專利名稱：干擾ev71病毒的新靶點及其小干擾rna和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于EV71病毒復制抑制技術領域，涉及干擾EV71病毒的新靶點及其小干擾RNA和應用。
背景技術：
腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬成員，其感染性強，致病性高，已經在世界范圍內有過十幾次大的爆發和流行，且引起越來越嚴重的中樞神經系統癥狀，嚴重危害嬰幼兒的生命健康，被喻為21世紀的脊髓灰質炎。目前臨床缺乏抑制病毒的特異性藥物，尋求新的藥物治療手段已成為世界范圍內關注的熱點。病毒為嚴格活細胞內寄生的微生物，故抗病毒藥物必須進入細胞，并能選擇性作用于病毒，但實際上，病毒的復制過程與宿主細胞的生物合成過程相似，兩者難以區分，故很難獲得能殺死或抑制病毒而又不影響細胞的藥物。·RNA干擾技術的出現對選擇毒性提出了可能，為抗病毒研究提供了新思路。RNA干擾是RNA序列特異性轉錄后基因沉默現象。由小干擾RNA(small interfering RNA, si RNA)的反義鏈指導形成的RNA介導的沉默復合物在siRNA引導下與互補的mRNA結合，降解靶基因mRNA，有效特異性的抑制靶基因的表達。與以往抗病毒治療的手段相比，RNA干擾技術具有顯著的優勢RNA干擾介導的抗病毒效應具有高度的特異性，對非同源基因表達幾乎沒有影響，因此可將不良反應降到最小；RNA干擾能高效抑制病毒復制，少量的siRNA就可達到降低病毒表達產物的作用；RNA干擾可以針對病毒基因組保守區域發揮作用，從而在一定程度上限制了病毒產生逃避突變株的能力。因此，RNA干擾所具有的對靶基因沉默作用特異性、高效性、穩定性以及不改變宿主基因組等特性，為RNA干擾在抗病毒治療中的應用提供了可能，并決定了其用于治療疾病時可以出現藥效強、不良反應小的特性。設計合成靶向EV71病毒基因組的siRNAs將可能成為抑制EV71病毒感染的有效途徑。EV71病毒基因組是由約7408個核苷酸組成的單股正鏈RNA，基因組RNA也是翻譯前蛋白的mRNA模板，因此特別適合RNA干擾的治療。選擇合適的siRNA靶點是抗病毒治療關鍵一步。在RNA干擾治療EV71病毒的國內外研究中，幾個實驗室使用RNA干擾有效地阻止了病毒的復制，報道了 EV71病毒基因組中VP1、3D、3C、2C、3’ -非翻譯區的有效靶序列。

發明內容
本發明解決的問題在于提供干擾EV71病毒的新靶點及其小干擾RNA和應用，在EV71病毒基因組保守的5’-非翻譯區尋找出新的靶點，并針對該靶點設計小干擾RNA，可應用于EV71病毒復制的抑制。本發明是通過以下技術方案來實現用于干擾EV71病毒復制的靶點，包括下列區域EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的第115 133nt的區域；EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的第648 666nt的區域。
所述的用于干擾EV71病毒復制的靶點，其特征在于，所述的第115 133nt的核苷酸序列為cagcaaacca cgatcaata ;所述的第648 666nt的核苷酸序列為cagagcaattgtttaccta。所述的用于干擾EV71病毒復制的靶點作為設計小干擾RNA所針對的靶點的應用。所述小干擾RNA用于抑制EV71病毒復制，包括針對兩個區域其中之一小干擾RNA或者為兩者的混合。一種干擾EV71病毒復制的小干擾RNA，包括正義鏈和反義鏈，其正義鏈序列為cagcaaacca cgaucaauat t,反義鏈序列為uauugaucgu gguuugcugt t ；或者其正義鏈序列為cagagcaauu guuuaccuat t,反義鏈序列為uagguaaacaauugcucugt t。所述的干擾EV71病毒復制的小干擾RNA對抑制EV71病毒復制的應用。 所述的干擾EV71病毒復制的小干擾RNA在制備抑制EV71病毒復制的藥物的制備的應用。所述的干擾EV71病毒復制的小干擾RNA是在經過修飾或結合于轉運載體之后應用于抑制EV71病毒復制的藥物的制備，所述的修飾包括核糖修飾、磷酸骨架修飾、堿基修飾；所述的轉運載體包括細胞穿透性多肽、細胞靶向性配體、納米顆粒。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的用于干擾EV71病毒復制的靶點，是EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的兩個新的有效靶點，由于5’ -非翻譯區在病毒復制中的重要性和其高度保守的特性，使其可能具有更廣譜及有效的抗病毒作用，而且5’ -非翻譯區靶點的提供及針對其設計的小干擾RNA，使得與針對基因組編碼區設計的其他有效siRNAs聯合應用抑制可能存在的病毒新的突變株或多株EV71成為可能。進一步，本發明針對兩個新的靶點分別提供了小干擾RNA，轉染到EV71敏感的RD細胞后，接種EV71病毒，于感染后不同時間點倒置顯微鏡觀察細胞病變，結果表明兩對靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的siRNAs能夠延緩及減輕EV71病毒感染致細胞病變效應(Cytopathic effect, CPE)。同時這兩對小干擾RNA能夠顯著降低感染細胞EV71 mRNA的轉錄水平，能夠顯著降低感染細胞釋放子代病毒。另外，隨著siRNA轉染濃度的增加，抑制EV71病毒感染和復制作用逐漸增強。針對所提供的新的靶點設計的siRNAs能夠抑制EV71病毒的復制，既表明了所篩選的靶點的有效性又表明了所設計的siRNAs具有針對病毒基因組的分子治療的前景，而且所設計的小干擾RNA具有高效、特異、低毒及具有量效關系的特性，從而可應用于抑制病毒復制的藥物的制備。當然也不排除針對所提供的靶點進行RNA干擾，設計出其他形式的siRNA或shRNA等對抑制病毒所具有的效果。


圖I是熒光及流式細胞儀檢測不同濃度的siRNA的轉染。圖2是siRNA對培養細胞的毒性分析圖。圖3是siRNA對EV71病毒感染致CPE的抑制作用。
圖4是siRNA對感染細胞EV71 mRNA的轉錄水平影響。圖5-1是siRNA對EV71感染細胞上清空斑形成的影響；圖5-2是不同濃度siRNA對EV71感染細胞上清病毒滴度的影響。
具體實施例方式下面結合具體的實施方式對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I、細胞培養和病毒株來源人橫紋肌肉瘤細胞(Rhabdomyosarcoma，RD)為EV71敏感的宿主細胞，由西安市疾病控制中心惠贈，常規生長在含10%胎牛血清(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)的DMEM 培養基中。EV71病毒株來自臨床分離樣本(GenBank accession No. HM003207. I),由西安市疾病控制中心惠贈，病毒在RD細胞上增殖，-80°C保存。2、靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的siRNA序列的設計選擇合適的siRNA靶點是抗病毒治療關鍵一步。EV71病毒基因組中5’ -非翻譯區含有約742個核苷酸(其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示)，它通常折疊成多個特異性的空間結構，這些結構通過與宿主細胞蛋白因子的結合在起始病毒基因組mRNA的合成以及病毒蛋白翻譯過程中發揮重要作用。此外，5’ -非翻譯區還涉及病毒基因的宿主范圍以及毒力等多個方面的功能。尤其重要的是，5’ -非翻譯區在不同的EV71病毒株中高度保守。鑒于5’ -非翻譯區的保守性及在病毒復制中的重要作用，針對5’ -非翻譯區的siRNAs可能具有更廣譜及有效的抗病毒作用，故以5’ -非翻譯區作為靶點的篩選區域。另外，EV71病毒感染周期短，RNA干擾不必要長期發生作用，以免發生非特異性不利影響，化學合成的siRNA用于抑制EV71病毒復制是一個很好的策略，且siRNA簡單，適合進一步化學修飾應用于體內。靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的siRNA序列設計綜合考慮RNA靶點可行性、雙鏈siRNA熱力學特性、siRNA設計原則等，應用siRNA設計軟件及二級結構預測軟件(http://sfold. wadsworth. org/cgi-bin/sirna.pi and http://www. genebee. msu.su/services/na2_reduced. html),同時考慮針對 HM003207. I 設計的 siRNA 與 GenBank 數據庫中近5年來發布的具有全基因序列的中國流行的EV71病毒株對應序列的核苷酸同源性，應用DNAStar program進行比對,篩選出EV71基因組5’ -非翻譯區的兩個祀點區域EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的第115 133nt的區域；EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的第648 666nt的區域。并分別針對這兩個區域合成兩對siRNA (siRNA-U siRNA_2)，其中siRNA_l針對第115 133nt的區域,其雙鏈序列如下正義鏈序列為 :cagcaaacca cgaucaauat t，反義鏈序列為uauugaucgugguuugcugt t ;siRNA_2 針對第 648 666nt 的區域，其雙鏈序列如下正義鏈序列為cagagcaauu guuuaccuat t,反義鏈序列為 uagguaaaca auugcucugt t ；
將siRNA-2序列打亂,設計scrambled-siRNA(scr)作為陰性對照。同時將siRNA_2進行FAM標記(si-2FAM)了解轉染情況,優化轉染條件。所有siRNAs均用BLAST (www. ncbi.nlm. nih. gov/BLAST)確認其特異性，排除與人及鼠基因的同源性。上述所有的siRNAs均按序列合成，具體委托上海吉瑪制藥技術有限公司合成。3、SiRNA轉染RD細胞條件的優化利用熒光檢測及流式細胞儀分析技術，以帶有FAM標記的si_2FAM來了解轉染情況，優化轉染條件，測定轉染效率。RD細胞以細胞數為3. 2 X IO5/孔接種于6孔板，24小時后待細胞生長達70 80%時進行 siRNA 的轉染。將不同濃度(25、50、100nM)的 si_2FAM 和 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)轉染 RD 細胞，具體操作按 Lipofectamine 2000 使用說明書進行。另外設僅用si-2FAM處理，未加入Lipofectamine 2000的RD細胞作為對照。 在siRNA轉染后5h，換2%胎牛血清的DMEM培養基，轉染后6h細胞用PBS洗兩次，熒光顯微鏡觀察si-2FAM的位置及濃度不同所引起的熒光變化。熒光觀察完成后，用0. 25%胰酶消化RD細胞，制備單細胞懸液，0. 5ml固定液固定后流式細胞儀檢測熒光標記細胞的比例以精確測定轉染效率。結果表明，轉染后6h，FAM標記的si_2FAM在RD細胞漿中可見，隨著si_2FAM濃度的增加，si-2FAM在RD細胞中的量相應增加；而未加入Lipofectamine 2000，僅用si_2FAM處理的對照組未觀察到熒光(熒光觀察結果如圖I中的A部分所示)。這表明在無轉染試劑的存在下siRNA不能單獨轉染到RD細胞中，siRNA成功轉染到RD細胞需要轉染試劑的參與。流式細胞儀檢測結果如圖I中的B部分所示，RD細胞轉染25nM、50nM、IOOnM的si-2FAM,轉染效率分別為 79. 47±1. 79%,87. 73±2. 67%,97. 17±0. 86%。故選擇 50nM 和IOOnM siRNA 用于 RNA 干擾。4、siRNA對培養細胞的毒性RD細胞以細胞數為I. 6 X IO4/孔接種于96孔板，24h后待細胞生長達70 80%時轉染IOOnM濃度的siRNA-1、siRNA-2，轉染后24h、48h、72h顯微鏡下觀察RD細胞的形態學變化，然后每孔加入 MTT 溶液(5mg/ml; Sigma, St. Louis, Mo, USA) 20ul, 37°C孵育 4h 后,小心吸棄孔內上清，每孔加入150ulDMS0，振蕩lOmin，選擇570nm波長檢測吸光值。MTT法檢測吸光值，結果如圖2所示，在不同的時間點(24h、48h、72h)，兩對靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的siRNAs轉染組MTT檢測獲得的吸光值均與未轉染siRNA的對照組(mock)沒有明顯差別，表明siRNA轉染組的活細胞數與未轉染siRNA的mock組沒有明顯差別，即高劑量的siRNA未影響細胞的生長及生存，對培養細胞無明顯毒性。5、SiRNA轉染和病毒感染RD細胞于37°C，5%C02培養箱中培養至80%_90%，胰酶消化后加含10%胎牛血清、無抗生素的DMEM培養基，以細胞數為8 X IO4/孔接種于24孔板，24小時后待細胞生長達70 80%時進行轉染。轉染前將培養基換為500ml Opti-MElVf' (Gibco BRL, Grand Island, NY，USA)，然后不同量的siRNA (30pmol、60pmol)分別稀釋于50ul的Opti-IVIEIVTv，在另一只試管中Iul的Lipofectamine 2000也稀釋于50ul的Opti-MEMK'中，室溫下孵育5分鐘后，將兩種溶液輕輕混合，室溫下孵育20分鐘,使siRNA:LipofectamineTM2000復合物形成,后每孔加IOOul的混合物，通過輕柔前后搖晃培養板混和搖均，使最終siRNA的濃度為50nM或lOOnM。scr 組轉染 scrambled-siRNA。mock 組除未加 siRNA,—切同前。轉染后5h，每孔接種EV71病毒稀釋液(MOI=O. 01)，吸附I小時后棄病毒稀釋液，加入500ul含2%胎牛血清的DMEM培養基，置于培養箱中，于感染后不同時間點連續觀察細胞病變，注意有無胞體圓縮、折光特性改變、間隙明顯、聚集、脫落等病毒感染特征。收集細胞裂解物及上清，-80°C保存備檢。感染后24小時，未轉染SiRNA的mock組細胞及scr轉染組細胞出現CPE，表現為細胞圓縮、折光度增強；siRNA-l、siRNA-2轉染組細胞未出現CPE。感染后36小時，50nM濃度的siRNA-1轉染組細胞表現出輕微的CPE。感染后48小時的觀察結果如圖3所示，IOOnM的siRNA-1、siRNA-2轉染組細胞表現出減輕或輕微的CPE，而mock組細胞及scr轉染組細胞出現完全的CPE，表現為細胞圓縮、折光度增強、間隙明顯、聚集、脫落。siRNA-1能夠延緩EV71病毒感染致CPE至感染后36小時。siRNA_2能夠延緩EV71·病毒感染致CPE至感染后48小時。兩對靶向EV71病毒基因組5’-非翻譯區的siRNAs作用持續時間均達感染后72小時。siRNA-2對EV71病毒感染致CPE的抑制作用強于siRNA-1。另外，隨著siRNA轉染濃度的增加，EV71病毒感染致CPE明顯減輕。兩對靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的siRNA能夠延緩及減輕EV71病毒感染致CPE。6、siRNA對感染細胞EV71mRNA的轉錄水平影響6. IRNA的提取及定量EV71感染后36h，24孔板中各組細胞用PBS洗后，每孔加入150ulCelLytic MCell Lysis Reagent (Sigma, St. Louis, Mo, USA),收集樣本后米用Ql Aamplv Viral RNAMini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)提取病毒 RNA。具體操作如下a、吸取 560ul 含有carrier RNA的buffer AVL至1.5ml離心管中；b、將離心后樣本加入至裝有bufferAVL-carrier RNA的離心管中，充分混勻，室溫(15°C _25°C)放置lOmin，后瞬時離心；c、樣本中加入560ul無水乙醇，充分混勻，后瞬時離心；d、吸取630ul上步中的液體小心的加入到column (已放入2ml收集管中),蓋上蓋子，8000rpm離心lmin,將column放入新的2ml收集管中，棄去舊的收集管；e、小心打開column的蓋子,重復第6步；f、小心打開column的蓋子，加入500ul buffer AWl,蓋上蓋子,8000rpm離心lmin,將column放入新的2ml收集管中，棄去舊的收集管；g、小心打開column的蓋子,加入500ul buffer AW2,蓋上蓋子，14000rpm離心3min ;h、將column放入新的2ml收集管中，棄去舊的收集管，14000rpm離心lmin ;i、將column放入I. 5ml離心管中，棄去舊的收集管,小心的打開column,加入60ul室溫的buffer AVE,蓋上蓋子，室溫放置lmin，8000rpm離心lmin洗脫病毒RNA。RNA定量時將提取的RNA用DEPC處理水進行稀釋，紫外分光光度儀測定0D260、0D280值，計算RNA濃度。6. 2逆轉錄、PCR擴增米用腸道病毒71型核酸擴增檢測試劑盒(Suoao BiomedtechCo. Ltd. , Beijing, China)進行逆轉錄及 PCR 擴增。試劑盒中包含
上游引物5'-GCAGCCCAAAAGAACTTCACT-3' (2366-2386)下游引物5'-ATCTGCCACCCTATCTCCCT-3' (2436-2455)及TaqMan probe 5 ' -FAM-TGCAAGGATGCTAGTGATATCCTGC-TAMRA-3，(2396-2420)。根據說明書，向反應管中每管加入7ul EV71-RT MIX、2ul RNA、lul逆轉錄酶，IOOOOrpm瞬時離心30秒，將各反應管放入PCR儀器的反應槽中，在PCR儀上進行以下逆轉錄操作42°C 30min,后98°C 5min滅活逆轉錄酶。接下來進行PCR擴增。向反應管中每管加入20ul EV71-PCR MIX、2ul Taq酶系、3ul處理后樣本或10倍系列稀釋EV71-陽性定量標準品，IOOOOrpm瞬時離心30秒，將各反應管放入PCR儀器的反應槽中，循環條件94°C 2min,后93°C 30s, 55°C 45s, 40個循環。利用10倍系列稀釋EV71-陽性定量標準品建立的標準曲線定量EV71 RNA。50nM、IOOnM濃度的siRNA-1轉染組與未轉染siRNA的mock組相比，感染細胞EV71 RNA 水平為 29. 72±1. 72%、17. 64±2. 03% (圖 4)。50nM、IOOnM 濃度的 siRNA-2 轉染組與mock 組相比，感染細胞 EV71 RNA 水平僅為 16. 84±2. 30%、6. 80± I. 04% (圖 4)。siRNA-2抑制感染細胞EV71 RNA的作用優于siRNA-1 (圖4)。隨著siRNA轉染濃度的增加，感染細胞EV71RNA水平明顯下降(#p〈0. 05)(圖4)。兩對靶向EV71病毒基因組5’-非翻譯區的siRNA能夠顯著降低感染細胞EV71 mRNA的轉錄水平(± p<0. 05)(圖4)。7、空斑形成實驗
為了解SiRNA介導的細胞內抑制EV71病毒的復制是否影響子代病毒的釋放，病毒感染48小時后收集各組細胞上清，稀釋至10_4進行空斑形成實驗，測定病毒滴度。RD細胞在6孔板中生長成單層，每孔加入500ul稀釋至10_4的各組細胞上清，吸附I小時后棄孔內稀釋液，每孔加入3ml含1%甲基纖維素的DMEM維持液，37°C培養3天后小心吸棄孔內液體，福爾馬林固定后，1%結晶紫溶液染色，計數空斑。siRNA-l、siRNA_2轉染組與未轉染SiRNA的mock組相比，能夠明顯減少空斑形成，而且siRNA-2作用優于siRNA-1，結果如圖5_1所示。隨著siRNA轉染濃度的增加，病毒滴度降低(#P〈0. 05)，兩對靶向EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的siRNAs能夠減少感染細胞釋放子代病毒，抑制空斑形成，顯著降低感染細胞上清病毒滴度(* P<0. 05)，結果如圖5-2所示。空斑形成實驗結果與siRNAs對感染細胞EV71 mRNA的轉錄水平影響一致。鑒于上述兩對siRNAs均能夠延緩及減輕EV71病毒所致CPE，能夠降低EV71病毒mRNA的轉錄水平以及減少感染細胞釋放子代病毒，抑制病毒的復制，表現出抗病毒作用，那么這兩對siRNAs就能夠應用于抑制EV71病毒復制、尤其是應用于抑制EV71病毒復制的藥物的制備。考慮到藥物的制備時制劑的要求，進一步在保留其序列的特異性的基礎上對siRNAs進行修飾或結合于轉運載體,通過不同形式的修飾或轉運達到提高siRNA的穩定性、減少脫靶效應以及免疫刺激反應、提高SiRNA的轉運效率，產生更穩定和更強的RNA干擾效果，更好的應用于體內。一般來講，所述的修飾包括核糖修飾、磷酸骨架修飾、堿基修飾；所述的轉運載體包括細胞穿透性多肽、細胞靶向性配體、納米顆粒。具體的修飾方式或轉運載體的選擇可根據制劑的要求或效果來確定。進一步，出于對病毒多靶點干擾的考慮，在制備抑制EV71病毒復制的藥物時是將siRNA-1、siRNA-2混合，從而達到更廣譜的病毒干擾作用。
在上述兩對siRNAs對抑制EV71病毒所表現的作用下，由于5’ -非翻譯區在病毒復制中的重要性和其高度保守的特性，那么其所針對的兩個靶點區域就成為了干擾EV71病毒復制的有效的靶點。
權利要求
1.用于干擾EV71病毒復制的靶點，其特征在于，包括下列區域 EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的第115 133nt的區域； EV71病毒基因組5’ -非翻譯區的第648 666nt的區域。
2.如權利要求I所述的用于干擾EV71病毒復制的靶點，其特征在于，所述的第115 133nt的核苷酸序列為cagcaaacca cgatcaata ;所述的第648 666nt的核苷酸序列為cagagcaatt gtttaccta。
3.權利要求I所述的用于干擾EV71病毒復制的靶點作為設計小干擾RNA所針對的靶點的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述小干擾RNA用于抑制EV71病毒復制，包括針對兩個區域其中之一小干擾RNA或者為兩者的混合。
5.一種干擾EV71病毒復制的小干擾RNA，其特征在于，包括正義鏈和反義鏈，其正義鏈序列為cagcaaacca cgaucaauat t,反義鏈序列為uauugaucgu gguuugcugt t ； 或者其正義鏈序列為cagagcaauu guuuaccuat t,反義鏈序列為uagguaaacaauugcucugt t。
6.權利要求5所述的干擾EV71病毒復制的小干擾RNA對抑制EV71病毒復制的應用。
7.權利要求5所述的干擾EV71病毒復制的小干擾RNA在制備抑制EV71病毒復制的藥物的制備的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的干擾EV71病毒復制的小干擾RNA是在經過修飾或結合于轉運載體之后應用于抑制EV71病毒復制的藥物的制備，所述的修飾包括核糖修飾、磷酸骨架修飾、堿基修飾；所述的轉運載體包括細胞穿透性多肽、細胞靶向性配體、納米顆粒。
全文摘要
本發明公開了干擾EV71病毒的新靶點及其小干擾RNA和應用，所述的靶點包括下列區域EV71病毒基因組的5’-非翻譯區的第115～133nt的區域；EV71病毒基因組的5’-非翻譯區的第648～666nt的區域。針對兩個新的靶點分別提供了小干擾RNA，對其轉染到RD細胞后，接種EV71病毒，于感染后不同時間點倒置顯微鏡觀察細胞病變，結果表明兩對靶向EV71基因組5’-非翻譯區的siRNAs能夠延緩及減輕EV71感染致CPE。由于5’-非翻譯區在病毒復制當中的必要性和其高度保守的特性，使得該對靶點具有更廣譜及有效的抗病毒作用。
文檔編號C12N15/11GK102796734SQ20121016238
公開日2012年11月28日 申請日期2012年5月23日 優先權日2012年5月23日
發明者張國成, 鄧軍霞, 徐志凱, 雷迎峰, 聶曉晶, 許東亮 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學