一種提高植物抵抗鹽脅迫能力的方法
【專利摘要】本發明提供一種提高植物抵抗鹽脅迫能力的方法，將含有URO基因及啟動子序列的表達載體轉化植物，提高植物的抗鹽脅迫能力。URO基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；啟動子的核苷酸序列如序列表中序列2所示；用于構建含有URO基因及啟動子序列的表達載體是含有T-DNA序列的雙元載體。本發明通過改變轉錄調控因子基因的表達，使植物細胞分化狀態改變，從而實現提高植物抗鹽能力提高的目的。
【專利說明】一種提高植物抵抗鹽脅迫能力的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業作物性能改進的【技術領域】，具體涉及ー種提高植物抵抗鹽脅迫能力的方法，以提高植物耐鹽脅迫能力。
【背景技術】
[0002]隨著全球溫度升高，地球表面水分蒸發加快，海平面上升，以及長時間以來灌溉的農業生產，導致土壤中鹽份積累逐年加劇，成為導致作物減產的原因之一。另ー方面，有限的耕地面積面臨急劇增加的人口的壓カ也逐年上升，大量荒置的鹽堿地的有效利用也是農業發展的重要方向。因此，改善經濟作物的耐鹽脅迫能力，是經濟作物育種的重要方向之一。例如:將造紙植物的耐鹽性提高，使其可以在鹽分較高的地區種植，將極大的節約耕地的面積，緩解農業土地緊缺的壓カ。
[0003]常規育種方法耗時時間長，需要幾代的雜交、回交，且新性狀的出現依賴已有的品種，可控性較差。轉基因育種是國際新興的育種策略。它的優點是耗時較短，可控性較強。缺點依賴于育種對象的轉基因平臺的建立，以及可以用于遺傳改造的基因序列。目前，可用于提聞植物耐鹽脅迫能力的基因序列報道很少。
[0004]現有技術中，調控植物對鹽脅迫的耐受性主要有編碼離子通道的蛋白，以及部分影響植物激素包括細胞分裂素和赤霉素合成的基因。通常認為生長素與植物抗鹽脅迫性能沒有直接關聯，也有報道認為生長素降低植物抗鹽脅迫的性能。本發明利用擬南芥的生長素代謝調控基因UR0，通過過量表達該基因，改變植物內源生長素含量，影響植物的整體發育，提高植物對環境中鹽脅迫的耐受性。

【發明內容】

[0005]本發明提供一種提高植物抵抗鹽脅迫能力的方法，所述方法是將含有URO基因及啟動子序列的表達載體轉化植物，提高植物抵抗鹽脅迫能力；其中，所述URO基因的核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述啟動子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示；用于構建所述含有URO基因及啟動子序列基因的表達載體含有T-DNA序列的雙元載體。至目前尚未有文獻報道所述URO基因可被用于提高植物耐鹽脅迫能力的人工調控。本發明中，URO基因還可用其它組織特異性啟動子啟動表達，達到對該基因的表達時空可以進行精確調控的目的，從而更加有效的調控轉基因植物光合作用變化。
[0006]其中，所述含有URO基因及部分啟動子序列的表達載體為pMon530-UR0 ；所述pMon530-UR0的構建包括如下步驟:以擬南芥的總DNA為模板，并設計引物:上游引物URO-F:5’ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,下爾引物URO-R:5’tta atg atg acg atgacc g。經PCR循環反應得到擴增產物，得到URO的核酸片段，連接到T-Vector ;將連接產物轉化至大腸桿菌，經篩選得到陽性克隆URO-T。URO-T質粒經XhoI和EcoRI酶切后，與經XhoI和EcoR I酶切后的含有35S啟動子的雙元載體pMon530進行連接，獲得含有融合35S啟動子和URO的重組載體pMon530-UR0。[0007]其中，所述PCR循環反應的條件為:94°C 5min ;一次循環94°C 30sec，55°C 45sec，72°C 90sec，30 次循環；72°C IOmin0
[0008]其中，所述植物為草本或木本植物。所述植物為草本植物煙草。
[0009]其中，所述轉化方法為農桿菌轉化法，基因槍介導轉化法，或花粉管通道法。
[0010]本發明中，所述URO基因是指擬南芥基因At3g23140的核酸序列從翻譯起始密碼ATG到終止密碼TAA，包括終止密碼。所述啟動子是指花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子的堿基序列。
[0011]其中，所述URO基因的多核苷酸序列如序列表中的序列I所示，該序列I由525個堿基組成。所述啟動子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示，該序列由546個堿基組成。
[0012]本發明中，所述T-DNA序列是公開序列，是指農桿菌Ti (tumor inducing)或Ri (root inducing)質粒中的一段DNA序列，可以從農桿菌中轉移并穩定整合到植物核基因組中，已成為植物分子生物學中廣泛應用的遺傳轉化載體。
[0013]本發明中，所述P35S::UR0融合基因是指35S啟動子與URO基因相接形成的新的基因序列。
[0014]本發明中，所述pMon530-UR0表達載體是指帶有P35S::URO融合基因的可以轉化植物的雙元載體。
[0015]本發明中，T-Vector是指就是市場上試劑公司提供的線性3’ -T突出雙鏈DNA片段。T載體利于PCR產物的連接。
[0016]本發明中，URO-T是指含有URO序列的T-Vector。所述URO-T質粒是指含有URO序列的T-Vector質粒。
[0017]本發明中，所述含有35S啟動子的雙元載體pMon530是指ー個商業化的質粒載體名稱為pMon530，該質粒的多克隆位點前面含有ー個花椰菜花葉病毒的35S啟動子。
[0018]本發明中，所述tbu是指轉化有pMon530-UR0的轉基因煙草株系，不同株系加不同編號，如 tbu-1, tbu-2 等。
[0019]本發明中，所述啟動子可以是任何植物中使用的啟動子，包括遍在表達的啟動子和組織特異性表達的啟動子。
[0020]本發明是將含有URO基因及啟動子的表達載體轉化植物，為提高植物耐鹽脅迫能力提供一條新的途徑。
[0021]本發明方法，可以用于植物鹽脅迫能力提高的性狀。本發明的方法中，提取擬南芥的部分基因片段，通過特定啟動子與基因的組合，可以驅動調控植物生長素代謝調控基因在表達升高，使植物細胞生長發育狀態改變，提高植物抵抗鹽脅迫能力。本發明的方法既可以單獨轉化植物，也可以對啟動子區進行修飾，改變該基因的表達位置和時間，以獲得具有組織特異性的最適抗鹽效果。利用本發明的方法，可以通過對不同的經濟作物進行遺傳改造，達到在較短時間內提高植物抗鹽能力的良好效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為pMon530_UR0融合基因載體構建過程示意圖。
[0023]圖2 (a)表示野生型煙草植株。[0024]圖2 (b)表示轉P35S::UR0融合基因的轉基因煙草植株。
[0025]圖3為轉P35S::UR0融合基因的轉基因煙草的RT-PCR鑒定圖譜。
[0026]圖4為轉P35S::UR0融合基因的轉基因煙草植株與野生型煙草的葉片細胞形態比較。
[0027]圖5為轉P35S:: URO融合基因的轉基因煙草植株與野生型煙草的葉片在含鹽培養基上培養結果比較。
[0028]圖6為轉P35S::UR0融合基因的轉基因煙草植株與野生型煙草的葉片耐鹽脅迫能力比較。
【具體實施方式】
[0029]以下實施例是對本發明進一步的詳細闡述，而不是對本發明的限制。本發明并不局限于【具體實施方式】的內容，凡基于本發明在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，均屬于本發明的保護范圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。
[0030]本發明調控植物抵抗鹽脅迫的方法，具體如下:
[0031]培育抵抗鹽脅迫能力升高的轉基因煙草，以擬 南芥總DNA為模板；設計引物，上游引物 UR0-F:5，ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,下游引物 UR0-R:5，tta atg atgacg atg acc g ;進行PCR擴增，PCR反應條件為:94度5min，一個循環；94度30sec，55度45sec, 72度90sec, 30循環；72度IOmin進行PCR擴增，然后，電泳、回收、純化PCR擴增產物，得到URO基因的核酸片段。
[0032]將URO基因核酸片段連接到T-Vector (TAKARA)，并轉化至大腸桿菌，經PCR及酶切篩選獲得陽性克隆(UR0-T)。經測序，檢測結果確定陽性克隆序列正確。
[0033]分別利用XhoI和EcoRI酶進行酶切測序正確的URO-T質粒，電泳、回收、純化，與被XhoI和EcoRI酶切后的已含有35S啟動子的雙元載體pMon530連接。獲得含有融合35S啟動子和URO基因的重組載體p35S::UR0，測序鑒定正確。之后，將該質粒轉化入農桿菌中，并進行鑒定。35S::UR0融合基因載體pMon530-UR0構建過程，參考圖1所示，具體記載在實施例 2、3、4、5、6、7 中。
[0034]用葉盤法，轉化并篩選煙草，獲得穩定轉化本序列的煙草。提取轉化子的RNA，反轉錄并進行RT-PCR鑒定。參考圖2 (a)為野生型煙草，參考圖2(b)為轉化子煙草。參考圖3為轉p35S::UR0融合基因的轉基因煙草的RT-PCR鑒定圖譜。其中wt為野生型對照，其它樣品tbu-1, tbu-2, tbu-3為不同株系的轉化子。
[0035]待轉化子生長3個月后，取同樣生長時間和條件的野生型及轉化子完全成熟的葉片，進行橫切觀察，結果發現，轉化子的葉片細胞明顯增大，如圖4。同時取無菌培養轉基因煙草葉片和野生型葉片在含有一定濃度NaCl的培養基上培養，拍照記錄結果并利用image tool3.0軟件分析結果。結果如圖5所示，在沒有NaCl的培養基上，野生型和轉基因煙草的生長狀態良好，均沒有明顯的白化，如圖5中的A，B所示。在含600mM NaCl的培養上培養兩天后，野生型煙草已經有很明顯的白化現象，如圖5中的C所示，緑色部分比例平均為57.3%，如圖6所示；而轉化子tbu-5的白化比例較野生型明顯偏低，如圖5中的D所示，只有在傷ロ很嚴重處有少許白化，緑色部分比例平均為85.2%，如圖6所示。當濃度增加到SOOmM吋，差別更明顯，野生型在第一天時就已經完全白化了，如圖5中E所示，而URO轉化子tbu-5即使在培養3天后，葉片依然維持很高的葉綠素含量，如圖5中F所示。
[0036]實施例1，提取擬南芥基因組DNA
[0037]試劑:
[0038]Lysis Buffer =Tris-HCl, pH8.0 (0.2M);尿素(7M);十二烷基肌氨酸鈉(2%)；EDTA (0.05M)步驟:
[0039](I)植株的綠葉或花等組織適量，置于1.5ml的離心管中，加200 ill裂解液，用小棒研磨成漿，再用400 ii I裂解液沖洗小棒。
[0040](2 )加600 ill的酚-氯仿，劇烈震蕩20秒，使蛋白質變性。
[0041](3) 12000rpm離心5分鐘后取上清。
[0042](4)加 50 ii I 醋酸鈉，600 U I 異丙醇，混勻，12000rpm 離心 5min。
[0043](5)去上清，沉淀溶于 400 ill TE(Tris-EDTA)中。
[0044](6)再加 40iil 3mol/L NaAC(PH5.2), Iml 無水こ醇，混勻，12000rpm 離心 5min。
[0045](7)去上清，用70%こ醇洗沉淀一次，離心；去清液。
[0046](8)室溫干燥，沉淀溶于50 Ul無菌水中，即為提取得到的植物基因組DNA。
[0047]實施例2 (a), PCR方法獲得目的基因片段
[0048](I)以實施例1中提取的擬南芥DNA作為模板
[0049]URO基因的多核苷酸序列如序列表中的序列I所示。
[0050]啟動子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示。
[0051](2)引物設計
[0052]根據URO基因及其啟動子序列，以及購建克隆方便，設計ー對引物，URO-F和UR0-R，其中前者的引物上有ー個Xhol的限制性內切酶酶切位點，引物序列為:
[0053]上游引物UR0-F:5，ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,如序列 3 所示。
[0054]下游引物URO-R:5’ tta atg atg acg atg acc g 如序列 4 所示。
[0055](3) PCR擴增目的片段
[0056]PCR試劑:K0D-Plus酶購自于T0Y0B0公司
[0057]PCR反應體系:
【權利要求】
1.一種提高植物抵抗鹽脅迫能力的方法，其特征在干，所述方法是將含有URO基因及啟動子序列的表達載體轉化植物，提高植物抵抗鹽脅迫能力；其中，所述URO基因的多核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述啟動子的多核苷酸序列如序列表中序列2所示；用于構建所述含有URO基因及啟動子序列基因的表達載體是含有T-DNA的雙元載體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有URO基因及啟動子序列的表達載體為p35S::UR0 ;所述p35S::UR0的構建包括如下步驟:以擬南芥的總DNA為模板，設計引物，上游引物 URO-F:5’ ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,下游引物 UR0-R:5’ ttaatg atg acg atg acc g ;經PCR循環反應得到擴增產物,得到URO基因的核酸片段,連接到T-Vector ;將連接產物轉化至大腸桿菌，經篩選得到陽性克隆URO-T ；URO-T質粒經XhoI和EcoRI酶切后，與經XhoI和EcoR I酶切后的含有35S啟動子的雙元載體pMon530上進行連接，獲得含有融合35S啟動子和URO的重組載體pMon530-UR0。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR循環反應的條件為:94°C5min ;一次循環 94で 30sec,55°C 45sec,72°C 90sec，30 次循環；72で IOmin0
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物為草本或木本植物。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉化方法為農桿菌轉化法，基因槍介導轉化法，或花粉管通道法 。
【文檔編號】A01H5/00GK103525857SQ201210236403
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月6日 優先權日:2012年7月6日
【發明者】孫越, 劉水, 李玲 申請人:華東師范大學