專利名稱：一種羅非魚精子通用激活液及制備方法
技術領域：
本發明涉及羅非魚品種的精子技術領域，更具體涉及一種羅非魚精子通用激活液，同時還涉及一種羅非魚精子通用激活液的制備方法，適合所有羅非魚品種的精子。
背景技術：
羅非魚(Tilapia)為一種中小型魚，被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一。 原產于非洲，上世紀70年代被引進到我國，目前已成為我國一個重要的水產養殖品種。隨著我國對羅非魚品種的選育和改良，除最初引進的尼羅羅非魚(O. niloticus)和奧尼亞羅非魚(O. aureus)外，又培育了許多新的品種。如尼羅羅非魚和奧尼亞羅非魚的雜交后代奧尼羅非魚；通過3系雜交選育的后代尼羅超雄魚；以及由8個品系的尼羅羅非魚經雜交混合選育的吉富羅非魚等。為了能進一步開展羅非魚的新品種選育以及羅非魚的人工繁殖，為市場提供更優質的羅非魚新品種和苗種，需要進行羅非魚精子超低溫保存，并將保存后的精液應用于羅非魚的人工繁殖過程中。然而，當精子被超低溫保存時，為了提高精子的抗凍能力，除了對精液進行稀釋外，還需要在稀釋的精液中添加一定量的抗凍劑，如二甲亞砜(DMSO)等。由于抗凍劑具有很強的吸水性，當被添加到精液中后，可以使精子細胞內的一部分水被吸出。 精子細胞的水分流失導致精子細胞內的細胞液濃度升高，精子的冰點也隨之升高，從而提升了精子的抗凍能力。也正是由于精子細胞內的細胞液濃度升高，精子的滲透壓也會隨之升高。這樣，經超低溫保存后的精子再解凍后，一般稱為凍精，其滲透壓與鮮精(未經超低溫保存的，新擠出的精子)相比會高出30 40%。經超低溫保存I年后的羅非魚凍精滲透壓可以達到388. 4m0sM。含如此高內部滲透壓的凍精，如果直接用淡水激活進行人工授精， 在巨大的滲透壓差作用下，其凍精一遇見水就可能破裂，從而使人工授精失敗。解決這一問題的辦法就是用具有一定滲透壓的精子激活液來替代淡水對羅非魚凍精進行激活，以減少這種滲透壓差。因此，羅非魚精子激活液的作用就是減少這種滲透壓差，使羅非魚凍精在激活時不會破裂，順利實現用凍精進行羅非魚人工授精。另一方面，羅非魚精子激活液除了減少凍精與激活液間的滲透壓差，保護凍精在激活過程中不破裂的作用外，對一般羅非魚鮮精也有使精子活力優化的作用。這是因為激活液是由不同離子或大分子物質組成的，這些離子和大分子物質對精子的運動可以起到一定的優化作用。如=Na離子主要是起調節激活液滲透壓的作用洱離子起著改變精子膜表面通透性的作用；Ca、Mg離子則起著增加或降低精子運動速度的作用；而CO3離子則起著調節激活液PH的作用等。除此之外，有報道顯示葡萄糖和蔗糖等大分子類溶質除了起到調節滲透壓的作用外，還具有提供精子能量的作用。羅非魚精子激活液是由蔗糖、KCUMgCl2和 NaHCO3等4種物質組成。由于這些物質對羅非魚精子的不同作用，使羅非魚精子被激活后的生物學特性發生了很大變化。通過計算機輔助分析發現，采用羅非魚精子激活液激活的精子與不采用激活液激活的精子比較，呈快速直線運動的精子比例由58%提高到72% ;精子曲線運動的平均速度(VCL)由35. 96±1.68 μ m/s提高到42. 90±1.54 μ m/s ;精子直線運動的平均速度(VSL)由20. 62 ±1.21 μ m/s提高到25. 86 ±1.35 μ m/s ;精子路徑運動的平均速度(VAP)由23. 54±0· 43 μ m/s提高到29. 30± I. 08 μ m/s ;精子的平均壽命由4分 30秒提高到5分45秒。由此可見，羅非魚精子激活液對提高羅非魚精子的活力起著十分重要的作用。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種羅非魚精子通用激活液，適合各種羅非魚品種精子的激活，是采用羅非魚鮮精和凍精進行人工授精所必須的一種溶液。在用羅非魚凍精授精時，它可減少凍精與授精環境間的滲透壓差，使羅非魚凍精在激活時不會破裂，順利實現用凍精進行羅非魚人工授精。在用鮮精進行人工授精時，它可有效提高鮮精的活力，從而提高受精率。本發明的另一個目的是在于提供了一種羅非魚精子通用激活液的制備方法，方法易行，操作簡便，適合配制各種體積的激活液，可確保所配制激活液中個組分濃度的準確性。
為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施
一種羅非魚精子通用激活液，它由以下重量份的原料制成 原料重量份
鹿糖62-78mmol/L
氯化鉀(KCl )0.7- 2.3mmol/L
碳酸氫鈉(NaHC03)1.8-4.2mmol/L
氯化鎂(MgCl2 )3.4-6.6 mmol/L
激活液滲透壓為87. 4 134. 2m0sM, pH為8. O 9. O。
一種羅非魚精子通用激活液，它由以下重量份的原料制成
原料蔗糖氯化鉀(KCl ) 碳酸氫鈉(NaHC03)
重量份(較好范圍) 64-76mmol/L 0.9- 2.1 mmol/L 2.1- 3.9mmol/L 3.8-6.2 mmol/L
氯化鎂(MgCl2 )
激活液滲透壓為93. 6 128. 4m0sM, pH為8. I 8. 9。
一種羅非魚精子通用激活液，它由以下重量份的原料制成
原料重量份(好范圍)
鹿糖66-74 mmol/L
氯化鉀(KC1 )1.1- 1.9mmol/L
碳酸氫鈉(NaHC03)2.4-3.6mmol/L
氯化鎂(MgCl2 )4.2-5.8mmol/L激活液滲透壓為99. 4 122. 6m0sM, pH為8. 2 8. 8。一種羅非魚精子通用激活液，它由以下重量份的原料制成
原料重量份(優選范圍)
鹿糖68-72 mmol/L
氯化鉀(KC1 )1.3- 1.7mmol/L
碳酸氫鈉(NaHC03)2.7-3.3mmol/L
氯化鎂(MgCl2 )4.6-5.4mmol/L激活液滲透壓為105. 2 116. 8m0sM, pH為8. 3 8. 7。一種羅非魚精子通用激活液，它由以下重量份的原料制成
原料重量份(最佳值)
鹿糖70 mmol/L
氯化鉀(KC1 )1.5mmol/L
碳酸氫鈉(NaHC03)3.0mmol/L
氯化鎂(MgCU )5.0 mmol/L。本配方的激活液滲透壓為111. OmOsM, pH為8. 5。一種羅非魚精子通用激活液的制備方法，其步驟是1.激活液母液的配制(1)每毫升含蔗糖lmmol的母液根據母液的濃度、體積和蔗糖分子量計算出配制 母液需要的蔗糖重量，計算精確度為0.0g。用天平精確稱取該重量分析純的蔗糖，將蔗糖放 入燒杯中，加入體積約為需要配制母液體積二分之一的蒸餾水，使蔗糖充分溶解，將溶解后 的蔗糖溶液倒入需要配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 10ml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處。蔗糖重量計算公式如下溶質重量=(母液濃度X溶質分子量)+母液體積以下溶質重量均按此公式計算。(2)每毫升含氯化鉀Immol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鉀分子量計算出配制母液需要的氯化鉀重量，計算精確度為O. 0g。用天平精確稱取該重量分析純的氯化鉀(KCl)，將氯化鉀(KCl)放入燒杯中，加入體積約為需要配制母液體積二分之一的蒸餾水，使氯化鉀充分溶解，將溶解后的氯化鉀溶液倒入需要配制母液同樣體積的容量瓶中，用 5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處。(3)每毫升含氯化鎂O. 5mmol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鎂分子量計算出配制母液需要的氯化鎂重量，計算精確度為O. 0g。用天平精確稱取該重量分析純的氯化鎂(MgCl2)將氯化鎂放入燒杯中，加入體積約為需要配制母液體積二分之一的蒸餾水，使氯化鎂充分溶解，將溶解后的氯化鎂溶液倒入需要配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處。(4)每毫升含碳酸氫鈉O. 5mmol的母液根據母液的濃度、體積和碳酸氫鈉分子量計算出配制母液需要的碳酸氫鈉重量，計算精確度為0.0g。用天平精確稱取該重量分析純的碳酸氫鈉(NaHCO3)，將碳酸氫鈉放入燒杯中，加入體積約為需要配制母液體積二分之一的蒸餾水，使NaHCO3充分溶解，將溶解后的NaHCO3溶液倒入需要配制母液同樣體積的容量瓶中，用5 IOml蒸餾水洗滌3次燒杯，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處。 (5)上述母液均放置4 °C冰箱保存，備用。2.精子稀釋液的配制(I)用微量取樣器(規格5 μ I 5ml)從各組分母液中精確量取配制激活液所需體積的各組分。量取各組分所需的體積根據激活液配方中各組分的濃度、各組分母液的濃度、以及所需配制的激活液體積，按如下公式計算量取體積=(配方濃度X稀釋液體積)+母液濃度(2)將上述各組分混合均勻。如果需要配制的激活液體積大于100ml，則在相應體積的容量瓶中混勻，然后用蒸餾水定容至容量瓶刻度。如果需要配制的稀釋液體積小于 100ml，則在玻璃瓶中混勻，然后根據需要配制的稀釋液體積減去已經量取的各組分體積總和，就是需要加入的蒸懼水體積(因為容量瓶最小為100ml)。(3)配制好的稀釋液放置4°C冰箱保存，備用。配制一款適合各種羅非魚精子的精子激活液，以便使羅非魚鮮精和經超低溫冷凍保存的凍精獲得良好的人工授精效果，從而為羅非魚的選育種提供可靠的方法和技術保證。本發明與其他魚類精子激活液的比較下表為羅非魚精子與其他幾種魚類精子激活液成分的比較
權利要求
1.一種羅非魚精子通用激活液，它由以下重量份的原料制成原料重量份蔗糖62-78mmol/L氯化鉀0.7- 2.3mmol/L碳酸氫鈉1.8-4.2mmol/L氯化鎂激活液滲透壓為87. 4 134. 2m0sM，pH為8. O 一種羅非魚精子通用激活液的制備方法，其步驟是3.4-6.6 mmol/LA、激活液母液的配制(1)每毫升含蔗糖Immol的母液根據母液的濃度、體積和蔗糖分子量計算出配制母液的蔗糖重量，稱取蔗糖，將蔗糖放入燒杯中，加入體積為配制母液體積二分之一的蒸餾水， 使蔗糖溶解，將溶解后的蔗糖溶液倒入配制母液同樣體積的容量瓶中，用蒸餾水洗滌3次， 將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處，蔗糖重量計算公式如下溶質重量=母液濃度X溶質分子量+母液體積；(2)每毫升含氯化鉀Immol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鉀分子量計算出配制母液需要的氯化鉀重量，稱取氯化鉀，將氯化鉀放入燒杯中，加入配制母液體積二分之一的蒸餾水，使氯化鉀充分溶解，將溶解后的氯化鉀溶液倒入配制母液同樣體積的容量瓶中，用蒸餾水洗滌3次，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸懼水定容至容量瓶刻度處；(3)每毫升含氯化鎂O.5mmol的母液根據母液的濃度、體積和氯化鎂分子量計算出配制母液的氯化鎂重量，稱取氯化鎂，將氯化鎂放入燒杯中，加入體積為配制母液體積二分之一的蒸餾水，使氯化鎂溶解，將溶解后的氯化鎂溶液倒入配制母液同樣體積的容量瓶中，用蒸餾水洗滌3次，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處；(4)每毫升含碳酸氫鈉O.5mmol的母液根據母液的濃度、體積和碳酸氫鈉分子量計算出配制母液的碳酸氫鈉重量，稱取碳酸氫鈉，將碳酸氫鈉放入燒杯中，加入體積為配制母液體積二分之一的蒸餾水，使碳酸氫鈉溶解，將溶解后的碳酸氫鈉溶液倒入配制母液同樣體積的容量瓶中，用蒸餾水洗滌3次，將洗滌后的蒸餾水也倒入容量瓶，最后用蒸餾水定容至容量瓶刻度處；(5)上述母液均放置4°C冰箱保存，備用；B、精子稀釋液的配制(1)用取樣器從各組分母液中量取配制激活液，根據激活液配方中各組分的濃度、各組分母液的濃度、以及所配制的激活液體積，按如下公式計算量取體積=配方濃度X稀釋液體積+母液濃度；(2)將上述各組分混合均勻；配制的激活液體積大于100ml，在相應體積的容量瓶中混勻，然后用蒸餾水定容至容量瓶刻度，配制的稀釋液體積小于IOOml，在玻璃瓶中混勻，根據配制的稀釋液體積減去已經量取的各組分體積總和，加入的蒸餾水體積；(3)配制好的稀釋液放置4°C冰箱保存，備用。
2.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用激活液，其特征在于 原料重量份鹿糖64-76mmol/L氯化鉀0.9-2.1mmol/L碳酸氫鈉2.1-3.9mmol/L氯化鎂3.8-6.2 mmol/L激活液滲透壓為93. 6 128. 4m0sM, pH為8. I 8. 9。
3.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用激活液，其特征在于 原料重量份鹿糖66-74 mmol/L氯化鉀1.1- 1.9mmol/L碳酸氫鈉2.4-3.6mmol/L氯化鎂4.2-5.8mmol/L激活液滲透壓為99. 4 122. 6m0sM, pH為8. 2 8. 8。
4.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用激活液，其特征在于 原料重量份鹿糖68-72 mmol/L氯化鉀1.3- 1.7mmol/L碳酸氫鈉2.7-3.3mmol/L氯化鎂4.6-5.4mmol/L激活液滲透壓為105. 2 ~ 116. 8m0sM, pH為8. 3 8. 7。
5.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用激活液，其特征在于 原料重量份鹿糖70 mmol/L氯化鉀1.5mmol/L碳酸氫鈉3.0mmol/L氯化鎂5.0 mmol/L。激活液滲透壓為111. OmOsM, pH為8. 5。
6.根據權利要求I所述的一種羅非魚精子通用激活液，其特征在于原料重量份鹿糖71 mmol/L氯化鉀1.6mmol/L碳酸氫鈉2.8mmol/L氯化鎂4.6mmol/L。 激活液滲透壓為121. OmOsM, pH為8. 6。
全文摘要
一種羅非魚精子通用激活液及制備，它由蔗糖、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鎂組成，其步驟A、激活液母液的配制(1)根據母液的濃度、體積和蔗糖分子量計算出配制母液需要的蔗糖重量，稱取蔗糖，(2)根據母液的濃度、體積和氯化鉀分子量計算出配制母液需要的氯化鉀重量，稱取氯化鉀；(3)根據母液的濃度、體積和氯化鎂分子量計算出配制母液需要的氯化鎂重量；(4)根據母液的濃度、體積和碳酸氫鈉分子量計算出配制母液的碳酸氫鈉重量，將碳酸氫鈉放入燒杯中，保存；B、精子稀釋液的配制從各組分母液中量取配制激活液所需體積的各組分、混合、放置冰箱、備用。配方合理，方法易行，操作簡便，高于中華鱘精子激活液的滲透壓，低于大口鯰精子激活液的滲透壓。
文檔編號A01K61/00GK102578007SQ20121000753
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者張潔明, 張濤, 李忠, 柳凌, 梁宏偉, 鄒桂偉, 郭峰 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所