專利名稱：玉米病害誘導型啟動子的克隆及功能分析的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種源自玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)， 并能夠在玉米中高水平表達的誘導型啟動子序列。
背景技術：
玉米(Zea mays L.)是重要的糧食和飼料作物，在我國各種逆境脅迫每年都引起玉米減產20% -30%。干早、高鹽、低溫等逆境脅迫是影響植物生長發育的重要限制因子。 據統計，目前全世界很多耕地受到鹽害威脅，干早、半干早地區，而我國有近億人口受到土地過度鹽堿化和荒摸化的威脅。因此，提高植物抗早能力已經成為現代植物育種工作急需解決的關鍵問題之一。為了抵抗外界逆境條件脅迫，植物通過調節自身體內基因的表達、生理生化變化來適應逆境，增強耐性。近年來，隨著現代分子生物學技術的飛速發展，許多受逆境脅迫的基因被相繼鑒定與克隆。在轉基因植物中過表達能夠提高植株的抗逆性，而啟動子是基因表達調控的重要因素之一。同時，誘導型啟動子能夠調控外源基因在特定的生長時期，逆境條件下表達， 降低了植物能量的不必要浪費。因此，逆境脅迫誘導型啟動子在植物抵御逆境脅迫反應中的作用越來越受到人們的重視。高等植物基因的表達調控已成為分子生物學研究領域的熱點，啟動子是基因表達調控的重要元件。深入研究啟動子的結構和功能，建立可用于植物轉基因表達的時、空、量三維調控系統，可為功能基因組學研究及通過基因工程技術精確地調節植物代謝提供全新的思路。選擇適宜的啟動子來驅動目的基因在轉基因植物中表達，已成為植物基因工程研究的熱點問題之一。針對不同的目的基因，人們選用不同的啟動子，從而使靶基因在特定組織或條件下選擇性表達，以利于轉基因植物的正常生長發育(趙恢武等，2000 ；劉強等， 2000)。對植物在干旱逆境下大量表達的耐旱基因啟動子研究表明，不同耐旱基因的啟動子往往含有相同的順式作用元件，并受相同的反式作用因子的調控。這為我們提供了另外一條研究植物耐旱機制的途徑。國內外科學家利用一些耐旱相關的特異性啟動子(如RD^A)、特異性蛋白(如脫水素)、耐旱相關的特異性酶(如TPQ基因進行植物遺傳轉化并獲得了成功，得到一些耐旱品質明顯提高的轉基因植株。清華大學的劉強等000 將來自擬南芥的干旱誘導型基因RD29A的兩個轉錄調控因子轉入擬南芥后發現擬南芥的干旱耐受性能有很大提高。高世慶O006)通過基因槍介導轉化小麥幼胚愈傷組織，經過分子生物學檢測及在PEG脅迫下的 ⑶S組織化學染色證實了 RD29A啟動子在小麥愈傷組織中能夠誘導⑶S基因的表達。也有科研工作者直接利用干旱誘導型啟動子啟動某些耐旱有關的蛋白表達進行植物耐旱機理的研究。如利用特異性的啟動子啟動與耐旱有關的基因(如脫水素基因等)或特異性的滲透調節物合成酶基因在煙草、擬南芥等模式植物體內表達獲得耐旱植株；通常情況下在雙子葉植物中常用的組成型啟動子CaM35S啟動海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)在煙草和擬南芥中均獲得耐旱植株，而用誘導型啟動子RD^啟動TSP (海藻糖-6-磷酸合酶)在煙草中表達，獲得了較為明顯的耐旱煙草植株。單子葉植物的WDiquitin-promoter有兩部分組成eX0n和intron，其中intron具有增強子的功能。目的基因在其啟動下能夠大量穩定的在單子葉植物體內表達。浙江大學郝中娜等000 對水稻0sWRKY19及0sWRKY89基因的啟動子進行功能研究，表明這兩個基因的啟動子是組織特異性表達的誘導型啟動子。Brown 等Q010)首次發現冬小麥bltlOl基因啟動子內存在高度保守的TCA-Iike元件與誘導目的基因在低溫脅迫下高效表達密切相關。Takumi等分離了小麥低溫應答基因家族基因WCorl5上游的啟動子序列證實該啟動子受低溫和光誘導。利用逆境誘導型啟動子驅動抗逆基因的高效表達，從而改良作物的抗逆性成為目前研究的熱點。然而，目前能應用于轉基因研究的誘導型啟動子仍然很少。因此，對于新的抗逆境相關啟動子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉錄因子的研究仍然是今后啟動子研究的重點。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種病害誘導型啟動子序列，該啟動子序列能夠誘導目標基因高水平表達，而且該啟動子來源于玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)。本發明的第二個目的是提供一種用于植物轉化的病害誘導型啟動子載體，該載體指導在植物中高水平表達目標基因ZmRxol的病害誘導型啟動子序列和5'非翻譯區。本發明的第三個目的是提供一種所述載體轉化的轉基因植物。該轉基因植物能反映啟動子誘導活性的高低。為實現上述目的，本發明克隆了玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的病害誘導型啟動子區，并構建了用于植物轉化的載體，所述載體包含帶有ZmRxol基因的5'非翻譯區的上述啟動子。隨后利用所述載體在玉米中誘導表達，并觀察到該啟動子與病害誘導性相關的高水平活性。本發明提供一種獲得的玉米病害誘導型啟動子序列，包含相對于SEQ ID NO 1的轉錄起始位點的-Ibp至_155bp區(見序列表)的DNA核苷酸序列，病原菌侵染可以在植物中誘導本發明所述的啟動子的高水平活性。獲得的玉米病害誘導型啟動子序列源自玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)。一種克隆得到的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的5'非翻譯區，包含相對于SEQ ID NO 1的轉錄起始位點的+Ibp至+1421bp區(見序列表)的DNA核苷酸序列，本發明所述的非翻譯區能通過增強導入植物中的目標外源基因的翻譯效力，而誘導目標基因的高水平表達。為實現另一個目的，本發明提供一種用于玉米轉化的病害誘導型的植物表達載體，所述植物表達載體包含玉米病害誘導型啟動子序列和玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的 5'非翻譯區。上述用于玉米轉化的病害誘導型載體是指能夠在轉基因植物中持久表達外源基因的二元載體。所述二元載體可以是任何包含T-DNA (轉移DNA)的RB (右邊界序列)和 LB (左邊界序列)，能夠在根癌農桿菌(Agroba terium tumefaciens) Ti質粒存在下轉化植物的二元載體。該載體可以是經常用于相關領域的二元載體，例如PCAMBIA1301載體、 PBI121 載體。
一種用于植物表達載體轉化的轉基因植物，包含玉米病害誘導型啟動子序列和玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的5'非翻譯區。本發明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，適于擴增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。關于本發明所述的用于植物的誘導型載體(PCAMBIA1301)，所述的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動子和5'非翻譯區在植物表達載體中位于外源基因的前面。本發明提供通過插入本發明所述的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動子和5'非翻譯區含有GUS 報告基因的載體中而構建的PCAMBIA1301。但是，所述GUS報告基因是外源基因，并預期可以用任意其它有用的外源基因來代替。本發明提供一種應用病害誘導型二元載體的轉基因植物，以及一種應用本發明所述進行瞬時表達的玉米成熟胚。植物能通過使用例如根癌農桿菌(An，G. 1987，Plant Physiology)或粒子轟擊方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物病害誘導型啟動子二元載體進行轉化。在本發明中，例如煙草可以用葉盤轉化法進行轉化。本發明提供來自玉米的抗病蛋白基因(ZmRXOl)的病害誘導型啟動子和5'非翻譯區，根據本發明的啟動子和5'非翻譯區使得能夠在植物中進行病害誘導型表達。本發明的有益效果在于可用于啟動抵抗逆境基因的高效表達，對于玉米抗逆品種轉基因技術的研究，培育綜合抗性強、優質、高產的轉基因新品系具有積極意義。


圖1為玉米(B73)基因組電泳圖
圖2 為 ZmRXOl-pro PCR 電泳圖
圖3為ZmRXOΙ-pro連T載質粒提取電泳圖
圖4為ZmRXOΙ-pro連T載酶切鑒定電泳圖
圖5為pCAMBIA 1301: Zm RXOlPro酶切鑒定電泳圖
圖6為植物表達載體構建示意圖
圖7為pCAMBIA 1301: Zm RXOPro轉農桿菌PCR鑒定電泳圖
圖8為pCAMBIA 1301: Zm RXOlPro轉農桿菌質粒提取電泳圖
圖9為3 啟動子的⑶S檢測照片
圖10為ZmRXOl啟動子(未用20% PEG處理)的⑶S檢測照片
圖11為ZmRXOl啟動子(用20%的PEG處理Mh)的⑶S檢測照片
具體實施例方式下面結合附圖具體說明實施例以下的實施例將能夠使本領域技術人員更清楚地理解如何實施本發明。盡管已經結合本發明的優選的具體實施方式
來對本發明進行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發明的范圍。實施例1 玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的逆境誘導啟動子的克隆玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動子(啟動子序列包含相對于SEQ ID NO=I的轉錄起始位點的-Ibp至_155bp區的DNA核苷酸序列)，在玉米抗病蛋白基因ZmRXOl的5'非翻譯區序列中得到鑒定。玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)登錄在NCBI GenBank(登錄號AY935244. 1)，序列表顯示本發明上述基因的植物逆境誘導型啟動子和5'非翻譯區的DNA序列。在圖1中，蛋白合成的起始密碼子ATG帶有下劃線，而且轉錄起始位點的堿基A用+1示出。并用啟動子分析網站分析了啟動子的核心元件。啟動子分析網站http://WWW. dna. affrc. go. jp/PLACE/ signalscan. html。以玉米基因組DNA (圖1)為模板，擴增得到目的片段，經1 %瓊脂糖凝膠電泳分析， 擴增出長度為1576bp的特異條帶(圖2)。電泳后回收目的片段，與pMD 18-T載體連接得到重組質粒pMD 18-T: ZmRXOPro，提取質粒并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖幻，酶切驗證 (圖4)，并測序。更具體地說，通過PCR擴增克隆的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動子和1421bp 的5'非翻譯區(見序列表)，上述PCR所用引物詳細顯示在表1中。對于PCR擴增，反應程序94°C 5min ；94°C 45S，56°C 40S，72°C 2min，30 個循環；72°C IOmin ；表1:引物
上游引物5' CGGAATTCACAATATCGGTTCCGCTGC 3'SEQ ID NO 2下游引物5' CCCATGGCTTCTTATTCGATCAGAC 3'SEQ ID NO 3實施例2 植物逆境誘導型啟動子載體的構建將在實施例1中所克隆的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動子和1421bp的5' 非翻譯區ZmRXOl 見序列表)插入到載體中，從而構建植物逆境誘導型載體。具體地說，將植物表達載體pCAMBIA 1301及重組質粒pMD 18_T: ZmRXOlPro用 EcoRI和NcoI分別進行酶切，然后將它們插入載體pCAMBIA1301的EcoRI和NcoI酶切位點。該載體被稱作pCAMBIA 1301::ZmRX01ftx)，用于驅動⑶S基因的表達，經酶切鑒定(圖 5)獲得了啟動子片段，與預期結果相同。在圖6中，以編碼ρ-葡糖酸醛酶的基因GUS為報告基因，選擇標記為潮霉素抗性基因。此外:35s-pro代表HPTII的啟動子，而:35s_ter代表HPTII的終止子，ZmCIPK16Pro 代表⑶S的啟動子，而Nos-ter代表⑶S的終止子。實施例3 鑒定玉米逆境誘導型啟動子的活性通過熱激轉化法，將在實施例2中構建的載體pCAMBIA 1301: ZmRXOlPro轉移到根癌農桿菌EHA105中，提取質粒(圖8)并進行PCR鑒定(圖7)。為鑒定啟動子的逆境誘導活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法將玉米的成熟胚做了逆境之一的干旱處理再檢測GUS的活性。具體地說，將玉米種子浸泡催芽，然后將種子縱切，成兩半，用20 % PEG 誘導培養24h，將玉米種子在⑶S檢測液中于37 °C過夜，⑶S檢測液lmg/ml X-gluc (5-溴-4-氯-3- 口引哚-β -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸鈉緩沖溶液(PH = 7. 0)，IOmM EDTA，0. 5mM鐵氰化鉀、0. 5mM亞鐵氰化鉀、0. iTritonX-IOO, 20%甲醇。如圖所示(圖9、 圖10、圖11)，經過PEG誘導的愈傷組織顯示出高水平的⑶S活性，而未經誘導的愈傷組織顯示出低水平的⑶S活性。
SEQ ID NO. 1的序列(帶功能元件標記)⑴序列特征(A)長度-lbp至-155bp ；+Ibp至+1421bp ； (B)類型核苷酸；(C)鏈性單鏈。(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述:SEQ ID NO. 1-155 A EamIATCGG TTCCGCTGCG TCGGTTCGGA TGTGTGGATC GGTTGGGTCG GACCATGTGC
Q\AT4x)x-95 ACCTGGGCGC CTGGGT j(;cAT TC|TC f|^TT GAATGCACCC AGG Itataata T/vrAATA|ACA
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+1406
GATCGAATAA GAAGGGATG
權利要求
1.一種獲得的玉米病害誘導型啟動子序列，其特征在于所述啟動子序列包含相對于 SEQID NO 1的轉錄起始位點的-Ibp至_155bp區的DNA核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的獲得的玉米病害誘導型啟動子序列，其特征在于所述啟動子序列源自玉米抗病蛋白基因ZmRXOl。
3.根據權利要求2所述的獲得的玉米病害誘導型啟動子序列，其特征在于一種克隆得到的玉米抗病蛋白基因ZmRXOl的5'非翻譯區包含相對于SEQ ID NO=I的轉錄起始位點的+Ibp至+142Ibp區的DNA核苷酸序列。
4.一種用于玉米轉化的病害誘導型的表達載體，其特征在于所述植物表達載體包含權利要求1所述的玉米病害誘導型啟動子序列和權利要求3所述的玉米抗病蛋白基因ZmRXOl 的5'非翻譯區。
5.一種用于植物表達載體轉化的轉基因植物，其特征在于所述轉基因植物包含權利要求1所述的玉米病害誘導型啟動子序列和權利要求3所述的玉米抗病蛋白基因ZmRXOl的 5'非翻譯區。
6.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，其特征在于所述引物適于擴增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米病害誘導型啟動子的克隆及功能分析屬于生物工程技術領域，本發明提供一種獲得的玉米病害誘導型啟動子序列，包含相對于SEQ ID NO1的轉錄起始位點的-1bp至-155bp區的DNA核苷酸序列；同時提供用于玉米轉化的病害誘導型的表達載體，包含玉米病害誘導型啟動子序列和玉米抗病蛋白基因ZmRX01的5′非翻譯區；SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的PCR引物適于擴增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段；本發明可用于啟動抵抗逆境基因的高效表達，對于玉米抗逆品種轉基因技術的研究，培育綜合抗性強、優質、高產的轉基因新品系具有積極意義。
文檔編號A01H5/00GK102417908SQ20111036366
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者劉金亮, 張世宏, 李桂華, 潘洪玉, 賈承國, 陳婷婷, 陳景源, 陶冶 申請人:吉林大學