專利名稱：一種提高植物對重金屬耐受性及調節重金屬定向分配的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及利用液泡膜轉運蛋白HMT1，提高重金屬耐性和調節重金屬定向分配的作用機理及其用途。
背景技術：
近年來，由于現代工業的發展，越來越多的重金屬，如鎘、砷、鉛等被排放到生物圈中。重金屬鎘等的污染不僅導致作物減產，更是對食品安全造成威脅。鎘是生物毒性最強的重金屬之一，是已知的最易在體內蓄積的IA級致癌物。食物和水中過量的鎘通過食物鏈在人體組織和器官內的積累導致多方面的危害，包括對腎臟、肝臟的損害甚至癌癥等病癥。因此重金屬鎘等污染土壤的修復是亟待解決的環境問題，由于傳統方法代價昂貴，植物修復作為一種新興的綠色環境治理技術受到了極大的重視和廣泛的應用。但是，在一些污染較為嚴重的國家，比如 中國，到上世紀末，農田重金屬鎘污染面積已達2萬公頃，每年生產的鎘含量超標農產品達14.6億千克。最近，據南京農業大學研究報道中國市場上有超過10%的稻米被鎘污染，已經對人類的健康構成了巨大的潛在威脅。因此，在進行植物修復的同時，減少鎘等有毒重金屬向可食用部位遷移可能對于具有較大范圍污染的國家是更為現實的一種選擇。利用分子育種降低農作物籽粒等可食用部位中鎘元素含量的方法具有良好而廣闊的發展前景，但是植物對重金屬鎘的吸收轉運和抗性機制的研究還存在很多問題，尤其是向籽粒等可食用部位遷移的分子機理還很不清楚。因此，本領域還需要進行深入的研究，以開發出對重金屬耐受性良好的植物；更進一步的，開發出有效降低農作物籽粒等可食用部位中有毒重金屬含量的方法和產品。

發明內容
本發明的目的在于提供一種液泡膜轉運蛋白HMTl在植物中成功過表達并能提高植物對重金屬耐受性和積累能力。本發明的目的還在于提供一種降低農作物籽粒等可食用部位中重金屬(特別是鎘)元素含量的方法。在本發明的第一方面，提供一種液泡膜轉運蛋白HMTl的用途，用于提高植物對重金屬的耐受性，調節重金屬的定向分配或提高重金屬脅迫下植物的葉綠素含量。在一個優選例中，所述的液泡膜轉運蛋白HMTl用于向植物細胞的液泡內轉運重金屬。在另一優選例中，所述的重金屬包括:鎘(Cd)，砷(As)，銅(Cu)或鋅(Zn)。在另一優選例中，所述HMTl是:(a)如GenBank登錄號CAA78419所示氨基酸序列的蛋白；或(b)將GenBank登錄號CAA78419所示氨基酸序列經過一個或多個(如1_30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)限定的蛋白功能的蛋白；(c)與GenBank登錄號CAA78419所示氨基酸序列的蛋白的序列相同性高于70%，且具有(a)限定的蛋白功能的蛋白。在本發明的另一方面，提供一種提高植物對于重金屬的耐受性、調節植物組織中重金屬積累程度或提高重金屬脅迫下植物的葉綠素含量的方法，所述方法包括:在植物中表達外源的液泡膜轉運蛋白HMTl。在一個優選例中，所述方法包括:將液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒轉入植物中，從而在植物中表達外源的液泡膜轉運蛋白HMTl。在另一優選例中，所述方法包括:(I)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒;(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(I)中的農桿菌接觸，從而使液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入了液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒的植物細胞或組織或器官；和(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植物。在本發明的另一方面，提供一種耐受重金屬或組織中重金屬積累程度不同的植物，其基因組中包括有液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒。在本發明的另一方面，提供一種調節植物組織中重金屬積累程度的方法，所述方法包括:將液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒轉入植物中，該液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒包括操作性連接的啟動子、編碼液泡膜轉運蛋白HMTl的多核苷酸；其中，所述的啟動子是植物特定組織特異性表達啟動子，從而驅動液泡膜轉運蛋白HMTl在植物特定組織中表達，促進重金屬轉運入該植物特定組織(較佳地，降低重金屬在植物其它組織中的含量)。在一個優選例中，所述的表達盒中，編碼液泡膜轉運蛋白HMTl的多核苷酸的3’端，還包括終止子。在另一優選例中，所述的植物特定組織選自(但不限于):根、莖、葉、種子，種皮。在另一優選例中，所述的植物是包括可食用組織的植物，所述的啟動子是植物的非食用組織特異性表達啟動子，從而將重金屬轉運入植物的非食用組織(較佳地，降低重金屬在植物可食用組織中的含量)。在另一優選例中，所述的非食用組織特異性表達啟動子是植物根特異性表達啟動子。所述的根特異性表達啟動子選自但不限于=Adh啟動子，NTl啟動子，ZmGLUl啟動子等。在另一優選例中，所述的啟動子是植物地上部分組織的特異性啟動子。在另一優選例中，所述的植物地上部分組織的特異性啟動子是CAB2啟動子。在另一優選例中，所述方法包括:(I)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有所述的液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒；

(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(I)中的農桿菌接觸，從而使液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入了液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒的植物細胞或組織或器官；和(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植物。在本發明的另一方面，提供一種液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒，其包括操作性連接的啟動子、編碼液泡膜轉運蛋白HMTl的多核苷酸；其中，所述的啟動子是植物特定組織特異性表達啟動子。在本發明的另一方面，提供所述的液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒的用途，用于調節植物組織中重金屬積累程度，促進重金屬轉運入該植物特定組織，降低重金屬在植物其它組織中的含量。在本發明的另一方面，提供一種組織中重金屬積累程度不同的植物，其基因組中包括有液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒，該液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒包括操作性連接的啟動子、編碼液泡膜轉運蛋白HMTl的多核苷酸；其中，所述的啟動子是植物特定組織特異性表達啟動子，該啟動子驅動液泡膜轉運蛋白HMTl在植物特定組織中表達，促進重金屬轉運入該植物特定組織(較佳地，降低重金屬在植物其它組織中的含量)。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、改造后的SpHMTl能夠互補酵母突變體Ahmtl的鎘敏感表型。A、酵母鎘抗 性平板實驗。Δ hmtl突變體酵母(LK100)中分別轉化空載體pARTl (V/LK100),含有酵母本身 5’ utr 的 SpHMTl (HMTI/LK100)和改造過的 Kozak-HMTl (KHMTI/LK100)，轉化空載體的野生型酵母(V/Sp223)作為正對照。B、鎘濃度梯度下的酵母生長曲線。圖2、RT-PCR分析SpHMTl在轉基因擬南芥中的表達情況。A、35S:SpHMTl/Col-04周轉基因擬南芥莖葉中SpHMTl的表達情況。W2-11，W3_13和W7-3分別代表將35S/SpHMTl:cmyc-pBI121轉化Col-O后獲得的三個獨立株系。轉基因擬南芥根中SpHMTl的表達情況同該圖。B、35S:SpHMTl/cadl_34周轉基因擬南芥莖葉中SpHMTl的表達情況。M10-8和M1-12分別代表將35S/SpHMTl:cmyc-pBI121轉化cadl_3后獲得的兩個獨立株系。轉基因擬南芥根中SpHMTl的表達情況同該圖。C、Adh: SpHMTI/Co1-04周轉基因擬南芥根中SpHMTl的表達情況。A5-9和A26-4分別代表Adh/SpHMTl:cmyc-pBI121轉化Col-O后獲得的兩個獨立株系。D, Adh:SpHMTI/Co1-04周轉基因擬南芥莖葉中SpHMTl的表達情況。圖3、SpHMTl在野生型擬南芥中的過表達能增強植物對重金屬的抗性。Α-D、種子表面消毒后分別在添加 50 μ M CdCl2 (A)，150 μ M KH2AsO4 (B) ,40 μ MCuSO4(C)或150μΜ ZnSO4 (D)的1/4XMS平板上垂直生長4周。E、A-D圖中植物的鮮重。其中Cd50中50表示培養基中Cd含量50 μ Μ，As 150表示培養基中As含量150 μ Μ，依次類推。F、A_D圖中植物(全株幼苗)的相應重金屬含量。數據為三次獨立實驗的平均值土標準差，每次實驗中包括> 100株植物，**P < 0.01。W2-11和W7-3分別代表將35S/SpHMTl: cmyc_pBI121轉化Col-Ο后獲得的兩個獨
立株系。圖4、BSO抑制了 SpHMTl轉基因植株對重金屬的抗性和積累。A-B、種子表面消毒后在分別添加10 μ M CdCljP 0.5mM BSO(A)或者0.5mM BSO (B)的1/4 X MS平板上垂直生長20天。C、A和B圖中植物的鮮重。D、轉基因植株各組織中鎘含量檢測。其中，S表示莖，L表示蓮座葉，R表示根。數據為三次獨立實驗的平均值土標準差，每次實驗中包括> 100株植物。W2-11和W7-3分別代表將35S/SpHMTl: cmyc_pBI121轉化Col-Ο后獲得的兩個獨立株系。圖5、SpHMTl在擬南芥PCs缺失突變體cadl_3中的過表達不能增強重金屬抗性和積累。A、種子表面消毒后在1/4 XMS平板上垂直生長7天。B、種子表面消毒后在添加5 μ M CdCl2的1/4XMS平板上垂直生長20天。

C、A和B圖中植株的鮮重。D、A和B圖中植株的鎘濃度。CK代表對照條件(普通1/2 XMS板培養)。數據為3次獨立實驗的平均值土標準差，每次實驗中包括> 100株植物。Μ10-8 和 Μ1-12 分別代表將 35S/SpHMTl: cmyc_pBI121 轉化 cadl-3 后獲得的兩個獨立株系。圖6、鎘在液泡和原生質體間的分配。A、鎘在Col-0，cadl-3及其相應的轉基因植物W2-11和M10-8葉片原生質體和液泡中的含量。植物酸性磷酸酶(ACP)活性作為鎘含量的換算標準。數據為三次獨立實驗的平均值土標準誤。B、鎘在胞質和液泡中的分配比率。數值代表液泡中鎘含量在整個原生質體中所占的比率。圖7、植物螯合肽(PCs)在液泡中的含量。植物酸性磷酸酶(ACP)活性作為PCs含量的換算標準。數據為三次獨立實驗的平均值土標準誤。PC2，PC3，PC4分別代表不同鏈長的PC分子，數字即PC分子共同結構(Y -Glu-Cys) n-Gly 中 η 的值。圖8、SpHMTl在根中的特異性表達增加植物對Cd2+的抗性。水培4周的植物分別以ΙΟμΜ CdCl2處理7天后，提取蓮座葉葉綠素含量進行比較。數據為平均值土標準差，每次實驗中包括> 8株植物。Control為正常培養條件。A5-9和A26-4分別代表Adh/SpHMTl: cmyc-pBI121轉化Col-O后獲得的兩個獨立株系。圖9、SpHMTl在根中的特異性表達能降低植物地上部分和種子中的重金屬含量。Α-C、水培 4 周的植物分別以 10 μ M CdCl2 ⑷，100 μ M KH2AsO4 ⑶或 20 μ MCuSO4(C)處理3天后，取材測量根(R)和蓮座葉(L)中相應的重金屬含量。D-F、水培2周的植物分別以5 μ M CdCl2⑶，KH2AsO4 (E)或CuSO4 (F)處理直到種子成熟后，取材測量種子中相應的重金屬含量。數據為三次獨立實驗的平均值土標準差，每次實驗中包括> 8株植物。A5-9和A26-4分別代表Adh/SpHMTl: cmyc-pBI121轉化Col-O后獲得的兩個獨立株系；W2-11代表將35S/SpHMTl:cmyc-pBI121轉化Col-O后獲得的株系。圖10、SpHMTl在地上部分的特異性表達能改變重金屬鎘的分布。A、水培4周的植物分別以ΙΟμΜ CdCl2處理3天，取材測量根(R)和蓮座葉(L)中相應的重金屬含量。B、水培2周的植物分別以5 μ M CdCl2處理直到種子成熟后，取材測量種子中相應
的重金屬含量。數據為三次獨立實驗的平均值土標準差，每次實驗中包括> 8株植物。C20-2 和 C23-1 分別代表 CAB2/SpHMTl: cmyc-pBI121 轉化 Col-Ο 后獲得的兩個獨立株系；W2-11代表將35S/SpHMTl:cmyc-pBI121轉化Col-O后獲得的株系。
具體實施例方式本發明人經過廣泛的研究，找到一種對于提高植物對重金屬的耐受性以及調節植物組織中重金屬積累 程度有用的基因一一液泡膜轉運蛋白HMTl基因(HMTl)。本發明的基因可應用于植物品種的改良，包括:提高植物對于重金屬的抵抗力；調節植物不同的組織、器官中重金屬的含量；減少植物可食用部位中重金屬的含量；提高重金屬脅迫下植物組織中的葉綠素含量。本發明為運用轉基因等分子育種技術培育植物新品種提供了非常有價值的基因資源。本發明中，對于適用于本發明的植物(或作物)沒有特別的限制，只要其適合進行基因的轉化操作，如各種農作物、花卉植物、或林業植物等。所述的植物比如可以是(不限于):雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。更具體地，所述的植物包括(但不限于):小麥、大麥、黑麥、水稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、樓桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罌粟、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿卜、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒、鱷梨、桂皮、樟腦、煙葉、堅果、咖啡、茄子、甘蔗、茶葉、胡椒、葡萄樹、蠔麻草、香蕉、天然橡膠樹和觀賞植物等。作為一種優選方式，所述的“植物”包括但不限于:十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于:十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥屬植物如擬南芥，禾本科的水稻、小麥、玉米等，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的液泡膜轉運蛋白分離的SpHMTl蛋白”或“分離的SpHMTl多肽”是指SpHMTl蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化SpHMTl蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
如本文所用，植物的“可食用組織(器官)”指來自于植物體的，可以直接作為食品或可以被加工為食品的植物組織(器官)。一些農作物中，“可食用組織(器官)”例如:禾本科作物如水稻、小麥的種子(含或不含種皮)，薯類植物如甘薯的塊根，十字花科植物如大白菜的葉子。 如本文所用，植物的“非食用組織(器官)”指來自于植物體的，通常不被作為食品或也不被加工為食品的植物組織(器官)。一些農作物中，“非食用組織(器官)”例如:禾本科作物如水稻、小麥的莖、葉、根，薯類植物如甘薯的莖、蔓，十字花科植物如大白菜、擬南芥的根。如本文所用，“表達盒”在這里是指重組DNA分子，它包含預期的核酸編碼序列，這個序列編碼SpHMTl蛋白；這個DNA分子還包含轉錄在體外或體內可操作的連接編碼序列所必需的或預期的適合的調控元件。“調控元件”在這里指的是可控制核酸序列表達的核苷酸序列。可作為典范的調控元件包括啟動子，轉錄終止序列或上游調節區，這些調控元件有助于核酸的復制、轉錄、轉錄后修飾等。此外，調控元件還可以包括:增強子，內核糖體進入位點(IRES)，復制起點，多腺苷酸化信號等。如本文所用，所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調節或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變啟動子等來獲得。如本文所用，“組織特異性啟動子”又稱“器官特異性啟動子”，在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現出發育調節的特性。通常，如果在某組織或器官中mRNA以比在其它組織或器官中高至少10倍，優選至少高100倍，更優選至少高1000倍水平被表達，則該啟動子被認為是組織或器官特異性的。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構
成”、“基本上由......構成”、和“由......構成”；“主要由......構成”、“基本上
由......構成”和“由......構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。液泡膜轉運蛋白HMTl
液泡膜轉運蛋白HMTl蛋白，也稱為:PC-金屬復合物液泡膜轉運蛋白、液泡金屬轉運蛋白、PC-轉運蛋白、植物螯合肽(素)轉運蛋白、重金屬耐受因子。已有的研究發現，在多種生物中均發現了編碼HMTl蛋白的HMTl基因，例如酵母、果蠅和線蟲中分別存在SpHMTl (Z14055), DmHMTl (EU571211)和 CeHMTl (AF497513)基因。本發明的多肽(蛋白)可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選的是重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括HMTl蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的HMTl蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋 白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發明中，術語“ SpHMTI蛋白”指具有提高植物耐受鎘等重金屬能力或可以調節植物組織中重金屬積累程度的GenBank登錄號CAA78419序列的多肽。該術語還包括具有提高植物耐受鎘等重金屬能力的、GenBank登錄號CAA78419序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個或1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或減少一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括SpHMTl蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與SpHMTl蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗SpHMTl蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含SpHMTl蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了 SpHMTl蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有SpHMTl蛋白序列的至少約20個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。本發明還提供SpHMTl蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然SpHMTl蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括:體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，“SpHMTl蛋白保守性變異多肽”指與GenBank登錄號CAA78419的氨基酸序列相比，有至多30個，較佳地至多20個，更佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行氨基酸替換而產生。表I
權利要求
1.一種液泡膜轉運蛋白HMTl的用途，用于提高植物對重金屬的耐受性、調節重金屬的定向分配或提高重金屬脅迫下植物的葉綠素含量。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的液泡膜轉運蛋白HMTl用于向植物細胞的液泡內轉運重金屬。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的重金屬包括:鎘，砷，銅或鋅。
4.一種提高植物對于重金屬的耐受性、調節植物組織中重金屬積累程度或提高重金屬脅迫下植物的葉綠素含量的方法，其特征在于，所述方法包括:在植物中表達液泡膜轉運蛋白 HMTl。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括:將液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒轉入植物中，從而在植物中表達液泡膜轉運蛋白HMTl。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒; (2)將植物細胞或組織或器官與步驟(I)中的農桿菌接觸，從而使液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上； (3)選擇出轉入了液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒的植物細胞或組織或器官；和 (4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植物。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的調節植物組織中重金屬積累程度的方法包括: 將液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒轉入植物中，該液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒包括操作性連接的啟動子、編碼液泡膜轉運蛋白HMTl的多核苷酸； 其中，所述的啟動子是植物特定組織特異性表達啟動子，從而驅動液泡膜轉運蛋白HMTl在植物特定組織中表達，促進重金屬轉運入該植物特定組織。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的植物是包括可食用組織的植物，所述的啟動子是植物的非食用組織特異性表達啟動子，從而將重金屬轉運入植物的非食用組織。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的非食用組織特異性表達啟動子是植物根特異性表達啟動子； 較佳地，所述的根特異性表達啟動子包括:Adh啟動子，NTl啟動子，ZmGLUl啟動子。
10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的啟動子是植物地上部分組織的特異性啟動子。
11.一種液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒，其包括操作性連接的啟動子、編碼液泡膜轉運蛋白HMTl的多核苷酸；其中，所述的啟動子是植物特定組織特異性表達啟動子。
12.權利要求11所述的液泡膜轉運蛋白HMTl的表達盒的用途，用于調節植物組織中重金屬積累程度，促進重金屬轉運入該植物特定組織。
全文摘要
本發明涉及一種提高植物對重金屬耐受性及調節重金屬定向分配的方法。本發明首次將液泡膜轉運蛋白HMT1基因在植物中表達，提高了植物對重金屬的耐受性。并通過該基因的組織特異性表達，實現重金屬在植物體內的定向分配。本發明的基因可應用于植物品種的改良，包括提高植物對于重金屬的抵抗力；調節植物不同的組織、器官中重金屬的含量；減少植物可食用部位中重金屬的含量；促進植物修復；提高鎘等重金屬脅迫下植物的葉綠素含量等。本發明為運用轉基因等分子育種技術培育植物新品種提供了非常有價值的基因定向表達操作方法。
文檔編號A01H5/00GK103184237SQ20111045417
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者龔繼明, 黃婧 申請人:中國科學院上海生命科學研究院