專利名稱：穩定的免疫調節寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、免疫學和醫學領域。更具體地，本發明涉及免疫刺激性寡核苷酸及其在治療中的應用。
背景技術：
免疫系統已進化為特異性識別含有未甲基化的CpG 二核苷酸基序的DNA，所述的基序在病原微生物如細菌和病毒的DNA中廣泛存在。結果，含有未甲基化CpG的 DNA成為脊椎動物免疫系統的有效刺激劑。通過DNA免疫刺激的第一個報道來自應用細菌DNA和含有回文序列的DNA小片段的研究，所述的DNA都是具有磷酸二酯骨架的雙鏈結構。Tokunaga, T 等(J. Natl. Cancer Inst. 72 :955_962 (1984))報道了分離自牛分枝桿菌(Mycocacterium bovis)BCG 的 DNA 有效的抗腫瘤活性。Kataoka, T 等·，(Jpn. J. Cancer Res. 83 :244_247(1992))、Hartmann等· (European Journal of Immunology 33: 1673-1641 (2003))'Marshall 等(Journal of Leukocyte Biology73 781-792 (2003)顯示了合成的脫氧寡核苷酸的相似類型的抗腫瘤活性，所述合成的脫氧寡核苷酸的設計基于牛分枝桿菌BCG cDNA序列。Sato，Y，等(Science 273 :352_354 (1996))顯示了含有 CpG 的 DNA 在 DNA 疫苗應用中的重要性(也參見 Gurunathan S.，等(Annu. Rev. Immunol. 18 :927_974(2000))。 Pisetsky, D.S.,等(Mol. Biol. Rep. 18 :217_221 (1993))和 Krieg, A. M.,等·，(Nature 374 =546-549(1995))顯示，在特定序列的環境中含有未甲基化的CpG-二核苷酸的DNA (CpG DNA)激活脊椎動物的免疫系統，導致B細胞增殖，并且激活巨噬細胞、單核細胞、天然殺傷細胞(NK細胞)和樹突細胞。出于對CpG DNA激活的應答，免疫細胞分泌大量的細胞因子，包括IL-12、IFN- Y , INF-a、IL-6和TNF-α，并且表達幾個共刺激分子(例如，參見 Pisetsky, D. S.,等和 Krieg, A. M.,等，見前文)Kandimalla, E. R.，等(Curr· Opin. Mol. Ther. 4122-129(2002))指出 CpG- 二核 苷酸的存在和位置以及其側翼的序列對于其免疫刺激活性是關鍵的。Agrawal，S.，等 (Current Cancer Drug Targets I 197-209 (2001))公開了由于 CpG 寡核苷酸的側翼序列中的核糖修飾而產生的重大影響。這些影響取決于取代基的位置和性質，包括2’ -O-甲氧基乙氧基和 2’-或 3’ -O-甲基。Yu，D·，等(Bioorg. Med. Chem. 9 =2803-2808 (2001))證明了磷酸鹽修飾因修飾位點不同也能增高或降低免疫刺激活性。Yu D.，等(Bioorg. Med. Chem. Lett. 11 =2263-2267 (2001))和 Yu D.，等(Bioorg. Med. Chem. 11 459-464 (2003)) 公開了通過缺失某些核苷酸堿基能增加活性。此外Yu D.,等(Bioorg. Med. Chem. 11 : 459-464 (2003))公開了通過用非核苷酸連接體取代某些側翼核苷酸可增加免疫刺激活性。Yu D.，等(Bioorg. Med. Chem. Lett. 10 :2585_2588 (2000))，Yu D.，等(Nucleic AcidsRes.30 :4460_4469 (2002)), Yu D.,等(Biochem. Biophys. Res. Commun. 297 : 83-90 (2002)), Bhagat L.,等(Biochem. Biophys. Res. Commun. 300 853-861 (2003))以及 Kandimalla Ε· R.，等(Nucleic Acids Res. 31 =2393-2400 (2003))先前已經顯示 5’-末端參與了受體的識別，該末端的易接近性對于活性是關鍵的。Kandimalla E. R.,等(Bioconj. Chem. 13 =966-974(2002))公開了 5’ -末端連接比熒光素大的配基或5’ -5’連接的二核苷酸使免疫刺激活性損失。由于3’ -連接無影響，因此攝取上的改變不是所述結果的原因 (同上)。然而，沒有任何系統的研究以闡明DNA的二級結構在引起的免疫應答中的作用。 本發明在這里通過具有5’或3’ -發夾環或能形成雙鏈體的粘性末端的免疫刺激性DNA提供了免疫刺激的信息。免疫刺激性DNA誘導Thl細胞因子產生和促進增加免疫球蛋白產生的CTL應答的能力已經用于治療廣譜的疾病適應癥，其包括癌癥、病毒及細菌感染、炎癥性疾病以及作為免疫治療中的佐劑。因此提高或調節免疫刺激性DNA活性的益處是顯而易見的，而且在本技術領域中存在開發改進的免疫刺激性核酸的需求。

發明內容
本發明提供了包括具有增強或降低的免疫刺激性特性的免疫刺激性寡核苷酸的物質的新型組合物。本發明也提供了可進行具有增強或降低的免疫刺激性特性的或具有增加的代謝穩定性的免疫刺激性寡核苷酸的設計的方法。發明人令人驚訝地發現在免疫刺激性寡核苷酸的3’ -端或5’ -端引入二級結構可以明顯影響這些寡核苷酸的免疫刺激活性和穩定性。第一方面，本發明提供了免疫刺激性核酸。該免疫刺激性核酸包含寡核苷酸序列， 該寡核苷酸序列至少包含一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中，C 是胞苷或2’ -脫氧胞苷，G是鳥苷或2’ -脫氧鳥苷Cf是胞苷、2' _脫氧胸苷、I-(2'-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2_氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’ -雙脫氧-5-鹵代胞苷、 2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2' _脫氧-5-輕基胞苷、2' _脫氧-Ν4-燒基-胞苷、2' _脫氧-4-硫代尿苷或其它喃唳核苷類似物，G*是2'脫氧-7-脫氮-鳥苷、2' _脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2'-脫氧-2'取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、2'-脫氧肌苷或其它嘌呤核苷類似物， P是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選的實施方案中，寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的3’ -末端有二級結構。在一些優選的實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸長度為約2-約50個核苷酸。在一些實施方案中免疫刺激性核酸長度為約12-約26個核苷酸。在一些實施方案中,所述寡核苷酸每個具有約3-約35個核苷殘基，優選約4-約30個核苷殘基，更優選約4-約20個核苷殘基。在一些實施方案中，所述的寡核苷酸具有約5-約18個或約5-約14個核苷殘基。如在這里應用的，術語“約”意味著確切的數字并不重要。因而在所述寡核苷酸中核苷殘基的數目并不重要，具有I或2個較少的核苷殘基的寡核苷酸或者有一個到幾個額外核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。在一些實施方案中，有一個或多個寡核苷酸有11個核苷酸。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸具有3’ -末端莖環二級結構。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸通過與互補序列氫鍵結合的方式在3’ -末端具有二級結構。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸選自 SEQ ID NOS 2, 3,4,9,12,13,14,18,19, 20, 21, 24, 25, 26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37 或 38。第二方面，本發明提供了具有降低的免疫刺激活性的核酸。在此方面，所述的核酸包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列至少包含一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG, C*pG, C*pG*或CpG%其中，C是胞苷或2’ -脫氧胞苷，G是鳥苷或2’ -脫氧鳥苷，Cf是2'-脫氧胸苷、1-(2/ -脫氧-β -D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’ -雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2' _脫氧-5-輕基胞苷、2' _脫氧-Ν4-燒基-胞苷、2' _脫氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷類似物；G*是2'脫氧-7-脫氮鳥苷、2'-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2'-脫氧-2'取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、2'-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物，P是核苷之間的連接體，選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選的實施方案中，寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的3’ -端具有二級結構。在一些優選的實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些實施方案中，所述免疫刺激性核酸是長度為約2-約50個核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實施方案中，所述免疫刺激性核酸是長度為約12-約26個核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸形成5’ -端莖環二級結構。 在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸通過與互補序列氫鍵結合的方式在 5’-端具有二級結構。在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸選自SEQ ID NOS :5，6，7，10，15，16 或 17。第三方面，本發明提供了包含至少2個寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中該免疫刺激性核酸有二級結構。在這個方面，該免疫刺激性核酸包含如公式(I)詳細描述的結構結構域A-結構域B-結構域C (I)結構域的長度可為約2-約12個核苷酸。結構域A可以是5’ -3’或3’ -5或 2’ -5’ DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它們具有或不具有回文區域或自我互補區域，該區域包含或不包含至少一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中，C是胞苷或 2’_脫氧胞苷，G是鳥苷或2’脫氧鳥苷,Cf是2' _脫氧胸苷、I-(2' _脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-齒代胞苷、2’_雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脫氧-5-羥基胞苷、2' _脫氧-Ν4-燒基-胞苷、2' _脫氧-4-硫代尿苷,或者其它喃唳核苷類似物；G-是鳥苷或2'脫氧鳥苷、2'脫氧-7-脫氮鳥苷、2'-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2'-脫氧-2'取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、2'-脫氧肌苷或其它嘌呤核苷類似物。在一些實施方案中，結構域A具有一個以上二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, CfpG*或 CpG*。結構域B，如下文圖示的“X”，是一個連接結構域A和結構域C的連接體，其可以是一個3’ -5’連接、2’ -5’連接、3’ -3’連接，可以是磷酸基團、核苷，或者非核苷連接體，所述的非核苷連接體可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、環狀的，手性、非手性的，可以是肽， 碳水化合物、脂類、脂肪酸、單_、三-或六聚乙二醇，或者雜環部分。在一些實施方案中，結構域B優選非核苷酸連接體，其連接結構域A和結構域C的寡核苷酸，它們被稱為“免疫子 (immunomer) ”。結構域C 可以是 5，-3，或 3，-5，、2，_5，DNA,RNA,RNA-DNA,DNA-RNAPoIy I-Poly C，它們具有或不具有回文序列或自我互補序列，該序列具有或不具有二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中C是胞苷或2’ -脫氧胞苷，G是鳥苷或是2’ -脫氧鳥苷，Cf是2'-脫氧胸苷，I-(2'-脫氧_β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤，阿糖胞苷，2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷，2' -O-取代阿糖胞苷，2'-脫氧-5-羥基胞苷，2' _脫氧-Ν4-燒基-胞苷,2' _脫氧-4-硫代尿苷,或者其它喃唳核苷類似物，G* 是2' _脫氧-7-脫氮鳥苷,2' _脫氧-6-硫代鳥苷,阿糖鳥苷,2' _脫氧-2' _取代-阿糖鳥苷，2' -O-取代-阿糖鳥苷，2'-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物，P是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選的實施方案中，免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些優選的實施方案中，結構域C沒有二核苷酸CpG，CfpG,CfpG* 或 CpG*ο在一些實施方案中，公式(I)中所包括的寡核苷酸長度為約2-約50個核苷酸。在一些實施方案中，公式(I)中所包括的寡核苷酸長度為約12-約26個核苷酸。通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如圖17公式(II)詳細描述的結構。該領域的技術人員會識別出，在該分子的3’端有分子內莖環形式的二級結構元件。通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如圖17公式(III)詳細描述的結構。此處由公式(III)描述的結構被稱為“末端二聚體”，因為兩個分子的3’端由于兩個3’端序列互補允許分子間氫鍵結合而封閉。另外，結構域A和A’區可以等同也可以不等同，結構域B和B’區可以等同也可以不等同，結構域C和C’區可以等同也可以不等同。通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如圖17公式(IV)詳細描述的結構。該領域的技術人員會識別出，在所描述的分子的3’端有二級結構，由于其3’端的互補序列通過氫鍵結合在這個區域。在一些實施方案中，本發明的免疫刺激性核酸具有選自SEQ ID N0S:1_38的序列。 在一些實施方案中，本發明的免疫刺激性核酸具有選自SEQ ID NOS 39-68的序列。
第四方面，本發明提供了降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。該方法包括在該寡核苷酸的5’ -端引入包含二級結構的核酸序列。在該方面一些實施方案中，所述的二級結構是莖-環結構。在該方面一些實施方案中，所述的二級結構是通過在所述寡核苷酸序列的5’ -端氫鍵結合互補序列而獲得的。第五方面，本發明提供了提高免疫刺激性寡核苷酸穩定性的方法。該方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’ -端引入含二級結構的核酸序列。在該方面的一些實施方案中， 該二級結構是莖環結構。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是通過在所述寡核苷酸序列的3’ -端氫鍵結合互補序列而獲得的。第六方面，本發明提供了調節免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。該方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’ -端或5’ -端引入含二級結構的核酸序列。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是莖環結構。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是通過在所述寡核苷酸的3’ -端或5’ -端氫鍵結合互補序列而獲得的。第七方面，本發明提供了藥物組合物。這些組合物包括單獨或組合在本發明第一、 二、三、四、五、六方面公開的任何一種組合物，以及可藥用的載體。


圖I中，A是一個示意圖，其顯示在BALB/c小鼠脾細胞培養物中，由寡核苷酸I，2， 和5在濃度為I. O μ g/mL時誘導的細胞增殖；B是一個示意圖，其顯示通過將寡核苷酸I，2， 和5以5mg/kg的劑量向BALB/c小鼠腹膜內給藥誘導的脾腫大。圖2是一個示意圖，其顯示在BALB/c小鼠脾細胞培養物中，與寡核苷酸1_7在濃度為3 μ g/mL溫育24小時后，誘導細胞因子IL-12和IL-6的情況。圖3是一個示意圖，其顯示在BALB/c小鼠脾細胞培養物中，與寡核苷酸8-10在濃度為3 μ g/mL溫育24小時后，誘導細胞因子IL-12和IL-6的情況。圖4顯示，用10 μ g/mL的寡核苷酸1_8在刺激I小時后，J774巨噬細胞中的 NF- K B途徑的激活。M代表用培養基處理的對照，C是用非-CpG寡核苷酸處理的細胞。圖5是一個示意圖，其顯示在J774巨噬細胞培養物中，寡核苷酸1_7在濃度為 10 μ g/mL時，誘導細胞因子IL-12和IL_6。M代表用PBS處理的對照，ND是指沒有檢測到。圖6是一個示意圖，其顯示暴露在濃度為10 μ g/ml的寡核苷酸11，12，14，15和17 之后，漿細胞樣樹突狀細胞中α-干擾素(IFN-α)的誘導。圖7是一個示意圖，其顯示暴露在濃度為10 μ g/ml的寡核苷酸18，19，20和21之后，衆細胞樣樹突狀細胞中α-干擾素(IFN-a)的誘導。圖8是一個示意圖，其顯示暴露在濃度為10 μ g/ml的寡核苷酸41，44和45之后， 漿細胞樣樹突狀細胞中α-干擾素(IFN-a)的誘導。圖9是平行合成本發明的免疫子(immunomer)的合成方案。DMTr = 4,4' 二甲氧
基三苯甲基，CE =氰乙基。圖10描述一組有代表性的，適合線性合成本發明的免疫子的小分子連接體。圖11是線性合成本發明的免疫子的合成方案。DMTr = 4，4' 二甲氧基三苯甲基， CE =氰乙基。圖12描述一組有代表性的，適合平行合成本發明免疫子的小分子連接體。
圖13自我穩定的CpG DNA (A)通過人pDC誘導IFN- α分泌及⑶誘導人B-細胞在培養物中的增殖。(A)pDC從5-8個健康捐獻者的人PBMC中分離，用濃度為10 μ g/mL 的CpG DNA刺激24小時，并通過ELISA檢測上清液的IFN- α分泌。⑶B細胞從4_7個健康捐獻者的人PBMC中分離，用濃度為I μ g/mL的CpG DNA刺激72小時，檢測[3H]-胸苷攝取。符號代表從每個捐獻者獲取的數據，而加號代表兩個圖面中所有捐獻者的平均值。圖14人B細胞增殖對CpG DNA濃度的依賴性。B細胞從4_6個健康捐獻者的人 PBMC中分離，用不同濃度的CpG DNA刺激72小時。數據顯示的是平均值土SD圖15 (A) CpG基序以及二級結構的存在對于通過人pDC誘導IFN- α分泌來說是必需的。顯示的數據是6-8個人捐獻者在CpG DNA濃度為10 μ g/mL的平均值土SD。⑶人 B-細胞增殖需要DNA中有CpG刺激基序的存在而不是二級結構。數據顯示的是5-8個捐獻者在CpG DNA濃度為I μ g/mL的平均值土 SD。圖16發夾二級結構中的2’ -O-甲基核糖核苷酸片段㈧對于通過人pDC分泌 IFN-α的影響和(B)對于人B-細胞增殖的影響。顯示的數據是在pDC培養物中在10 μ g/ mL的CpG DNA濃度6_8個人捐獻者的平均值土SD和在B細胞培養物中在I μ g/mL的CpG DNA濃度5-8個捐獻者的平均值土 SD。
圖17描述免疫刺激性核酸公式(II)、(II)和(IV)的結構。
圖18描述CpG DNA的示意圖、序列、二級結構和Tm。發明詳述本發明提供了包括具有增強或降低的免疫刺激性特性的免疫刺激性寡核苷酸的物質的新型組合物。本發明也提供了得以設計具有增強或降低的免疫刺激性特性的或具有增加的代謝穩定性的免疫刺激性寡核苷酸的方法。發明人令人驚訝地發現在免疫刺激性寡核苷酸的3’ -端或5’ -端引入二級結構可以明顯影響這些寡核苷酸的免疫刺激活性或穩定性。本文所引用的已發布專利、專利申請、參考文獻都被納入本文以同等程度作參考， 如同每一個都被具體地、個別地標明被納入以作參考。如果在本文中引用的任何參考文獻的任何教導與本說明書有矛盾，為了本發明目的，優先適用后者。在第一個方面，本發明提供了免疫刺激性核酸。該免疫刺激性核酸包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列至少包括一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中C是胞苷或2’ -脫氧胞苷,G是鳥苷或2’ -脫氧鳥苷,Cf是2' _脫氧胸苷、I-(2'-脫氧-β -D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2 ’ -雙脫氧-5-鹵代胞苷、2 ’ -雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、 2' _脫氧-5-輕基胞苷、2' _脫氧-Ν4-燒基-胞苷、2' _脫氧-4-硫代尿苷,或者其它喃啶核苷類似物；G*是2'-脫氧-7-脫氮鳥苷、2'-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2'-脫氧-2'取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、2'-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物， P是核苷之間的連接體，選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，而且其中，在所述寡核苷酸序列的3’ -端有二級結構。在一些優選的實施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸不是 CpG。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸的長度為約2-約50個核苷酸。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸的長度為約12-約26個核苷酸。在一些實施方案中，每個寡核苷酸具有約3-約35個核苷殘基，優選約4-約30個核苷殘基，更優選約4-約20個核苷殘基。 在一些實施方案中，所述的寡核苷酸具有約5-約18或約5-約14個核苷殘基。如在這里應用的，術語“約”意味著確切的數字并不重要。因而在所述的寡核苷酸中核苷殘基的數目并不重要，具有I或2個較少的核苷殘基的寡核苷酸或者有一個到幾個額外核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。在一些實施方案中，一個或多個寡核苷酸有11個核苷酸。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸在3’ -末端有莖環二級結構。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸通過與互補序列氫鍵結合的方式在3’ -端具有二級結構。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸選自 SEQ ID NOS 2, 3,4,9,12,13,14,18,19, 20, 21, 24, 25, 26, 27，28，29，30，32，33，34，35，36，37 或 38。為了本發明的目的，術語“寡核苷酸”是指由大量的連接的核苷單位組成的多聚核苷。這樣的寡核苷酸可以從現有的核酸來源獲得，包括基因組核酸或cDNA，但是優選通過合成方法產生。在優選的實施方案中，每個核苷單位包括雜環堿基和呋喃戊糖基 (pentofuranosyl) ,2，-脫氧呋喃戍糖基(2’_deoxypentfuranosyl)，海藻糖(trehalose)， 阿拉伯糖(arabinose) ,2’ -脫氧 _2，_ 取代阿拉伯糖(2，-deoxy-2’ -substituted arabinose), 2’ -O-取代阿拉伯糖(2，-O-substituted arabinose)或己糖基團(hexose sugar group)。核苷殘基可通過大量已知的核苷之間的連接中的任一種彼此偶聯。這樣的核苷間連接包括，但不限于磷酸二酯(phosphodiester),硫代磷酸酯(phosphorothioate), 二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)，燒基膦酸酯(alkyIphosphonate)，燒基硫代憐酸酯(alkyIphosphonothioate)，憐酸三酯(phosphotriester)，氨基憐酸酯 (phosphoramidate)，娃氧燒(siIoxane)，碳酸酯(carbonate)，燒氧羰基(carboalkoxy)， 乙酰胺化物(acetamidate),氨基甲酸酯(carbamate),嗎啉代(morpholino),硼燒 (borano),硫醚(thioether)，橋連氨基磷酸酯(bridged phosphoramidate)，橋連亞甲基膦酸酯(bridged methylene phosphonate),橋連硫代憐酸酯(bridged phosphorothioate) 和砜(sulfone)核苷間連接。術語“寡核苷酸”也包括具有一個或多個立體特異性的核苷間連接的多聚核苷(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯，烷基膦酸酯或磷酸三酯連接)。如本文應用的，術語“寡核苷酸”和“二核苷酸”明顯地旨在包括具有任意上述核苷間連接的多聚核苷和二核苷，而不管該連接是否包含磷酸基團。在一些優選實施方案中，這些核苷間連接可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯連接，或其組合。術語“寡核苷酸”也包括含有額外的取代基的多聚核苷，所述的取代基包括，但不限于，蛋白基團，親脂基團，嵌入劑，二元胺(diamine)，葉酸，膽固醇和金剛烷。術語“寡核苷酸”也包括任何其它含有聚合物的核苷酸堿基，所述的聚合物包括，但不限于，肽核酸 (PNA)，具有磷酸基團的肽核酸(PHONA)，封閉的核酸(LNA)，嗎啉代-骨架寡核苷酸和具有帶烷基連接體或氨基連接體的骨架部分的寡核苷酸。本發明的寡核苷酸可以包括天然存在的核苷，經修飾的核苷或其混合物。如本文所應用的，術語“經修飾的核苷”是指包括經修飾的雜環堿基，經修飾的糖基部分，或其組合的核苷。在一些實施方案中，經修飾的核苷是如本文所描述的非-天然的嘧啶或嘌呤核苷。 在一些實施方案中，經修飾的核苷是2,-取代核糖核苷，阿拉伯糖核苷或2’-脫氧-2’-取代阿拉伯糖苷。
為了本發明目的，術語“2'-取代核糖核苷”或“2’ -取代阿拉伯糖苷”包括核糖核苷或者阿拉伯糖核苷，其中在該戊糖部分的2'位置的羥基被取代而產生2'-取代或 2' -O-取代核糖核苷。優選地，這樣的取代是以含有1-6個飽和的或不飽和的碳原子的低級烷基，或者以具有6-10個碳原子的芳基取代，其中，所述的烷基或芳基可以是未取代的也可以是取代的，例如以齒基(halo),輕基,三氟甲基(trif Iuoromethyl),氰基(cyano), 硝基(nitro),酰基(acyl),酰氧基(acyloxy),燒氧基(alkoxy),羧基(carboxyl),燒氧羰基(carboalkoxy)或氨基取代。2' _0_取代核糖核苷或2' _0_取代-阿拉伯糖苷的實例包括，但不限于2' -O-甲基核糖核苷，2' -O-甲基阿拉伯糖苷，和2' -O-甲氧基乙氧基核糖核苷(2' -0-methoxyethoxyribonucIeoside)或2' -O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷( 2’ -O-methoxyethoxyarabinoside)。術語“2'-取代核糖核苷”或“2'-取代阿拉伯糖苷”也包括其中2'-羥基被含有1-6個飽和或不飽和碳原子的低級烷基所取代或被氨基或齒素基團取代的核糖核苷或阿拉伯糖苷。所述的2'-取代核糖核苷或2'-取代阿拉伯糖苷的實例包括，但不限于， 2’ -氛基，2’ -氣(2，-f Iuoro), 2’ -稀丙基(2，-allyl)和 2’ -塊丙基(2，-propargyl) 核糖核苷或阿拉伯糖苷。術語“寡核苷酸”包括雜合(hybrid)寡核苷酸和嵌合(chimeric)寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”是具有一個以上類型的核苷間連接的寡核苷酸。所述的嵌合寡核苷酸的一個優選實例是包含硫代磷酸酯，磷酸二酯或二硫代磷酸酯區域和非-離子鍵例如烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯連接的嵌合寡核苷酸(參見，例如Pederson等.U. S.專利No. 5，635，377 和 5，366，878)。“雜合寡核苷酸”是具有一個以上類型核苷的寡核苷酸。所述的雜合寡核苷酸的一個優選實例是包含核糖核苷酸或2'取代核糖核苷酸區域，和脫氧核糖核苷酸區域(參見， 例如 Metelev 和 Agrawal，美國專利 No. 5，652，355，6，346，614 和 6，143，881)。如本文應用的，所述的術語“二級結構”是指分子內和分子間的氫鍵結合。分子內氫鍵結合導致莖-環結構的形成，分子間氫鍵結合導致雙鏈體核酸分子的形成。如本文應用的，所述的術語“大約”意味著精確的數字并不重要。因此，寡核苷酸中的核苷殘基數不重要，為了本發明之目的，具有一個或兩個較少的核苷殘基，或一個到幾個附加的核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。如本文應用的，所述的術語“互補”是指具有與核酸雜交的能力。所述的雜交通常是在互補鏈之間經氫鍵結合的結果，優選形成Watson-Crick或Hoogsteen堿基對,盡管氫鍵的其它模式以及堿基堆積也能導致雜交。第二方面，本發明提供了具有降低的免疫刺激活性的核酸。在該方面所述的核酸包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列至少含有一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG, C*pG, C*pG*或CpG%其中C是胞苷或2’ -脫氧胞苷，G是鳥苷或2’ -脫氧鳥苷，C*是2'-脫氧胸苷、I- (2'-脫氧-β -D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’ -雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脫氧-5-羥基胞苷、2' _脫氧-Ν4-燒基-胞苷、2' _脫氧-4-硫代尿苷,或者其它喃唳核苷類似物,G* 是2' _脫氧-7-脫氮鳥苷、2' _脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2' _脫氧-2'取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、2'-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物，P是核苷之間的連接體，選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。其中寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的5’ -端具有二級結構。在一些優選實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸是長度為約2-約50個核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸是長度為約12-約26個核苷酸的寡核苷酸序列。 在一些實施方案中，每個寡核苷酸具有約3-約35個核苷殘基,優選約4-約30個核苷殘基， 更優選約4-約20個核苷殘基。在一些實施方案中，寡核苷酸具有約5-約18,或約5-約 14個核苷殘基。如本文應用的，術語“約”意味著精確的數字并不重要。因此，寡核苷酸中核苷殘基數目不重要，并且具有一個或兩個更少的核苷殘基，或一個到幾個附加核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。在一些實施方案中，I個或多個寡核苷酸有11個核苷酸。在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸形成5’ -端莖環二級結構。 在一些實施方案中，所述具有降低的免疫刺激活性的核酸在5’ -端通過與互補序列氫鍵結合具有二級結構。在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸選自SEQ ID NOS 5,6,7,10，15，16 和 17。第三方面，本發明提供了包含至少2個寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中該免疫刺激性核酸具有二級結構。在該方面，該免疫刺激性核酸包含一個如公式(I)詳細描述的結構。結構域A-結構域B-結構域C (I)結構域的長度可為約2-約12個核苷酸。結構域A可以是5’ -3’或3’ -5’或 2’ -5’ DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它們具有或不具有回文區域或自我互補區域，該區域包含或不包含至少一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中C是胞苷或 2’_脫氧胞苷，G是鳥苷或2’脫氧鳥苷,Cf是2' _脫氧胸苷、I-(2' _脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’ -雙脫氧-5-齒代胞苷、2’ -雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脫氧-5-羥基胞苷、2' _脫氧-Ν4-燒基-胞苷、2' _脫氧-4-硫代尿苷,或者其它喃唳核苷類似物； G*-是2 ' _脫氧-7-脫氮鳥苷、2 ' _脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2' _脫氧-2'-取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、2'-脫氧肌苷或其它嘌呤核苷類似物。P是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些實施方案中，結構域A將具有一個以上二核苷酸,該二核苷酸選自CpG, CfpG，C*pG* 或 CpG'結構域B，即下文圖示的“X”，是連接結構域A和結構域C的連接體，其可以是 3’ -5’連接、2’ -5’連接、3’ -3’連接，可以是磷酸基團、核苷，或者非核苷連接體，所述的連接體可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、環狀的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂類、脂肪酸、單_、三-或六聚乙二醇，或者雜環部分。結構域C 可以是 5’ -3’ 或 3’ -5’、2’ -5’ DNA、RNA、RNA_DNA、DNA-RNAPoly I-Poly C，它們具有或是不具有一個回文序列或自我互補序列，該序列可具有或不具有二核苷酸， 該二核苷酸選自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中C是胞苷或2’ -脫氧胞苷，G是鳥苷或是 2’_脫氧鳥苷，Cf是2 ' _脫氧胸苷，I-(2' _脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤，2’-雙脫氧-5-齒代胞苷，2’-雙脫氧-5-齒代胞苷，阿糖胞苷,2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷，2' -O-取代阿糖胞苷，2'-脫氧-5-羥基胞苷，2'-脫氧-N4-烷基-胞苷，2' _脫氧-4-硫代尿苷,其它喃唳核苷類似物，G*是2' _脫氧-7-脫氮鳥苷, 2，-脫氧-6-硫代鳥苷，阿糖鳥苷，2'-脫氧-2'-取代-阿糖鳥苷，2' -O-取代-阿糖鳥苷，2'-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物，P是核苷之間的連接體，選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些優選的實施方案中，結構域B優選是連接結構域A和結構域C的寡核苷酸的非-核苷連接體，其被稱為“免疫子”。在一些優選實施方案中，結構域C不具有二核苷酸CpG，C*pG, C*pG* 或 CpG'在一些實施方案中，公式(I)中含有的寡核苷酸的長度是約2-約50個核苷酸。在一些實施方案中，公式(I)中含有的寡核苷酸的長度是約12-約26個核苷酸。在一些實施方案中，每個寡核苷酸具有約3-約35個核苷殘基,優選約4-約30個核苷殘基,更優選約 4-約20個核苷殘基。在一些實施方案中，寡核苷酸具有約5-約18,或約5-約14個核苷殘基。本文所述的術語“約”意味著精確的數字不是重要的。因此，寡核苷酸中核苷殘基數目不是重要的，并且具有一個或兩個更少的核苷殘基，或具有一個到幾個附加核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。在一些實施方案中，一個或多個寡核苷酸有11個核苷酸。通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如圖17公式(II)詳細描述的結構。該領域的技術人員識別出，在該分子的3’端有分子內莖環形式的二級結構元件。通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如圖17公式(III)詳細描述的結構。此處由公式(III)描述的結構被稱為“末端二聚體”，因為兩個分子的3’端由于兩 3’端序列互補允許分子間氫鍵結合而封閉。另外，結構域A和A’區可以相同也可以不相同，結構域B和B’區可以相同也可以不相同，結構域C和C’區可以相同也可以不相同。通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如圖17公式(IV)詳細描述的結構。該領域的技術人員會識別出，在所描述的分子的3’端有二級結構，由于其3’端的互補序列通過氫鍵結合在這個區域。在一些實施方案中，分子例如配體結合在3’ -端以利于細胞的攝取或改善分子的穩定性。本發明的一些核酸的非限制性的實例列于表I中。表I
權利要求
1.一種免疫刺激性核酸，其包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸至少包含一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中，C是胞苷或2’ -脫氧胞苷，G是鳥苷或2’ -脫氧鳥苷，Cf是2'-脫氧胸苷、I- (2'-脫氧-β -D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’雙脫氧-5-齒代胞苷、2’雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2' _脫氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脫氧-5-羥基胞苷、2'-脫氧-Ν4-烷基-胞苷、 2'-脫氧-4-硫代尿苷，或其它非天然嘧啶核苷，G*是2'脫氧-7-脫氮-鳥苷、2'-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2'-脫氧-2'取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、 2，-脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，P是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中所述的寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的3’ -末端有二級結構。
2.權利要求I的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的長度為約12到約50個核苷酸。
3.權利要求I的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的長度為約12到約26個核苷酸。
4.權利要求I的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列形成了3’ -端莖環二級結構。
5.權利要求I的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列在3’-端具有回文或互補序列。
6.權利要求I的免疫刺激性核酸選自SEQID NOS :2，3，4，9，12，13，14，18，19，20，21， 24，25，26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37 或 38。
7.一種免疫刺激性核酸，其具有降低的免疫刺激活性，包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列包含至少一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中，C是胞苷或 2’_脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷,Cf是2' _脫氧胸苷、I-(2' _脫氧-β-D-呋喃核糖基)~2~氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-齒代胞苷、2’_雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脫氧-5-羥基胞苷、2' _脫氧-Ν4-燒基-胞苷、2' _脫氧-4-硫代尿苷,或者其它非天然喃唳核苷,G* 是2' _脫氧-7-脫氮鳥苷、2' _脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2' _脫氧-2'取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、2'-脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，P是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中，所述的寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的5’ -端有二級結構。
8.權利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的長度為約12到約50個核苷酸。
9.權利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的長度為約12到約26個核苷酸。
10.權利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列形成5’-端的莖環二級結構。
11.權利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列在5’-端具有回文或互補序列。
12.權利要求7的免疫刺激性核酸選自SEQID NOS -.5,6,7,10，15，16或17。
13.一種降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法，該寡核苷酸具有至少一個選自 CpG, C*pG, C*pG*或CpG*的二核苷酸，其中，C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，Cf是2'-脫氧胸苷、I-(2'-脫氧_β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-齒代胞苷、2’ -雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2' _脫氧-2' _取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脫氧-5-羥基胞苷、2'-脫氧-Ν4-烷基-胞苷、 2，-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2'-脫氧-7-脫氮鳥苷、2'-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2'-脫氧-2'取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、 2，-脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，P是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，該方法包括在寡核苷酸的5’ -端引入含二級結構的核酸序列。
14.權利要求13的方法，其中二級結構是莖環結構。
15.權利要求13的方法，其中二級結構是氫鍵結合至回文序列或互補序列。
16.—種包含權利要求I的免疫刺激性核酸和一種可藥用的載體的藥物組合物。
17.—種包含權利要求7的免疫刺激性核酸和一種可藥用的載體的藥物組合物。
18.—種包含至少兩個寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中該免疫刺激性核酸具有二級結構，而且該免疫刺激性核酸包含常規結構結構域A-結構域B-結構域C (I)其中結構域A可以是5’ -3’或3’ -5’或2’ -5’ DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它們具有或不具有回文或自我互補結構域，該結構域包含或不包含至少一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中，C是胞苷或2’ -脫氧胞苷，G是鳥苷或2’ -脫氧鳥苷， Cf是2'-脫氧胸苷、1_(2'-脫氧_β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-齒代胞苷、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2' _脫氧-2' _取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脫氧-5-羥基胞苷、2'-脫氧-Ν4-烷基-胞苷、 2，-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2'-脫氧-7-脫氮鳥苷、2'-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2'-脫氧-2'-取代-阿糖鳥苷、2' -O-取代-阿糖鳥苷、 2/ -脫氧肌苷或其它非天然嘌呤核苷，而且P是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，結構域B是連接結構域A和C的連接體，可以是3’ -5’連接、 2’ -5’連接、3’ -3’連接、磷酸基團、核苷，或者非核苷連接體，所述的非核苷連接體可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、環狀的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂類、脂肪酸、單_、三_、六聚乙二醇，或者雜環部分，并且結構域C可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、 RNA> RNA-DNA, DNA-RNA Poly I-Poly C,它們具有或不具有回文序列或自我互補序列，該序列可以有或沒有二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中，C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或是2’-脫氧鳥苷，Cf是2'-脫氧胸苷，1_(2'-脫氧_β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤，2’ -雙脫氧-5-齒代胞苷，2’ -雙脫氧-5-硝基胞苷，阿糖胞苷，2'-脫氧-2'-取代阿糖胞苷，2' -O-取代阿糖胞苷，2'-脫氧-5-羥基胞苷，2'-脫氧-Ν4-烷基-胞苷，2'-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G* 是2' _脫氧-7-脫氮鳥苷,2' _脫氧-6-硫代鳥苷,阿糖鳥苷,2' _脫氧-2' _取代-阿糖鳥苷，2' -O-取代-阿糖鳥苷，2'-脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，P是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯或硫代磷酸酯。
19.權利要求18的免疫刺激性核酸，其具有選自SEQID NOS :1_38的序列。
20.權利要求18的免疫刺激性核酸，其具有選自SEQID NOS 39-68的序列。
全文摘要
本發明涉及穩定的免疫調節寡核苷酸。本發明提供了免疫刺激性核苷酸，其含有至少一個CpG二核苷酸和一個在5’-或3’-端的二級結構。這些寡核苷酸具有降低或增強免疫刺激性的特性。本發明確定了5’-端二級結構比3’-端二級結構更顯著地影響免疫刺激活性。本發明也提供了增高或降低含有CpG的核酸的免疫刺激活性的方法。
文檔編號A01N43/04GK102604957SQ20121001522
公開日2012年7月25日 申請日期2004年6月10日 優先權日2003年6月11日
發明者埃坎巴.R.坎迪馬拉, 拉克什米.巴加特, 薩德希爾.阿格拉沃爾, 郁東, 雷詹德拉.K.潘德伊 申請人:艾德拉藥物股份有限公司