專利名稱：一種魚類精子抗凝集保存液及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于低溫生物學研究領域，具體涉及一種魚類精子抗凝集保存液及其制備方法和應用。
背景技術：
精子凝集是精子超低溫冷凍過程中比較常見的一種現象，輕微的凝集可使得部分精子發生交聯，限制精子的運動，嚴重的凝集則促使大量精子發生膜融合并呈片狀、條狀、團塊狀，且單個精子結構喪失。本專利申請的發明人董巧香等曾在對太平洋牡蠣精子超低溫凍存的研究中詳細的描述過這種現象(詳見Qiaoxiang Dong, Changjiang Huang, et al. Control of sperm concentration is necessary for standardization of spermcryopreservation in aquatic species: Evidence from sperm agglutination inoysters. Cryobiology, 2007，54:87-98)。
董巧香等在研究如何避免超低溫冷凍過程中魚類精子發生凝聚問題時發現，在超低溫冷凍過程中斑馬魚精子可釋放出某種促精子凝聚的成分。因為用收集的斑馬魚凍精上清液來處理未經冷凍的斑馬魚精子，同樣可使斑馬魚精子出現凝聚現象。在此基礎之上，他們發現用斑馬魚凍精上清液同樣可誘導其它魚類(虎皮魚、頭尾燈)精子的凝聚，但卻對人類精子不具促凝效果。為此，他們認為人類精漿可能含有某種抗凝聚的成分。因此，他們用人類精漿來處理斑馬魚精子，從而發現了人類精漿的這種抗魚類精子凝聚的功效。他們根據多年從事魚類低溫冷凍保存的經驗和對精子冷凍中膜脂含量的變化，認為魚類精子這種凍凝特性可能源自于精子胞膜中的鞘磷脂。他們們使用鞘磷脂脂質體來處理斑馬魚精子時，發現了與低溫冷凍過程所產生的相同的凝聚現象，而用其它脂類制備的脂質體則無類似的作用。因此，初步證實了是鞘磷脂誘導魚類精子在冷凍過程中發生凝聚現象，而人類精漿卻可以有效對抗這種由鞘磷脂誘導的魚類精子凝聚。通過使用人類精漿的處理來有效對抗魚類精子冷凍過程中凝聚的方法。目前國內外還尚未見相關報道。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種魚類精子抗凝集保存液及其制備方法和應用，以有效防止魚類精子在超低溫冷凍過程中發生凝聚，簡單易行且適用于其他很多魚類。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
一種魚類精子抗凝集保存液的制備方法，包括以下步驟
1)人類精漿的獲得；
2)人類精漿的純化；
3)魚類精子抗凝集保存液的制備。進一步地，上述步驟I)包括從健康人體獲取新鮮精液，于35-40°C溫箱中保存待其液化；將液化的精液分裝至I. 5ml離心管(Iml/管)，然后高速離心(10000轉/分離心10分鐘)，吸取上層精漿(吸取的精漿體積為離心用的精液體積的1/2至2/3，避免吸取到沉淀)至1.5ml離心管中，保存備用。進一步地，上述步驟2)包括將上述步驟I)中獲得的精漿于-16至-20°C冰箱中冷凍，待精漿全部凍結后取出，于室溫下自然解凍，高速離心(10000轉/分離心10分鐘)去除析出的雜質，并按上述條件再重復冷凍、解凍、離心一次，獲得含雜質更少的精漿；最后，用O. 22-0. 45 μ m濾膜過濾，獲得純化的精漿于0_4°C保存備用。進一步地，上述步驟3)包括先將純化后的精漿與Hank’s平衡溶液以I :1至I :3的體積比混合；然后使用滲透壓儀對該混合溶液的滲透壓進行檢測(制備完成后或使用時檢測均可)，以接近該種魚類精漿的滲透壓或利于抗凍的滲透壓為宜(需要添加某些非滲透性抗凍劑時，要考慮抗凍劑帶來的滲透壓變化以避免精子的激活或損傷)，并使用超純水(降低)，或葡萄糖(提升)來調節滲透壓至目標滲透壓(淡水魚精子保存液的滲透壓應介于260-310m0s/kg之間，海水魚精子保存液的滲透壓應介于150_200m0s/kg之間)。具體使 用時只需用該保存液懸浮精子即可。本發明還提供上述方法制備的魚類精子抗凝集保存液，以人類精漿為原料，純化后以I :1至I :3的體積比與Hank’s平衡溶液混合制得。本發明進一步提供上述魚類精子抗凝集保存液在防止魚類精子凝聚中的應用。本發明產生的有益效果如下
本發明方法所制備的魚類精子抗凝集保存液，可以有效避免由精子凝聚所引起的精子損傷，最大限度地保存每一個精子所攜帶的信息，減少由于精子凝聚所引起的精子受精能力的影響，降低精子凝聚所帶來的精子參數分析的干擾，從而使得經歷凍存的每一個精子在解凍后都可以被最大幅度地利用。


圖I示出了本發明提供用于抗魚類精子凝聚方法的技術路線 圖2示出了人類精漿抗斑馬魚冷凍凝聚的效果圖(A :對照組，B :人類精漿處理組)；
圖3示出了鞘磷脂脂質體誘導的精子凝聚以及人類精漿抗鞘磷脂引起的精子凝聚效果(A:鞘磷脂測試液處理之前的斑馬魚精子圖；B: Hank’s平衡溶液懸浮的對照組經過鞘磷脂測試液處理后的表現圖；C:人類精漿處理組經鞘磷脂測試液處理后的結果圖；A’ :鞘磷脂測試液處理之前的斑馬魚精子放大效果圖；B’ : Hank’s平衡溶液懸浮的對照組經過鞘磷脂測試液處理后的表現放大效果圖；C’ :人類精漿處理組經鞘磷脂測試液處理后的結果放大圖)。
具體實施例方式應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的發明。除非另有說明，本文使用的所有科學和技術術語具有與本發明所屬技術領域人員通常理解的相同含義。下面結合附圖作進一步說明
一種魚類精子抗凝集保存液的制備方法(見圖I)，具體實施步驟如下
一、人類精漿的獲得(I)精液獲取選 擇身體健康的志愿者(無性病、血液傳播疾病，相關病原檢測為陰性)。通過手淫法取得新鮮精液，于37°c溫箱中保存待其液化(30分鐘后仍未液化的精液則棄去不用)。(2)分離精漿將液化的精液分裝至I. 5ml離心管(lml/管)以4°C，10000轉/分離心10分鐘，吸取上層精漿備用(吸取的精漿體積為離心用的精液體積的1/2，避免吸取到沉淀)。二、人類精漿的純化
(I)精漿凍融處理將取得的精漿于-20°C冰箱中冷凍，待精漿全部凍結后取出，于室溫下自然解凍(注意冷凍時，需使用I. 5ml離心管分裝；冷凍和解凍過程中均需保持離心管正立，并在解凍后避免搖晃離心管以避免凍融過程中所析出的雜質再溶)。(2)離心將解凍后的精漿(置于原離心管內)以4°C，10000轉/分離心10分鐘去除析出的雜質(注意重復執行精漿凍融、離心兩步，可獲得含雜質更少的精漿)。(3)過濾將離心后的精漿用O. 45 μ m聚碳酸酯濾膜過濾，獲得純化的精漿于-20°C保存備用。三、魚類精子抗凝集保存液的制備
(I)精漿稀釋將純化后的精漿以I :2的體積比與Hank’s平衡溶液混合。(2)調整滲透壓使用滲透壓儀(德國G0N0TEC公司0SM0MAT_30_M型)對該混合溶液的滲透壓進行檢測，以接近該種魚類精漿的滲透壓或利于抗凍的滲透壓為宜(需要添加某些非滲透性抗凍劑時，要考慮抗凍劑帶來的滲透壓變化以避免精子的激活或損傷)，通過加入超純水(降低)，或葡萄糖(提升)來對抗凝集保護液的滲透壓進行微調以調整至合適范圍。(用于保存淡水魚精子的溶液滲透壓應為260-310m0s/kg，若是海水魚類則滲透壓應為150-200m0s/kg，淡水卵生魚類一般可無需調整，在發現該保存液可激活魚類精子時再做調整)。用該液懸浮所需凍存的魚類精子即可達到抗凝聚的目的。以下結合具體實施例對本發明進行進一步的說明。實例I、應用于冷凍所引起的精子凝聚
通常，在精子冷凍過程中應盡量避免出現精子凝聚，從而達到較好的凍存效果。因此，當精子冷凍后出現了明顯的凝聚，則認為所選擇的冷凍方案并不是十分適合該種精子的凍存。最為極端的情況就是不添加任何抗凍劑直接投入液氮，可引起嚴重的精子凝聚。而人類精漿可明顯地在這種極端的情況下發揮其抗凝作用，其具體的實施步驟如下
I)人類精漿的獲得
方法同上。2)人類精漿的純化
方法同上。3)斑馬魚精子抗凝保存液的配制
方法同上。4)斑馬魚精子冷凍
斑馬魚精巢取出后于抗凝保存液中吹打施放出精子(以Hank’s平衡溶液作為對照)，調整精子濃度至IO8個/ml，分裝入麥管(或凍存管)，然后直接投入液氮，待精子懸液完全凍結后取出解凍，于顯微鏡下觀察。結果見圖3，圖3顯示以Hank’s平衡溶液作為對照的斑馬魚精子解凍后，出現嚴重凝聚，保持獨立的精子密度極低，而使用抗凝保存液的處理組精子高度分散，分布均勻，無凝聚現象。說明本方法可以很好地用于冷凍所引起的精子凝聚。實例2、應用于鞘磷脂所誘導的精子凝聚
本發明人已初步證實鞘磷脂會誘導魚類精子在冷凍過程中發生凝聚，因而在非冷凍狀態下于魚類精液中加入鞘磷脂，同樣會引起魚類精子發生凝聚，但人類精漿卻可對抗鞘磷脂脂質體的這種促凝作用我們采用不同魚種進行了實驗，結果見表I。表I :不同魚類精子添加人類精漿后的抗凝效果以及對于鞘磷脂敏感性測試。
權利要求
1.一種魚類精子抗凝集保存液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)人類精漿的獲得； 2)人類精漿的純化； 3)魚類精子抗凝集保存液的制備。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)所述人類精漿獲得的方法包括如下步驟從健康人體獲取新鮮精液，于35-40°C的溫箱中保存待其液化；將液化的精液分裝至1.5ml離心管，10000轉/分離心10分鐘，吸取上層精漿至1.5ml離心管中，保存備用；其中所述上層精漿的體積為離心用的精液體積的1/2至2/3。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)所述人類精漿純化方法包括如下 步驟將步驟I)中獲得的人類精漿于_16°C至_20°C冰箱中冷凍，待精漿全部凍結后取出，于室溫下自然解凍，10000轉/分離心10分鐘以去除析出的雜質，并按上述條件再重復冷凍、解凍、離心一次，獲得含雜質更少的精漿；最后，用O. 22-0. 45 μ m聚碳酸酯濾膜過濾，獲得純化的精漿于0-4°C保存備用。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟3)所述魚類精子抗凝保存液的制備包括以下步驟先將純化后的精漿與Hank’s平衡溶液以I :1至I :3的體積比混合，然后使用滲透壓儀檢測該混合溶液的滲透壓是否達到目標滲透壓，若滲透壓偏高或偏低，通過向混合溶液直接添加超純水來降低或添加葡萄糖來提升溶液滲透壓至目標滲透壓。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述目標滲透壓為接近所述魚類精漿的滲透壓或利于抗凍的滲透壓；其中，淡水魚精子保存液的滲透壓介于260-310m0s/kg之間，海水魚精子保存液的滲透壓介于150-200m0s/kg之間。
6.一種根據權利要求1-4任一所述方法制備的魚類精子抗凝集保存液，其特征在于，以人類精漿為原料，純化后以I :1至I :3的體積比與Hank’s平衡溶液混合制得。
7.—種權利要求6所述魚類精子抗凝集保存液在防止魚類精子凝聚中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種魚類精子抗凝集保存液及其制備方法和應用，所述方法包括以下步驟1)人類精漿的獲得；2)人類精漿的純化；3)魚類精子抗凝保存液的制備。本發明方法所制備的魚類精子抗凝集保存液不僅能有效對抗魚類精子凝聚所引起的精子損傷以及對精子受精能力的影響，而且還能最大限度地保存每個精子所攜帶的信息以及解凍后精子最大幅度的被利用。本發明將對于珍稀魚類種質資源的低溫冷凍保存具有重大的實際意義與應用價值。
文檔編號A01N1/02GK102630664SQ201210081749
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月26日 優先權日2012年3月26日
發明者劉靜, 危林丹, 林函, 白承連, 董巧香, 陳元紅, 陳將飛, 黃長江 申請人:溫州醫學院