專利名稱：香菇新菌株k48及其選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種香菇新菌株K48及其選育方法，屬于食用菌育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前食用菌的育種方法主要有野生種訓(xùn)化、雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合育種和基因工程育種等多種。野生種訓(xùn)化是從野生子實(shí)體中分離獲得菌絲體，經(jīng)栽培試驗(yàn)，篩選獲得優(yōu)良菌株。這種方法需分離獲得大量菌株，從中選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種，不能創(chuàng)造新的種性。雜交育種是一種目前應(yīng)用較多而有效的育種技術(shù)，它可組合雙親的優(yōu)良性狀、表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜交優(yōu)勢(shì)，培育出超越親本的優(yōu)良雜交種。但雜交育種是一項(xiàng)耗工耗時(shí)的工作，從對(duì)育種材料進(jìn)行遺傳分析和親緣關(guān)系分析來(lái)確定親本，再?gòu)谋姸嗟碾s交后代中篩選、鑒定出優(yōu)良品種的過(guò)程不僅需要很長(zhǎng)時(shí)間，且隨機(jī)性和盲目性很大。現(xiàn)階段誘變育種是通過(guò)物理和化學(xué)的手段，使其染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促進(jìn)變異，再?gòu)谋姸嗟淖儺愺w中篩選出好的品種，這仍然是一種篩選量大和隨機(jī)性、盲目性很強(qiáng)的育種方法。原生質(zhì)體融合育種是用于遠(yuǎn)緣雜交，克服“種間性隔離”的技術(shù)，上世紀(jì)80年代在食用菌中廣泛研究，但由于在有絲分裂過(guò)程中有些染色體會(huì)丟失，融合子不穩(wěn)定，未能得到廣泛應(yīng)用。基因工程育種在食用菌中的研究應(yīng)用主要包括以下兩個(gè)方面一是利用食用菌作為新的基因工程的受體菌，生產(chǎn)人們所期望的外源基因編碼的產(chǎn)物(即作為生物反應(yīng)器)。二是利用基因工程技術(shù)定向培育食用菌新品種，包括抗蟲、抗病，優(yōu)質(zhì)的新品種，以及將編碼纖維素或木質(zhì)素降解酶的基因?qū)胧秤镁w內(nèi)，以提高食用菌的產(chǎn)量和質(zhì)量(閻培生等，1997)。但基因工程育種目前存在的主要問(wèn)題有1、假陽(yáng)性菌落的干擾；2、外源DNA整合率不高；3、外源基因整合后表達(dá)率不高；4、轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定。這些問(wèn)題均將嚴(yán)重阻礙著研究向?qū)嶋H應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。在誘變育種中，除采用物理、化學(xué)方法改變和破壞染色體結(jié)構(gòu)而促其變異外，還有一種是不改變和破壞染色體的結(jié)構(gòu)，而人工誘導(dǎo)多倍體形成的技術(shù)方法。在植物界中的經(jīng)濟(jì)作物、中藥材植物、花卉中已人工培育出眾多的多倍體植株。在動(dòng)物界國(guó)內(nèi)已有成功的報(bào)道。以貝類、蝦類、魚等海產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的多倍體育種比較成熟，如大連水產(chǎn)學(xué)院的鮑多倍體等。在微生物中已有釀酒酵母的多倍體菌株用于工業(yè)化生產(chǎn)。人工誘導(dǎo)多倍化過(guò)程主要是利用誘導(dǎo)劑(如細(xì)胞松弛素B、6-二甲基氨基嘌呤、秋水仙素等)干擾細(xì)胞分裂過(guò)程。其作用主要在于能抑制處于分裂細(xì)胞中的微管的聚合，使已有的微管解聚，從而阻止紡錘體的形成或破壞已形成的紡錘體，使細(xì)胞的染色體在加倍后而不能分離，使細(xì)胞分裂停止在分裂中期。這種染色體加倍后的細(xì)胞在解除誘導(dǎo)處理后，在一定時(shí)間內(nèi)能恢復(fù)正常生長(zhǎng)，重新進(jìn)行細(xì)胞分裂，從而得到較為穩(wěn)定的多倍體細(xì)胞。這種干擾作用對(duì)染色體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響， 只導(dǎo)致染色體的成倍增加，并不發(fā)生染色體交換、基因重組和基因突變，可使原有性狀得到放大、加強(qiáng)和提高。這在很多種植物的多倍體育種中得到證明，而在食用菌的育種研究中還未見有國(guó)內(nèi)的任何報(bào)道。有日本學(xué)者在上世紀(jì)八十年代的研究認(rèn)為人工誘導(dǎo)菇類多倍體是不可能的我國(guó)是世界香菇栽培大國(guó)，栽培歷史悠久，栽培技術(shù)先進(jìn)，特別是代料栽培技術(shù)居世界領(lǐng)先水平。但是國(guó)內(nèi)培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的香菇品種較少，特別是能在國(guó)內(nèi)大面積栽培的品種更少。香菇代料栽培是今后生產(chǎn)發(fā)展的主要方式，目前國(guó)內(nèi)香菇代料栽培中的品種仍以“ 135”和“939”菌株為主。香菇“ 135”菌株是上世紀(jì)70年代使用的低溫遲熟型品種，菇形、品質(zhì)較好，但使用年代過(guò)久，在代料栽培中表現(xiàn)為產(chǎn)量較低，抗逆性差，夏季遇高溫易爛筒。香菇“939”菌株產(chǎn)量較高，易管理，但出菇過(guò)多、過(guò)密，叢生菇多，嚴(yán)重影響香菇品質(zhì)。所以，選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的香菇新品種，促進(jìn)我國(guó)香菇代料生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，已是迫在眉睫的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)將出發(fā)菌株的單核體菌株誘變后再與雙核體菌株(單X雙) 雜交的方法，以期培育出適宜代料栽培、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)，且抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良菌株，用于香菇生產(chǎn)，代替目前的常規(guī)栽培品種，促進(jìn)香菇產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。一方面，本發(fā)明提供了一種香菇(Lentinula edodes)新菌株K48，該菌菌株已于 2012年01月06日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. 5713。它是香菇303菌株的單核體誘變后再雜交得到的新菌株。另一方面，本發(fā)明提供了一種香菇誘變雜交育種的方法，包括以下步驟(1)用香菇303菌株進(jìn)行單孢分離，培養(yǎng)單核體菌株備用；(2)制備含有秋水仙素的PDA培養(yǎng)基，裝試管，滅菌后擺放成試管斜面；(3)在上述斜面培養(yǎng)基中接入303菌株的單核體菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；(4)經(jīng)培養(yǎng)一定時(shí)間后，轉(zhuǎn)出菌落前端的菌絲到常規(guī)培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)；(5)用經(jīng)誘導(dǎo)的單核體菌株與雙核體菌株分別作單X雙雜交；(6)作形態(tài)觀測(cè)試驗(yàn)；作對(duì)峙培養(yǎng)和同功酶檢測(cè)試驗(yàn)；作DNA指紋檢測(cè)，鑒定雜交新菌株；(7)雜交新菌株與親本菌株作連續(xù)三年的栽培品比試驗(yàn)；(8)優(yōu)良雜交新菌株經(jīng)過(guò)專家鑒定。所述雙核體菌株是JL-2。所述秋水仙素的濃度在0.01% -5%的范圍內(nèi)，優(yōu)選為0. 1%。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為2天-120天，根據(jù)誘導(dǎo)劑的使用濃度來(lái)選擇誘導(dǎo)處理時(shí)間。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明克服了現(xiàn)有誘變育種中使其染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促使變異，再篩選大量變異體的隨機(jī)性、盲目性強(qiáng)的缺點(diǎn)，提供了一種食用菌誘變加雜交的育種新方法。不破壞和改變親本的染色體結(jié)構(gòu)，僅促使染色體倍性的增加，可不改變出發(fā)菌株現(xiàn)有的優(yōu)良性狀，從而達(dá)到優(yōu)良品種在產(chǎn)量、品質(zhì)和適應(yīng)性等生產(chǎn)性狀方面得到較大的提升，獲得更加優(yōu)良的新菌株。從本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，新菌株K48是用誘變的一個(gè)單核體與另一個(gè)雙核體經(jīng)單X雙雜交而得到的，因誘變加雜交的雙重效應(yīng)，從而使新菌株K48與親本菌株JL-2 相比產(chǎn)生了較大的變異。
試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)單核體誘變后再雜交得到的新菌株K48明顯有別于出發(fā)菌株和親本菌株，其產(chǎn)量極顯著高于親本菌株，且抗高溫能力增強(qiáng)。多種鑒定方法綜合認(rèn)定結(jié)果表明，雜交誘變菌株K48是有別于出發(fā)菌株和親本菌株的新菌株。秋水仙堿的誘變效果明顯，該技術(shù)方法為香菇的新菌株選育提供了一種有效的新途徑。香菇(Lentinula edodes)新菌株K48，該菌菌株已于2012年01月06日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. 5713。


圖1是本發(fā)明技術(shù)路線示意圖；圖2是供試菌株ISSR聚類分析示意圖；圖3是供試菌株SRAP聚類分析示意圖；圖4是誘變菌株和出發(fā)菌株的生長(zhǎng)對(duì)比試驗(yàn)，誘變菌株(388B1)和出發(fā)菌株 (388) 23 °C 培養(yǎng) 10 天；圖5是新菌株K48和對(duì)照菌株939的三年栽培數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)直觀圖(橫坐標(biāo)為出菇月份當(dāng)年9月至次年4月，縱坐標(biāo)為單產(chǎn)，單位g)；圖6是新菌株K48和對(duì)照菌株939平均單袋12月底以前總產(chǎn)量占全年總產(chǎn)量比例圖；圖7是新菌株K48和對(duì)照菌株939三年平均單袋產(chǎn)量直觀圖；圖8是顯示供試菌株子實(shí)體形態(tài)特征的照片。
具體實(shí)施例方式1、材料與方法1. 1 材料1. 1. 1親本菌株香菇135 (三明真菌所引進(jìn))、香菇939 (三明真菌所引進(jìn))、303 (本公司雜交選育)、幾-2(日本引進(jìn))。1.1.2 培養(yǎng)基試驗(yàn)培養(yǎng)基PDA+20%菌糠煮汁。誘變培養(yǎng)基PDA+0. 1 %秋水仙堿。栽培培養(yǎng)基雜木屑83%、麩皮15%、糖1%、石膏1%。1.1. 3主要試劑秋水仙堿(C22H25N05)含量98%，分析純，上海惠世生化試劑公司進(jìn)口分裝。熒光染料Hoechst33258(商品名)，雙苯并咪唑(C25H24N5O13HCL)化學(xué)名，瑞士進(jìn) □。1. 2 方法1. 2. 1單孢分離2004年12月15日分別采集香菇135、303的子實(shí)體(八成熟)，置于鐘罩式孢子采集器中，于23°C培養(yǎng)四天后，收集孢子連續(xù)10倍稀釋5次，稀釋的孢子懸浮液在 2cmX 20cm的試管斜面上劃線培養(yǎng)。孢子開始萌發(fā)后，逐個(gè)挑取星芒狀的單個(gè)小菌落轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。再逐個(gè)鏡檢，凡是無(wú)鎖狀聯(lián)合的可暫作為單孢菌落，并隨即編號(hào)，冰箱保藏、備用。1. 2. 2單核菌株交配型確定將初次鏡檢的各單孢菌落相互配對(duì)作交配型試驗(yàn)，挑取兩菌落交接處的菌絲鏡檢，根據(jù)各單孢菌落在交配型試驗(yàn)中的親和表現(xiàn)進(jìn)行分析，以確定各單核體菌株的交配型。1.2.3單核體菌株的誘變處理將香菇135、303兩菌株的單核體菌株，分別接種在含0. 秋水仙堿的斜面培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中25°C恒溫培養(yǎng)，每個(gè)供試菌株接種10支試管，20天后，陸續(xù)挑取菌落尖端的菌絲轉(zhuǎn)管培養(yǎng)后備用。 1.2.4配對(duì)雜交-單X雙雜交實(shí)驗(yàn)誘變的單核體菌株分別與幾_2、939香菇菌株配對(duì)作單X雙雜交。先接種單核體菌株待成活萌發(fā)后，再接種雙核體菌株。在兩株菌絲交接后再培養(yǎng)10天左右，挑取單核體 (非交接處)另一側(cè)的菌絲轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，經(jīng)鏡檢產(chǎn)生有鎖狀聯(lián)合的即為雜交雙核體新菌株。1.2.5生長(zhǎng)溫度和拮抗實(shí)驗(yàn)將供試菌株分別接種5支試管，在5 °C、25 °C、26 °C、27 V、28。C、29 V、30 V的條件
下作菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)，觀察并記錄菌絲生長(zhǎng)情況。將誘變菌株分別與其出發(fā)菌株和親本菌株135、303、幾_2、939作拮抗性試驗(yàn)，觀
察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1. 2. 6新菌株檢測(cè)鑒定(委托華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院檢測(cè))1. 2. 6. 1鑒定的方法和內(nèi)容1)菌絲細(xì)胞核染色采用爬片制備菌絲體進(jìn)行熒光染色或吉姆沙染色，而后熒光顯微鏡下鏡檢，并記錄結(jié)果。2)擔(dān)孢子電鏡掃描取子實(shí)體菌褶制片供電鏡掃描觀察擔(dān)孢子形態(tài)和大小。3)拮抗實(shí)驗(yàn)取直徑5cm的培養(yǎng)皿制平板，用打孔器制圓形接種塊，同皿，同組合， 三次重復(fù)，接種對(duì)峙培養(yǎng)。4)酯酶同工酶常規(guī)凝膠電泳法記錄結(jié)果。5)多酚氧化酶常規(guī)凝膠電泳法記錄結(jié)果。6)核酸含量測(cè)定方法見提供的參考資料。7)分子標(biāo)記(ISSR和SRAP)分析每種標(biāo)記篩選3個(gè)合適的引物，記錄每種引物分析的DNA指紋圖和遺傳聚類的結(jié)果。1.2. 7新菌株栽培比較試驗(yàn)1.2. 7. 1三年栽培比較試驗(yàn)于2007年、2008年、2009年分別用15cmX50cm的塑料袋制作菌筒，經(jīng)室內(nèi)越夏后，于秋季移入層架式菇棚(5層)中并注意環(huán)境條件的一致，記錄每次的出菇時(shí)間、產(chǎn)量、 個(gè)數(shù)、菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)短并計(jì)算每筒平均單產(chǎn)、單菇重。1. 2. 7. 2產(chǎn)量生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS17. 0生物統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)比出發(fā)菌株(或?qū)φ站?對(duì)新菌株三年的平均單袋產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用旬期做因變量，同一菌株三年同一句期的單袋產(chǎn)量做自變量，進(jìn)行單因素方差分析。1. 2. 7. 3抗高溫比較試驗(yàn)對(duì)供試菌株進(jìn)行越夏管理實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析越夏溫度在30°C以上的時(shí)間及越夏前后菌筒的污染情況。1. 2. 8子實(shí)體形態(tài)特征子實(shí)體考種方法參照日本國(guó)提供的標(biāo)準(zhǔn)和方法進(jìn)行。2結(jié)果與分析2. 1 結(jié)果2. 1. 1單核菌株的交配型經(jīng)交配型測(cè)定試驗(yàn)，從香菇135菌株中測(cè)定出四種交配型的四個(gè)單核體菌株，編號(hào)為163 (A1B2)、132 (A2B1)、168 (AlBl)、108 (A2B2)；從303香菇菌株中測(cè)定出四種交配型的八個(gè)單核體菌株，編號(hào)為:304、3104、3119、3131、388、3101、307、382。2. 1. 2誘變實(shí)驗(yàn)從單核體誘變菌株中初篩選出菌株163A1、163B1、168A1、108A1、3101A1、388A1、 388B1。特別是單核體菌株388B1從形態(tài)、生長(zhǎng)速度上明顯不同于出發(fā)菌株388，同時(shí)接種后在23°C培養(yǎng)10天，差異極其顯著。見圖4。2. 1.3配對(duì)雜交選取誘變的單核體菌株388B1、163B1和各自的出發(fā)菌株388、163分別與幾_2、939 香菇菌株配對(duì)作單X雙雜交，雜交組合及得到的新菌株見表1:其中單核體出發(fā)菌株388與JL-2雜交試驗(yàn)表現(xiàn)為明顯的不親和性，但388的誘變菌株388B1與JL-2卻表現(xiàn)出親和性，我們將388B1 X幾_2雜交成功的菌株暫定名為K48A。表1，試驗(yàn)菌株雜交配對(duì)組合
權(quán)利要求
1.一種香菇(Lentinula edodes)新菌株K48，該菌菌株已于2012年01月06日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. 5713。
2.如權(quán)利要求1所述的香菇新菌株，其特征在于它是香菇303菌株分離的單核體菌株經(jīng)誘變后再雜交得到的新菌株。
3.一種選育香菇誘變雜交菌株的方法，包括以下步驟(1)用香菇303菌株進(jìn)行單孢分離，培養(yǎng)單核體菌株備用；(2)制備含有秋水仙素的PDA培養(yǎng)基，裝試管，滅菌后擺放成試管斜面；(3)在上述斜面培養(yǎng)基中接入303菌株的單核體菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；(4)經(jīng)培養(yǎng)一定時(shí)間后，轉(zhuǎn)出菌落前端的菌絲到常規(guī)培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)；(5)用經(jīng)誘導(dǎo)的單核體菌株與雙核體菌株分別作單X雙雜交；(6)作形態(tài)觀測(cè)試驗(yàn)；作對(duì)峙培養(yǎng)和同功酶檢測(cè)試驗(yàn)；作DNA指紋檢測(cè)，鑒定雜交新菌株；(7)雜交新菌株與親本菌株作連續(xù)三年的栽培品比試驗(yàn)；(8)優(yōu)良雜交新菌株經(jīng)過(guò)專家鑒定。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述雙核體菌株是幾_2。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述秋水仙素的濃度在0.01% -5%的范圍內(nèi)。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述秋水仙素的濃度為0.1%。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為2天-120天，根據(jù)誘導(dǎo)劑的使用濃度來(lái)選擇誘導(dǎo)處理時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香菇新菌株K48及其選育方法。香菇新菌株K48是香菇303菌株的單核體誘變后再和一個(gè)雙核體雜交得到的新菌株，是通過(guò)用含有秋水仙素的PDA培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)單核體后再雜交而獲得的新菌株，通過(guò)誘變加雜交的雙重效應(yīng)，使新菌株在產(chǎn)量、品質(zhì)和適應(yīng)性等生產(chǎn)性狀上比出發(fā)菌株和親本菌株得到較大的提升，是一種簡(jiǎn)便、實(shí)用和有效的食用菌育種新技術(shù)。
文檔編號(hào)A01H1/08GK102523929SQ20121001704
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者徐年聲 申請(qǐng)人:遠(yuǎn)安科力生菌業(yè)有限公司