專利名稱：一株耐重金屬的多環芳烴降解菌及其在復合污染土壤修復中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于環境工程和微生物工程技術領域。尤其涉及一株降解多環芳烴的克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae tzyxl)及其在復合污染土壤修復中的應用。
背景技術：
多環芳烴(PAHs)是一類持久性有機污染物(POPs)。PAHs污染的源主要來自于廢舊機器油、電器產品的潤滑油和來自廢舊金屬拆解中的木材、有機高分子化合物、紙張等含碳氫化合物的物質經不完全燃燒或在還原性氣氛中經熱分解而生成的。由于多環芳烴及其衍生物具有致癌性、致突變性和致畸性，以及急性毒性和亞致死作用，目前已引起人們的極大關注。
多環芳烴(PAHs)污染土壤修復是當前環境修復中研究的熱點。生物降解是對PAHs污染土壤進行修復的重要途徑之一。對于多環芳烴污染，國內外進行了大量多環芳烴降解微生物的篩選工作。到目前為止，已分離出多個具有多環芳烴降解能力的菌株，如假單胞菌屬、分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬等，但是未見肺炎桿菌用于多環芳烴降解中的報道。調查研究表明，許多污染土壤都呈現出重金屬和多環芳烴復合污染的趨勢。這兩類不同性質的污染物共存時會產生一系列復雜的化學、生化及物理化學過程三方面的交互作用，致使復合條件下的污染物的環境行為與非復合污染環境中的相比更加復雜，而重金屬離子對微生物菌群的生物毒性影響也不容忽視，當土壤中的重金屬離子含量較高時，會破壞微生物的生理結構，使其徹底喪失分解有機物、修復土壤的功能。因此，現有技術缺乏一種可以耐受重金屬環境的多環芳烴降解菌株

發明內容
本發明針對現有技術中多環芳烴降解菌不耐重金屬的不足之處，提供一種降解多環芳烴菌株、該菌株在治理多環芳烴和重金屬污染土壤中可以應用。為達到上述目的，本發明是通過以下技術方案得以實現的一種耐重金屬的多環芳烴降解菌，其特征在于，該菌株為克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) Tzyxl,在中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC M2012239，具備降解多環芳烴的能力。所述菌株具有以多環芳烴為唯一碳源和能源進行生長的能力。所述菌株的16SrDNA序列如SEQ NO. I所示。所述重金屬選自Cu2+、Zn2+、Pb3+中的一種或其混合物。所述耐重金屬的多環芳烴降解菌在多環芳烴污染的土壤的生物修復中的應用。所述耐重金屬的多環芳烴降解菌在重金屬和多環芳烴復合污染土壤生物修復中的應用。利用所述耐重金屬的多環芳烴降解菌進行土壤生物修復的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成選取重金屬和多環芳烴污染的土壤100g，按質量百分比2. 0%加入克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) tzyxl,與土壤混合均勻,加水使土壤含水率保持在15%，放入恒溫振蕩器中，控制培養溫度在25°C的恒溫條件下，振蕩培養修復15d，即能實現對復合污染土壤的生物修復。本發明提供的克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae),命名為于tzyxl,2012年6月24日保藏于“中國典型培養物保藏中心”，其保藏號CCTCC NO M 2012239。tzyxl是從浙江省臺州市固體廢棄物拆解場某污染土壤中分離，并篩選得到。菌株可在15 35°C，pH值6. O 8. 5培養條件下較好生長；菌株形態特征為革蘭氏染色呈陰性，電子顯微鏡下觀察為較粗短的桿菌，單獨、成雙或短鏈狀，無芽胞和鞭毛，有莢膜和菌毛。菌株LB培養24h菌落特征為圓形，白色，以接種環挑之易拉成絲；菌落表面光滑，邊緣整齊。作為優選，本發明所述菌株能以多環芳烴為唯一碳源和能源生長。 上述耐重金屬多環芳烴降解菌的篩選方法，可按如下步驟依次實施(I)從固廢拆解場采集距地表下5 20cm處表層土壤樣品，作為菌源進行自然富集培養；所述富集培養基含有葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4 ；(2)取(I)中所述富集培養液接種于無機鹽選擇培養基中進行選擇培養，所無機鹽選擇培養基含有檸檬酸鈉、(NH4) 2S04、MgS04、K2HPO4, KH2PO4 ;添加多環芳烴和重金屬。(多環芳烴萘、菲、突蒽、花、苯并蒽、苯并花的濃度均為150mg/L 250mg/L ;重金屬Cu2+、Zn2+、Pb3+ 濃度均為 150mg/L 250mg/L,)；(3)取(2)中所述選擇培養物稀釋涂布于固體無機鹽選擇培養基上，進行分離進行分離即得到多環芳烴降解菌Tzyxl。上述多環芳烴降解菌Tzyxl可用于多環芳烴和重金屬污染土壤的生物修復。本發明Tzyxl可在15 35 °C，pH值6. O 8. 5培養條件下較好生長；菌株形態特征為革蘭氏染色呈陰性，電子顯微鏡下觀察為較粗短的桿菌，單獨、成雙或短鏈狀，無芽胞和鞭毛，有莢膜和菌毛。菌株LB培養24h菌落特征為圓形，白色，以接種環挑之易拉成絲；菌落表面光滑，邊緣整齊。tzyxl在LB (胰蛋白胨I. 0%，酵母提取物O. 5%，氯化鈉I. 0%)培養24小時菌落特征為圓形，菌落直徑2 3mm，白色，表面光滑，邊緣整齊。tzyxl的生理生化特征，見表I。表Itzyxl的生理生化特征
鑒定項目鑒定結果
吲哚產生__:_
_ M. R實驗-
~V. P實驗 —+
明膠水解__+_
_尿酶實驗+
酪素水解__-_
苯丙氨酸脫羧酶 ^-
精氨酸雙水解酶 -_
卵磷脂酶___
KCN__+_
KNO3+~
權利要求
1.一種耐重金屬的多環芳烴降解菌，其特征在于，該菌株為克雷白氏肺炎桿菌(,Klebsiella pneumoniae ) tzyxI,在中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC NO M2012239，具備降解多環芳烴的能力。
2.根據權利要求I所述耐重金屬的多環芳烴降解菌，其特征在于所述菌株具有以多環芳烴為唯一碳源和能源進行生長的能力。
3.根據權利要求I所述耐重金屬的多環芳烴降解菌，其特征在于所述菌株的16SrDNA序列如SEQ NO. I所示。
4.根據權利要求I所述耐重金屬的多環芳烴降解菌，其特征在于所述重金屬選自Cu2+、Zn2+、Pb3+中的一種或其混合物。
5.根據權利要求I所述耐重金屬的多環芳烴降解菌在多環芳烴污染的土壤的生物修復中的應用。
6.根據權利要求I所述耐重金屬的多環芳烴降解菌在重金屬和多環芳烴復合污染土壤生物修復中的應用。
7.利用權利要求I所述耐重金屬的多環芳烴降解菌進行土壤生物修復的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成選取重金屬和多環芳烴污染的土壤100g，按質量百分比2. 0%加入克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae ) tzyxl,與土壤混合均勻,加水使土壤含水率保持在15%,放入恒溫振蕩器中,控制培養溫度在25°C的恒溫條件下,振蕩培養修復15d，即能實現對復合污染土壤的生物修復。
全文摘要
本發明屬于環境工程和微生物工程技術領域。尤其涉及一株降解多環芳烴的克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniaetzyx1)及其在復合污染土壤修復中的應用。該菌株為克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)Tzyx1，在中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC M2012239，具備降解多環芳烴的能力。該菌株在治理多環芳烴和重金屬污染土壤中可以應用。
文檔編號C12N1/20GK102943052SQ201210387958
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者奚立民, 張昕欣, 于紅艷 申請人:臺州職業技術學院