述方法得到的脂質體與0. 5ml含有375 μ g siRNA的 DEPC水再水合，室溫孵育20min，然后通過0. 22 μ m的濾器過濾，然后尾靜脈注射SD大鼠。 siRNA利用特異靶向骨組織的遞送系統(BTDQ傳送到大鼠的骨組織。將30只6月齡大雌性SD大鼠隨機分為5組，每組6只；利用特異靶向骨組織的遞送系統(BTDQ將siRNA傳送到大鼠的骨組織，各組大鼠每次的注射體積相同，分組處理情況如下(各組同時處理)第一組(si-L15組)借助BTDS將實施例2合成的l#siRNA尾靜脈注射大鼠，每次劑量為細g siRNA/kg大鼠；注射6次，每次間隔1周；第六次注射完成后取右側脛骨進行 MicroCT掃描分析；第二組(NC組)借助BTDS將實施例2合成的陰性對照siRNA尾靜脈注射大鼠， 每次劑量為細g siRNA/kg大鼠；注射6次，每次間隔1周；第六次注射完成后取右側脛骨進行MicroCT掃描分析；第三組(VC組)用BTDS尾靜脈注射大鼠；注射6次，每次間隔1周；第六次注射完成后取右側脛骨進行MicroCT掃描分析；第四組(AM組)大鼠不進行任何處理；與其它組同時取右側脛骨進行MicroCT掃描分析；第五組(BL組)大鼠不進行任何處理，實驗起始時(即比其它組少飼養5周)；取右側脛骨進行MicroCT掃描分析。MicroCT掃描分析采用21 μ m分辨率，選擇8個橫斷面來進行，并對核心直徑約 2. 2mm 的骨小梁進行三維重建(viva CT40, SCANCO MEDICAL, Sigma =1.2，Supports = 2and Threshold = 190)，并定量分析以下參數骨小梁密度(BMD)、骨小梁相對骨量(BV/TV)，骨小梁數量(Tb. N)，骨小梁厚度(Tb. Th)和骨小梁間距(Tb.sp)。各個參數的檢測結果見表 1和圖5。大鼠脛骨骨小梁三維重建圖像見圖6。表1各個參數的分析結果
權利要求
1.核酸，為如下(1)至(6)中的任意一種(1)序列表的序列3所示的單鏈核酸；(2)序列表的序列4所示的單鏈核酸；(3)序列表的序列5所示的單鏈核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸。
2.FBXL15蛋白的抑制劑在制備骨質疏松動物模型中的應用； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。
3.用于制備骨質疏松動物模型的產品，它的活性成分為FBXL15蛋白的抑制劑； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。
4.FBXL15蛋白的抑制劑在降低FBXL15蛋白的編碼基因的表達量中的應用； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。
5.如權利要求2所述的應用，或，如權利要求3所述的產品，或，如權利要求4所述的應用，其特征在于所述FBXL15蛋白的抑制劑為權利要求1所述的核酸。
6.如權利要求2所述的應用，或，如權利要求3所述的產品，其特征在于所述骨質疏松動物模型的骨小梁密度、骨小梁相對骨量，骨小梁數量和骨小梁厚度中的至少一種低于所述骨質疏松動物模型的出發動物。
7.如權利要求2所述的應用，或，如權利要求3所述的產品，其特征在于所述動物為大鼠。
8.如權利要求2至7中任一所述的應用或產品，其特征在于所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或⑵或⑶所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
9.FBXL15蛋白或其編碼基因在參與大鼠體內骨穩態平衡中的應用； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下(1)或 ⑵或⑶所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
全文摘要
本發明公開了FBXL15蛋白抑制劑以及它們的應用。本發明提供的FBXL15蛋白的抑制劑為如下(1)至(6)中的任意一種(1)序列表的序列3所示的單鏈核酸；(2)序列表的序列4所示的單鏈核酸；(3)序列表的序列5所示的單鏈核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸。所述FBXL15蛋白的抑制劑可用于制備骨質疏松動物模型。大鼠實驗證實，在骨組織中導入FBXL15蛋白抑制劑后，可以敲低FBXL15蛋白的編碼基因的表達量，大鼠絕大多數骨指標明顯下降，呈現明顯的骨質疏松表型。
文檔編號A01K67/027GK102382829SQ20111035148
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年5月3日
發明者何珊, 崔宇, 張令強, 梁超, 賀福初, 邢桂春 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所