專利名稱：提高小麥耐鹽性的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高小麥耐鹽性的方法，屬于小麥育種和分子生物學領域。
背景技術：
環境脅迫嚴重影響作物的產量，而鹽脅迫的影響尤其嚴重。據統計，耕地面積的 20%和灌溉耕地的50%受到不同程度的鹽漬化影響，而且受影響的面積逐年擴大。鹽漬化在干旱和半干地區的影響更大，每年約有10萬公頃的耕地因鹽漬化而被荒廢。如果鹽漬化土壤可以被利用，估計可以增加約130萬公頃的可用耕地。因此開展植物的抗鹽性研究和開展植物抗鹽育種具有重要的意義。小麥是我國和世界最重要的糧食作物之一，是人類生存的主要食物來源。普通小麥是不適宜在鹽堿地種植的，通過轉基因的方法培育耐鹽的小麥品種種植于鹽堿地，可極大的提高我國和世界的小麥產量，為世界的糧食安全做出貢獻。 同時通過在鹽堿地種植耐鹽堿的小麥可極大地改善鹽堿地的生態環境。通過傳統育種的方法來提高作物的耐鹽性能夠獲得的效果是非常有限的，這主要由于植物的耐鹽性在分子及生理水平上都是由復雜的機制來調控的。在分子水平上，植物的耐鹽性通常具有多基因性狀的特點，而在生理水平上，鹽土植物和具低耐鹽性的植物也顯示出很大范圍的適應性，這給傳統育種工作帶來很大的困難。基因工程技術通過改變一個或幾個基因的活性來提高植物的耐鹽性，它是在基因水平上提高植物耐鹽性，更具有精確性和穩定性，提高了育種的高效性，極大地加快了育種速度，對于我們了解耐鹽植物復雜的性狀以及耐鹽機制也是非常必要的。水是維系植物生長發育的重要成分，占活細胞鮮重的80%以上。以往普遍認為水分是通過簡單的擴散方式自由進入植物細胞，但水通道蛋白(aquaporin)的發現證明水分是通過這種專一性的通道進入細胞內的。Maurel和Chrispeels等人認為水通道蛋白的發現是一個革命性的發現。高等植物水通道蛋白在干旱、鹽、低溫和營養虧缺等脅迫條件下的水分吸收過程中的作用尤其重要。有學者認為，植物中一些水通道基因的表達是保守的，而另外一些則響應環境因子(如干旱和高鹽)的變化而進行表達(Johansson et al.，2000)。水通道對脅迫的響應一般可分成兩個方面一是脅迫啟動現存水通道基因的表達，提高表達速度， 使水通道的數量迅速增加；二是脅迫誘導產生新的水通道基因，從而表達新的水通道 (Yamaguchi^Shinozaki et al.，1992 ；Fray et al.，1994)。Yamada 等(1995)發現，冰草在面臨高鹽脅迫時水通道MipA、MipB和MipC的表達發生了變化，從而使植物在脅迫開始后的 2天內，細胞膨壓恢復到脅迫前的水平。雖然迄今為止已從幾十種植物中發現了水通道蛋白，但鹽生植物的細胞質膜水通道蛋白基因的報道也較少，目前只從中等耐鹽的鹽生植物冰花克隆了水通道蛋白基因，與已報道的這些植物相比，鹽生植物海蓬子具有更強耐鹽性，其最適生長環境要求200mMNaCl 高鹽濃度，不僅可以在0 SOOmM鹽濃度下生長也可以進行全海水灌溉培養。發明人通過抑制消減雜交的方法，克隆獲得了一個海蓬子的水通道蛋白基因(SbPIPl)，構建了適宜于小麥基因槍轉化的單子葉植物高效表達載體pAHC25-SbPIPl，采用基因工程的方法將海蓬子的SbPIPl基因導入普通小麥，提高小麥的耐鹽性，目前未見報道。

發明內容
本發明的目的在于針對目前小麥耐鹽種質資源貧乏狀況，提供一種采用轉基因方法將可提高植物耐鹽性的鹽生植物海蓬子的水通道蛋白基因SbPIPl基因導入普通小麥品種，從而提高小麥的耐鹽性。本發明目的是這樣實現的1. 一種提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于以下步驟a)構建一個海蓬子的水通道蛋白基因釙PIPl的表達載體pAHC25_SbPIPl ；b)通過基因槍法將海蓬子的SbPIPl基因的表達載體pAHC25_SbPIPl導入受體小麥幼胚細胞；對所述的小麥幼胚細胞進行愈傷組織誘導、植株再生，獲得轉基因待選植株；C)對轉基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉基因植株；d)陽性轉基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T4代轉基因純合株系；e)對T4代轉基因純合株系后代進行耐鹽性篩選，獲得耐鹽的轉基因植株。在本發明中所述的海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl表達載體pAHC25_SbPIPl通過以下步驟獲得A、制備質粒 PUC18-PSN 設計上游引物SEQ No. 5和下游引物SEQ No. 6，以含Nos3，序列的質粒 pCAMBIA-2301序列SEQ No. 4為模板，以引物SEQ No. 5和SEQ No. 6對模板進行擴增，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產物進行純化回收，以PUC18為基礎質粒，采用限制性內切酶HindIII 和I^stI對Nos3’片段和PUC18分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為PUC18-N ；設計上游引物SEQ No. 7和下游引物SEQ No. 8，以含有釙PIPl基因編碼序列的海蓬子葉片cDNA文庫為模板，以引物SEQ No. 7和SEQ No. 8擴增所述cDNA文庫模板，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產物進行純化回收，以PUC18-N為載體，采用限制性內切酶BamHI和I^stI 對SbPIPl基因編碼序列和PUC18-N載體分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4 DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為PUC18-SN ；設計上游引物SEQ No. 9和下游引物SEQ No. 10，以含有Ubiquitin基因啟動子的玉米基因組為模板，以引物SEQ No.9和SEQ No. 10擴增所述玉米基因組模板，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產物進行純化回收，以PUC18-SN為載體，采用限制性內切酶BamHI和EcoRI對 Ubiquitin和PUC18-SN分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用 T4DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為PUC18-PSN ；B、制備 pAHC254bPIPl 表達載體采用限制性內切酶HindIII對PUC18-PSN質粒DNA進行完全酶切，切下 Ubiquitin+SbPIPl+NosS'嵌合基因片段，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對3. Okb左右的酶切片段進行回收；采用限制性內切酶HindIII對pAHC25質粒DNA進行完全酶切，切除原有表達盒，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對5. 5kb左右的酶切片段進行回收；用T4DNA連接酶對兩個回收片段進行連接，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl的表達載體，該質粒命名為 pAHC25-SbPIPl。在本發明中對轉基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉基因植株是指設計上游引物SEQ No. 11和下游引物SEQ No. 12，通過SEQ No. 11和SEQ No. 12對待選植株進行 PCR篩選，電泳檢測，能擴增出大小為581bp的擴增片段的植株確定為陽性轉基因植株。在本發明中對T4代轉基因純合株系后代進行耐鹽性篩選是指在小麥的發芽期對被測后代采用在鹽脅迫的條件下進行發芽試驗，計算相對鹽害指數，根據鹽害指數判斷轉基因植株的耐鹽性；鹽害指數=[(對照發芽率-處理發芽率)/對照發芽率]X 100% ；其中，對照發芽率是未導入pAHC25_SbPIPl的親本在清水下的發芽率；處理發芽率是指T4代轉基因純合株系后代在含1. 0% NaCl溶液脅迫條件下的發芽率；耐鹽性的分級標準由強至弱依次為1、2、3、4、5級，1級的鹽害指數為0-20.0%， 2級的鹽害指數為20. -40.0%，3級的鹽害指數為40. 1_60. 0 %，4級的鹽害指數為 60. 1% -80.0%，5級的鹽害指數為80. 1% -100.0%，其中1級為耐鹽的轉基因植株。本發明的優點在于與常規的種質培育方法相比，選取的目的基因來自鹽生植物， 該水通道蛋白基因對細胞水分進出的調控能力更強，對提高小麥的耐鹽性針對性更強；由轉化植株到純合的轉基因株系時間短并且對受體親本的重要農藝性狀影響小，培育的周期短、減少對重要農藝性狀選育所需的人工經驗的依賴性。


圖1海蓬子SbPIPl基因的表達載體的示意圖。圖2PUC18的示意圖。圖3pAHC25的示意圖。圖4表達載體pAHC25_SbPIPl的構建過程示意圖。圖5 ；代部分轉基因待選植株SbPIPl基因的PCR檢測的電泳圖，其中1-7泳道為轉基因待選植株；8泳道為未轉基因寧麥13親本對照；9泳道為陽性質粒對照；10泳道為DL2000 Maeker分子量標準。圖6 T4代部分轉基因植株SbPIPl基因的PCR檢測的電泳圖，其中1-7泳道為T4代轉SbPIPl基因的植株；8泳道為未轉基因寧麥13親本對照；9泳道為陽性質粒對照；10泳道為DL2000 Maeker分子量標準。
具體實施例方式本案涉及的全部引物均委托生工生物工程(上海)有限公司合成。實施例1表達載體的構建所述的海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl表達載體pAHC25_SbPIPl通過以下步驟獲得A、制備質粒 PUC18-PSN :A、構建質粒 PUC18-PCN設計上游引物SEQ No. 5 5，-GCCCTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3，(含 PstI 酶切位點)下游引物SEQ No. 65，-GCCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3‘(含 HindIII 酶切位點)以含有 Nos3，序列的 pCAMBIA-2301 (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ GenBank :AF234316) SEQ No. 4為模板，以引物引物SEQ No. 5和引物SEQ No. 6擴增模板，其中所述的Nos3，序列SEQ No. 1 為已知核酸序列(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ ；GenBank :AF485783. 1)，1 % 的瓊脂糖電泳，對PCR產物進行純化回收，以PUC18為基礎質粒(http://www, ncbi. nlm. nih. gov/ ；GenBank :A02710)(圖 2)，采用限制性內切酶 HindIII 和 PstI 對 Nos3，片段和 PUC18 分別進行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應體系含1XT4DNA連接酶緩沖液，PUC18片段0. 3pmol，Nos3，片段0. 03pmol, 350uT4DNA連接酶)，連接產物轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞(轉化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，P55-56頁，科學出版社，1992)，轉化后得大腸桿菌DH5 α細胞懸液涂布含 100mg/L氨芐青霉素的平板，對抗氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質粒，采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為PUC18-N。設計上游引物SEQ No. 75，-GCCGGATCCATGGAAGGAAAGGAGGAAGATGTA-3'(含 BamHI 酶切位點)下游引物SEQ No. 85，-GCCCTGCAGTCACTTGGATTTAAATGGGATTGC-3’ (含 PstI 酶切位點)海蓬子(Salicornia bigelovii Torr.)來自于江蘇省農業科學院農業生物技術研究所試驗場，取其成株頂端幼嫩葉片提取RNA，逆轉錄構建一個cDNA文庫，以含有SbPIPl 基因編碼序列SEQ No. 2的海蓬子葉片cDNA文庫為模板，以引物SEQ No. 7和SEQ No. 8擴增SbPIPl基因編碼序列SEQ No. 2，所述的SPIPl基因為已知核酸序列(http://www, ncbi. nlm. nih. rov/ ；GenBank :DQ451602. 1) ；1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產物進行純化回收，以 PUC18-N為載體，采用限制性內切酶BamHI和I^stI對SbPIPl基因編碼序列和PUC18-N載體分別進行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4DNA連接酶酶16°C 連接過夜(20ul反應體系含1XT4DNA連接酶緩沖液，PUC18-N片段0. 3pmol, SbPIPl片段 0. 03pmol，350uT4DNA連接酶)，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為PUC18-SN ；設計上游引物SEQ No. 95 ‘-GCCGAATTCAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGT-3，(含 EcoRI 和 HindIII 酶切位占)下游引物SEQ No. 105，-GCCGGATCC AAGTAACACCAAACAACA-3，(含 BamHI 酶切位點)Ubiquitin 基因啟動子為已知核酸序列(http //www, ncbi. nlm. nih. rov/ ； GenBank :S94464. 1)，Seq No. 3，以含有Ubiquitin基因啟動子的玉米基因組為模板，以以引物SEQ No. 9引物和引物SEQ No. 10擴增得W^iquitin全長序列的瓊脂糖電泳，對PCR產物進行純化回收，以PUC18-SN為載體，采用限制性內切酶BamHI和EcoRI對 WDiquitin和PUC18-SN分別進行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用 T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應體系含1 XT4DNA連接酶緩沖液，PUC18-SN片段 0. 3pmol, Ubiquitin片段0. 3pmol，350uT4DNA連接酶)，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為PUC18-PSN。B、制備 pAHC254bPIPl 表達載體采用限制性內切酶HindIII對PUC18-PSN質粒DNA進行完全酶切，切下 Ubiquitin+SbPIPl+NosS'嵌合基因片段，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對3. Okb左右的酶切片段進行回收；采用限制性內切酶HindIII對pAHC25質粒(圖3)DNA進行完全酶切，切除原有表達盒，采用0. 8%的瓊脂糖電泳，對5. 5kb左右的酶切片段進行回收；用T4DNA連接酶對兩個回收片段16°C連接過夜(20ul反應體系含1XT4DNA連接酶緩沖液，pAHC25片段 0. 3pmol，Ubiquitin+SbPIPl+Nos3，嵌合基因片段 0. 03pmol，!350uT4DNA 連接酶)，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，轉化后得大腸桿菌DH5 α細胞懸液涂布含100mg/L氨芐青霉素的平板，對抗氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質粒，采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為pAHC25-SbPIPl，即為海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl 的表達載體(圖1)。本實施例的整個構建過程參見圖4。實施例2表達載體的轉化采用基因槍轉基因方法將構建的表達載體導入受體小麥寧麥13的幼胚細胞，通過愈傷組織誘導、植株再生，獲得轉基因待選植株(參照周淼平等，小麥基因槍法轉化技術的改進，江蘇農業學報，1999，15(1) :62-64)；所述的受體小麥是指六倍體常規小麥，所述的幼胚是指開花后12-14天的幼胚。對上述轉基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉基因植株，陽性轉基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T4代轉基因純合株系；所述的分子檢測為PCR (聚合酶鏈式反應)分析方法，PCR分析是指根據目的基因的序列設計特異引物，提取待選轉基因植株的基因組DNA，以此為模板對目的基因進行PCR 擴增，能擴增出相應基因片段的植株為陽性轉基因植株。根據SbPIPl基因的序列設計的特異引物為正向引物SEQ No. 11 5， -ATGGAAGGAAAGGAGGAAGATGT-3，；反向引物SEQ No. 12 5， -GCAGAGAAGACGGTGTAGACGAG-3，；PCR擴增條件為:94°C 5分鐘；94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘20秒，進行35 個循環；最后72°C延伸10分鐘。擴增片段大小為581bp，PCR產物進行1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳。Ttl代部分轉基因待選植株的PCR檢測電泳圖見附圖5 ；其中1-7泳道為轉基因待選植株，其中6泳道和7泳道為轉SbPIP基因的陽性植株；8泳道為未轉基因寧麥13對照； 9為陽性質粒對照；10為DL2000 Maeker分子量標準
T4代部分轉基因植株的PCR檢測電泳圖見附圖6。其中1-7泳道為T4代轉SbPIPl 基因的植株，全部為陽性植株；8泳道為未轉基因寧麥13對照；9泳道為陽性質粒對照；10 泳道為DL2000 Maeker分子量標準。實施例3耐鹽性篩選在小麥的發芽期對被測后代(實施例2為獲得的寧麥13轉基因小麥)采用在鹽脅迫的條件下進行發芽試驗，計算相對鹽害指數，根據鹽害指數判斷轉基因植株的耐鹽性。 具體的操作是選取均勻一致的轉基因植株的種子，分別置于含1.0% NaCl溶液的培養皿中，并以蒸餾水處理作為對照，于20°C培養箱中培養7天，調查發芽率(以芽長超過種子長度的一半為發芽標準)計算相對鹽害指數，根據鹽害指數對耐鹽性評級。鹽害指數按下列公式計算鹽害指數(％)=[(對照發芽率-處理發芽率)/對照發芽率]X 100%其中，對照發芽率是未導入pAHC25_SbPIPl的親本在清水下的發芽率；處理發芽率是指T4代轉基因純合株系后代在含1. 0% NaCl溶液脅迫條件下的發芽率。本發明中的耐鹽性的分級標準是1級鹽害指數為0-20. 0%,；2 級鹽害指數為 20. 1 % -40. 0 %3 級鹽害指數為 40. 1-60. 0%,；4 級鹽害指數為 60. 1% -80.0%,；5 級鹽害指數為 80. 1% -100. 0%,；在分級標準中，1級是耐鹽性最強的，隨級數的增加，小麥的耐鹽性逐漸減弱，鹽敏感性逐漸增強。耐鹽性鑒定結果見表1，在表 1 中 SPIP1-1，SPIP1-2，SPIP1-3，SPIP1-4，SPIP1-5， SPIP1-6，SPIP1_7為導入SbPIPl基因的7個1\代純合株系。受體對照親本寧麥13的鹽害指數為43. 33%，屬于不耐鹽類型，7個導入SbPIPl基因的T4代純合株系的鹽害指數均為 0，都屬于耐鹽類型，表明由于SbPIPl基因的導入，使轉基因植株的耐鹽性得到提高。表1寧麥13轉SbPIPl基因T4代純合株系的耐鹽性鑒定結果
轉基因株系耐鹽性評級鹽害指數耐鹽性評價
權利要求
1.一種提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于以下步驟a)構建一個海蓬子的水通道蛋白基因SbPIPl的表達載體pAHC25-SbPIPl；b)通過基因槍法將海蓬子的SbPIPl基因的表達載體pAHC25-SbPIPl導入受體小麥幼胚細胞；對所述的小麥幼胚細胞進行愈傷組織誘導、植株再生，獲得轉基因待選植株；c)對轉基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉基因植株；d)陽性轉基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T4代轉基因純合株系；e)對T4代轉基因純合株系后代進行耐鹽性篩選，獲得耐鹽的轉基因植株。
2.根據權利要求1所述的提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于所述的海蓬子水通道蛋白基因^PIPl表達載體pAHC251bPIPl通過以下步驟獲得A、制備質粒PUC18-PSN設計上游引物SEQ No. 5和下游引物SEQ No. 6，以含Nos3，序列的質粒pCAMBIA-2301 序列SEQ No. 4為模板，以引物SEQ No. 5和SEQ No. 6擴增所述的模板，1 %的瓊脂糖電泳，對 PCR產物進行純化回收，以PUC18為基礎質粒，采用限制性內切酶HindIII和I^stI對Nos3’ 片段和PUC18分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為PUC18-N ；設計上游引物SEQ No. 7和下游引物SEQ No. 8，以含有SbPIPl基因編碼序列的海蓬子葉片cDNA文庫為模板，以引物SEQ No. 7和SEQ No. 8擴增所述cDNA文庫模板，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產物進行純化回收，以PUC18-N為載體，采用限制性內切酶BamHI和I^stI對 SbPIPl基因編碼序列和PUC18-N載體分別進行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4 DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為PUC18-SN ；設計上游引物SEQ No. 9和下游引物SEQ No. 10，以含有W^iquitin基因啟動子的玉米基因組為模板，以引物SEQ No. 9和SEQ No. 10擴增所述玉米基因組模板，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產物進行純化回收，以PUC18-SN為載體，采用限制性內切酶BamHI和EcoRI對 Ubiquitin和PUC18-SN分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用 T4 DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質粒命名為PUC18-PSN ；B、制備pAHC254bPIPl表達載體采用限制性內切酶HindIII對PUC18-PSN質粒DNA進行完全酶切，切下 Ubiquitin+SbPIPl+NosS'嵌合基因片段，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對3. Okb左右的酶切片段進行回收；采用限制性內切酶HindIII對pAHC25質粒DNA進行完全酶切，切除原有表達盒，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對5. 5kb左右的酶切片段進行回收；用T4DNA連接酶對兩個回收片段進行連接，轉化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl的表達載體，該質粒命名為 pAHC25-SbPIPl。
3.根據權利要求1或2所述的提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于對轉基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉基因植株是指設計上游引物SEQ No. 11和下游引物SEQ No. 12，通過SEQ No. 11和SEQ No. 12對待選植株進行PCR篩選，電泳檢測，能擴增出大小為581bp的擴增片段的植株確定為陽性轉基因植株。
4.根據權利要求3所述的提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于對T4代轉基因純合株系后代進行耐鹽性篩選是指在小麥的發芽期對被測后代采用在鹽脅迫的條件下進行發芽試驗，計算相對鹽害指數，根據鹽害指數判斷轉基因植株的耐鹽性； 鹽害指數=[(對照發芽率-處理發芽率)/對照發芽率]X 100% ； 其中，對照發芽率是未導入pAHC25-SbPIPl的親本在清水下的發芽率；處理發芽率是指T4代轉基因純合株系后代在含1. 0% NaCl溶液脅迫條件下的發芽率；耐鹽性的分級標準由強至弱依次為1、2、3、4、5級，1級的鹽害指數為0-20.0%， 2級的鹽害指數為20. -40.0%，3級的鹽害指數為40. 1_60. 0 %，4級的鹽害指數為 60. 1% -80.0%，5級的鹽害指數為80. 1% -100.0%，其中1級為耐鹽的轉基因植株。
全文摘要
本發明涉及一種提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于以下步驟構建一個海蓬子的水通道蛋白基因SbPIP1的表達載體pAHC25-SbPIP1；通過基因槍法將海蓬子的SbPIP1基因的表達載體pAHC25-SbPIP1導入受體小麥幼胚細胞；對所述的小麥幼胚細胞進行愈傷組織誘導、植株再生，獲得轉基因待選植株；對轉基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉基因植株；陽性轉基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T4代轉基因純合株系；對T4代轉基因純合株系后代進行耐鹽性篩選，獲得耐鹽的轉基因植株。其優點是與常規的種質培育方法相比，具有培育周期短、改良效果明顯、對重要農藝性狀影響小的特點。
文檔編號A01H5/00GK102417913SQ201110411230
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者余桂紅, 周淼平, 孫曉波, 張旭, 蔣蘇, 馬鴻翔 申請人:江蘇省農業科學院