專利名稱：一種雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法
技術領域：
本發明屬于食用菌培植技術領域，具體涉及一種雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法。
背景技術：
雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)是一種廣泛栽培的食用菌，在現有的技術中，雙孢蘑菇的生產一般采用固體菌種，但固體菌種具有明顯的缺陷，主要表現在生長周期長、菌齡不一致、發菌速度慢、栽培種需用量大、生產成本高等方面，顯然不能滿足大規模的雙孢蘑菇栽培需求。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，以滿足高效培育雙孢蘑菇的使用需求。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下一種雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，包括以下步驟(1)取活化的0. 5cm2斜面母種接種到裝有60 120mL液體培養基的250mL培養瓶中，控溫21 27°C，90 180rpm振蕩培養5 7d得一級搖瓶菌種，按接種量為5 10%轉接一級種子到二級培養液進行培養，再將培養好的二級搖瓶液體菌種轉接到三級液體培養液進行培養，相同方法依次進行各級培養得種子液；其中，各級搖瓶培養條件相同，液體培養基配方為碳源，氮源 10 20g，KH2PO4 1 3g，MgSO4 0. 5 1. Sg5VB1 IOmg,/K IOOOmL, PH5 7 ；碳源為20 30g的麩皮、玉米粉、葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖，或20 30mL麥芽汁；氮源為蛋白胨、酵母粉、玉米粉、硫酸銨或硝酸鉀；(2)將步驟(1)所得的種子液按5%的接種量接種至裝有6L發酵培養基的IOL 發酵罐進行發酵培養，25°C培養5 6d，即可；其中，發酵培養基配方為麥麩30g，玉米粉 10g，蛋白胨 lg，磷酸二氫鉀 0. 5g、硫酸鎂 IgJB1 10mg/L，水 IOOOmL, ρΗ6· 5。步驟(1)中，碳氮比(g/g或mL/g)優選為3 1或2. 5 1. 5 ；步驟(1)中，碳源優選為麩皮、玉米粉或麥芽汁；一級培養最優選使用麥芽汁，二級培養最優選使用玉米粉。步驟(1)中，氮源優選為蛋白胨、酵母粉或玉米粉，最優選為玉米粉。步驟(1)中，一級培養時，液體培養基的優選配方為麥芽汁30mL，玉米粉10g， KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g, VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。步驟(1)中，二級培養時，液體培養基的優選配方為玉米粉10g，蛋白胨20g， KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g, VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。步驟(1)中，培養條件優選為裝液量為90mL，控溫25°C，150rpm振蕩培養5 6d，
接種量為5%。有益效果與現有的固體培養雙孢蘑菇菌種方法相比，本發明的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法具有的明顯優勢包括生產周期短、菌齡一致、生產成本低、接種簡便，一支試管種通過五級種培養就可以放大200000倍，液體二級菌種生長速度明顯優于固體傳統栽培種，速度提高了 33%，同時，液體種各級之間的生長速度并沒有太大差異，平均滿瓶時間是27. 5d，完全可以在工廠生產中實際應用，具有很好的實用性，能夠產生很好的經濟效益和社會效應。


圖1是碳源對菌絲球生長量結果圖；圖2是碳源對菌絲球數量影響結果圖；圖3是碳源對菌絲球直徑影響結果圖；圖4是氮源對菌絲球生長量結果圖；圖5是不同碳氮比對菌絲球生長量結果圖；圖6是pH值對生物量的影響結果圖；圖7是培養過程中pH值變化曲線圖；圖8是接種液體菌種與固體菌種生長速度比較圖；圖9是不同濃度的無機鹽培養結果圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。以下實施例所使用的材料和方法為試驗材料菌種為雙孢蘑菇。按照有機肥料中國人民共和國農業行業標準NY525-2002測定各種原料含碳量和
含氮量。菌絲體生物量測定將生長良好、無污染的搖瓶培養發酵液，經4層紗布過濾，菌絲球生物量濕重為浙干后取固體物在電子天平上稱重，菌絲球生物量干重則是直接過濾烘干稱重。菌球直徑測定取ImL發酵液用水稀釋10倍，隨機取20個菌球在培養皿中沿固定的直線排成一行，用卡尺測定總長度，重復3次，求其平均值。菌球密度測定取ImL均勻的發酵液用水稀釋10倍，于培養皿下墊置黑色方格紙計數。pH值測定采用酸度計測定pH值。還原糖測定取發酵液上清液按3，5- 二硝基水楊酸比色法測定還原糖。菌絲生長速度固體栽培種或是液體菌種相同接種量接種后，觀察菌絲在菌種瓶中萌發，向下生長，直至生長至瓶底的時間，即滿瓶時間。發酵罐參數測定IOL全自動氣升式攪拌玻璃發酵罐裝液量為6L，以搖瓶試驗得出的最佳液體培養基配方配置液體發酵培養基，在發酵罐中經過空消和發酵罐自身蒸汽 121°C下滅菌20min，待罐內培養基溫度下降至25°C左右，按照5%接種量接種已經活化好的液體菌種種子液，通入無菌空氣開始控制培養發酵。按1 為間隔定時無菌取樣，其菌絲球生物量、菌絲球密度、菌絲球直徑，溶氧濃度和pH值以電極測量。
實施例1取活化的斜面母種約0. 5cm2的小塊接種到液體培養基中，于25°C恒溫振蕩培養得一級搖瓶菌種，再將培養好的一級搖瓶液體菌種轉接到各處理的二級液體菌種搖瓶中，依次進行各級培養，若無特殊說明，各級搖瓶培養條件均為250mL三角瓶裝液量IOOmL,接種量5% (V/V)，搖床轉速150r/min，25°C振蕩培養5 7d,同樣，其余各級液體菌種也是相同的培養方式。雙孢蘑菇液體菌種的液體培養基配方為氮源，碳源，KH2PO4 3g, MgSO4 1.5g， VB1 10mg，水1000mL，pH自然，121°C滅菌30min。用作雙孢蘑菇斜面培養的PDA通用培養基配方馬鈴薯200g，蔗糖20g，水IOOOmL, pH自然，121°C滅菌20min，。(1)在液體培養基中，氮源為20g蛋白胨，碳源選擇麥芽汁、麩皮、玉米淀粉、果糖、 葡萄糖、甘露糖和蔗糖分別進行培養，其中，麥芽汁為30mL，麩皮、玉米淀粉、果糖、葡萄糖、 甘露糖和蔗糖均為30g。對雙孢蘑菇液體菌種菌絲球生物量進行分析，結果如圖1所示，在所測碳源中，雙孢蘑菇對麥芽汁的利用效果較好，雙孢蘑菇菌絲球生物量達15. 25g/100mL, 其次是麩皮、玉米淀粉，而對果糖的利用效果最差，生物量為3. 96g/100mL，利用率僅為麥芽汁的1/4。顯然，無論是從理論基礎還是生產實際出發，麥芽汁來源廣泛，成本遠遠低于化學試劑糖類價格，從而用復合碳源麥芽汁的經濟成本遠遠低于糖類。不同碳源培養基對菌絲球數量、菌球直徑有重要影響，如圖2和圖3所示，菌球直徑最小的是麥芽汁培養基，菌球直徑平均為1. 7mm，單位體積發酵液中含有菌球數目465個/mL，其次是麩皮菌球直徑2. 1mm、 365個/mL，玉米淀粉菌球直徑2. 2mm,345個/mL。復合碳源的培養基能夠培養出大量的菌絲球，且菌球直徑較為均一，因此，在生產中復合碳源麥芽汁效果最佳。復合碳源營養成分豐富，里面含有較多的固形物質，從而在菌絲利用時產生多種物質使得黏度增大，在一定是黏度范圍內，黏度增大有利于菌絲的形成，有利于新的菌絲片段成長為新的菌絲球萌發點，過高或過低的黏度都對菌球的生長和繁殖無益。而低分子碳源，由于其能直接被菌絲吸收利用，在菌絲生長過程中提供充足的營養，使菌絲分枝、延伸， 菌絲生長以變粗變大為特征，從而在后期出現營養不足，并引起菌絲內部缺氧，形成較大的菌絲片段，以致影響了菌球的形成，致使菌球數目急劇降低，菌絲片段多，菌絲球較少，并且直徑不統一。(2)在液體培養基中，碳源為30mL麥芽汁，氮源選擇蛋白胨、酵母粉、玉米粉、牛肉膏、尿素、硫酸銨和硝酸鉀分別進行培養，其中，氮源各為20g。分別接種雙孢蘑菇，在25°C下搖瓶培養，測定雙孢蘑菇液體菌絲球生物量，結果如圖4所示，有機氮與無機氮相比，雙孢蘑菇對大多數有機氮的利用效率較高，生物量都較高，玉米粉和蛋白胨都是不錯的氮源。對部分無機氮尿素等的利用效率最差，生物量為零。 在以上氮源中，玉米粉與其他氮源相比，產生的泡沫最少，泡沫增多會影響溶氧系數，嚴重時造成大量逃液，增加污染幾率，所以最佳氮源是玉米粉或蛋白胨，由于玉米粉在增加粘性以及成本上的優勢，選擇玉米粉為氮源。(3)在液體培養基中，碳源為30mL麥芽汁，氮源為20g蛋白胨，并添加玉米粉進行培養，觀察玉米粉對雙孢蘑菇液體菌種菌絲生長的影響，結果如表1所示，當不添加玉米粉的時候，雙孢蘑菇菌絲生物量最小，菌球直徑大、數量少；隨著玉米粉添加量的增大，菌絲生物量也隨之增大，當添加量達到2% (質量比，下同)時，菌球生物量反而變小，可能液體黏性過大，液體搖動振蕩速率降低，影響液體中溶氧性，菌絲大量生長時由于沒有得到充分的氧氣而在后期生長緩慢。而玉米粉添加量在1%、1. 5%時，液體黏性較為合適，氧氣供應充足，并且碳氮比均比較適合雙孢蘑菇菌絲生長，菌絲適應強，很快誘導菌絲萌發生長，得到大量直徑均一的菌絲球，并且生物量也處于最高點，因此，玉米粉添加量優選為1 %。玉米粉不僅可以作為氮源，也作為增黏劑，同時玉米粉還能提供一定的有機質營養，這樣玉米粉可以同時滿足幾個生長因素，但這是相對最經濟實惠的，玉米粉在其中被徹底利用，是對資源的充分利用。表1玉米粉含量對雙孢蘑菇菌絲生物量影響
添加量(％ )0 I 0. 5 IITo~175~2. 0
生物量(g/100mL)3TT2 9 95 15. 12 13.96 9. 16
菌球直徑(mm)279 Γθ h2 7 1.9
菌球數量(個 /mL) 53 268 569 514 351(4)在液體培養基中，碳源為麥芽汁，氮源為玉米粉，進行七個不同的配比方案培養，觀察其對雙孢蘑菇液體培養的影響。分別比較了不同配比下，對菌絲生物量的影響，從而初步確認最佳碳氮比，結果如圖5所示，在碳源充足的情況下，隨著氮源的增加，生物量也隨之逐漸增加，當碳源比為3 1時(麥芽汁30mL，玉米粉IOg)，生物量達到最大值；而當氮源充足，碳源逐漸減少的時候，生物量隨著碳源的降低而減少。同時對培養液的PH值研究發現，氮源過多時，滅菌后PH值會偏高；碳源豐富時，PH值會出現偏低，過高或者過低的PH值都不利于雙胞蘑菇菌絲的生長。因此，碳源、氮源并非越多越好，而是要有一個適當的比例才是最適合雙孢蘑菇液體菌種菌絲生長，優選比例為3 1或2.5 2.5。(5)在液體培養基中，碳源為30mL麥芽汁，氮源為IOg玉米粉，分別對硫酸鎂和磷酸二氫鉀做了十個不同濃度的培養。結果如圖9所示，添加不同含量的硫酸鎂和磷酸二氫鉀對菌絲生長有一定的促進作用，當硫酸鎂添加量小于0. 05%時，隨著其含量的增加，雙孢蘑菇生物量也成正比例增加，當含量為0. 05時，達到最大值；然后，生物量隨著硫酸鎂含量的增加成下降趨勢。當磷酸二氫鉀含量在0. 10%之前，生物量隨著含量的增加而增大，當含量為0. 10%時，生物量達到最大值，這說明低濃度的無機鹽對雙孢蘑菇有促進作用，而高濃度反而不利于其生長。所以，在雙孢蘑菇液體培養基中應添加硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀 0. 10%。(6)在液體培養基中，碳源為30mL麥芽汁，氮源為IOg玉米粉，硫酸鎂為0. 5g，磷酸二氫鉀為lg，改變培養基初始PH值以確定其液體培養最合適的初始pH值，實驗結果由圖 6和7所示，pH值對液體菌種生物量的影響呈現鐘罩型的曲線，起始pH值不同導致培養結束時雙孢蘑菇菌絲生物量的不同，并觀察到雙孢蘑菇生長PH值的上下臨界點，當pH值小于 4或者大于8. 5的時候，雙孢蘑菇菌絲不能生長，在pH值在6. 5之前，隨著pH值的上升，菌絲生物量也隨之增大；當PH值達到6. 5時，菌絲生物量達到最大值；隨著pH值的逐步增大， 菌絲生物量也逐步降低。在PH6-7之間，pH值變化情況對菌絲生物量的影響尤為顯著，因為初始PH值給微生物提供了一個適宜生長的環境，生物酶處于最適狀態，菌絲不需經過長期的適應過程就直接開始新陳代謝作用。初始PH值6. 5培養的液體培養基，培養過程中，pH
6值有一定逐漸變小的趨勢，初始階段變化不太明顯，至培養3d后，pH值開始明顯下降；培養末期，PH值大約比初始pH值6. 5降低1左右，pH值的降低，培養液酸性增強，會對代謝過程產生一些反饋抑制，降低生物各種酶的活性，影響菌絲生長；同時使液體培養基更容易被其他細菌污染，影響整個發酵過程，所以應該適當縮短液體培養時間，降低污染率，因此選擇 PH值6. 5作為液體培養基的初始pH值。至此，得出雙孢蘑菇液體菌種的優選培養基配方為麥芽汁30mL，玉米粉10g， KH2P043g MgSO4L 5g, VB1IOmg,水 IOOOmL, ρΗ6· 5。(7)在雙孢蘑菇液體菌種的優選培養基(麥芽汁30mL，玉米粉10g，KH2P043g MgSO4L 5g，VB1IOmg,水lOOOmL，pH6. 5)中，選擇不同的培養溫度培養雙孢蘑菇液體菌種，實驗結果如表3所示，從表中數據可以看出，25°C時，除了菌球直徑并非最佳結果外，其余標準均處于最佳水平菌絲球生物量9. ^g/100mL，菌絲球密度421個/mL，同時還可以發現，在 25°C上下波動范圍之內，對菌絲生物量并沒有直接顯著的影響，因此，選擇25°C作為最適培養溫度。表2培養溫度對雙孢蘑菇菌絲生物量的影響
培養溫度菌絲球生物量菌絲球密度(個^菌絲球直徑~
(0C)(g/100mL)/mL)(mm)
219 3389L09
239 8382L20
25926421ΓΤθ
278^91393 Λ
29 2273L26(8)在雙孢蘑菇液體菌種的優選培養基(麥芽汁30mL，玉米粉10g，KH2P043g MgS041. 5g，VBllOmgjjC lOOOmL，pH6. 5)中接種培養雙孢蘑菇，通過改變搖瓶的裝液量和搖床轉速，考察溶氧水平對雙孢蘑菇菌絲球生物量、菌絲球密度、菌絲球直徑等參數的影響， 結果如表3所示，搖床轉速為150r/min時，菌絲生物量處于最大值，而裝液量分別在90mL、 120mL、250mL時，差別并不是特別明顯，考慮到裝液量過多會造成溢液從而容易導致培養液的污染，因此，最佳裝液量為90mL/250mL，搖床轉速為150r/min。表3裝液量和搖床轉速對雙孢蘑菇生物量的影響生物量菌絲球密度(個菌絲球直徑
(g/100mL)/mL)(mm)
Γ^Ο 6^98258L22
~60 SM3ΠL23
裝液量 926386L09
(mL/250mL) 120 9Λ7389ΓΤΙ
"Τ50 8Λ7314U3
" δΟ 743297Γ 4
90 497151L59
二一、…士 1205Α4263L51
搖床轉速____
15010.263661.10
(r/min)----
1803.711391.00
Ο23 9103091實施例2試管種轉接到液體培養液中，需要及時從培養液中獲取豐富的營養，才能迅速適應液體而非先前生長的固體斜面培養基環境，因此，需要一級液體培養液中能夠提供充分的營養，縮短菌絲生長適應過程，得到比較符合標準的液體菌種。當以一級液體種作為種子繼續擴大培養時，需要考慮其生長環境的改變，此時不同的碳源對其生長的影響最為明顯。 按一定的接種量將實施例1最佳培養條件下培養至對數生長期的液體種接種到二級液體培養液中，在二級液體培養液中和選擇不同碳源進行培養，其結果如表4所示，一級液體種中最合適的碳源麥芽汁對二級種的作用并不十分顯著，相反倒是麩皮與葡萄糖對菌絲生物量影響明顯。在以上各種不同碳源培養時，菌球生長的形態都有各自的特點，其中蔗糖、甘露醇、麥芽汁作為碳源時，菌絲球大小不均，而麩皮和葡萄糖中的菌絲球大小一致，直徑大約是Imm左右，呈典型的圓形菌球。經過比較分析可知，以麩皮作為碳源培養的菌絲球無論是生物量還是菌絲球密度、菌絲球直徑各個方面都適合液體菌種生產的要求，所以選擇麩皮作為二級液體種的碳源。二級液體培養其余的營養成分及培養條件均與一級液體菌種各個條件一致，即玉米粉作為氮源(添加量為)、磷酸二氫鉀0. 05%、硫酸鎂0. 10%、VBl 少量。培養條件培養溫度25°C、初始pH值6. 5、裝液量90mL/250mL、搖床轉速150r/min。表4不同碳源對雙孢蘑菇二級液體菌種的影響
生物量(g/100mL) 菌絲球密度(個/mL) 菌絲球直徑(mm)~ 葡萄糖11.23395 ΓΟΟ
麥芽汁3 432940 8權利要求
1.一種雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取活化的0.5cm2斜面母種接種到裝有6(Tl20mL液體培養基的250mL培養瓶中， 控溫2廣27°C，9(Tl80rpm振蕩培養5 7d得一級搖瓶菌種，按接種量為5 10%轉接一級種子到二級培養液進行培養，再將培養好的二級搖瓶液體菌種轉接到三級液體培養液進行培養，相同方法依次進行各級培養得種子液；其中，各級搖瓶培養條件相同，液體培養基配方為碳源，氮源 10 20g，KH2PO4 廣3g，MgSO4 0. 5 1. 5g，VB1 10mg，水 IOOOmL, pH5 7 ；碳源為 2(T30g的麩皮、玉米粉、葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖，或2(T30mL麥芽汁；氮源為蛋白胨、酵母粉、玉米粉、硫酸銨或硝酸鉀；(2)將步驟(1)所得的種子液按5%的接種量接種至裝有6L發酵培養基的IOL發酵罐進行發酵培養，25°C培養5飛d，即可；其中，發酵培養基配方為麥麩30g，玉米粉10g，蛋白胨 lg，磷酸二氫鉀 0. 5g、硫酸鎂 IgJB1 10mg/L，水 IOOOmL, ρΗ6· 5。
2.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于步驟(1) 中，碳氮比為3:1或2.5:1.5。
3.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于步驟(1) 中，碳源為麩皮、玉米粉或麥芽汁。
4.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于步驟(1) 中，碳源為麥芽汁。
5.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于步驟(1) 中，氮源為蛋白胨、酵母粉或玉米粉。
6.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于步驟(1) 中，氮源為玉米粉。
7.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于步驟(1) 中，一級培養時碳源為麥芽汁，二級培養時碳源為玉米粉。
8.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于步驟(1) 中，一級培養時，液體培養基配方為麥芽汁30mL，玉米粉10g, KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g，VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。
9.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于步驟(1) 中，二級培養時，液體培養基配方為玉米粉10g，蛋白胨20g，KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g, VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。
10.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，其特征在于步驟(1) 中，培養條件裝液量為90mL，控溫25°C，150rpm振蕩培養5飛d，接種量為5%。
全文摘要
本發明公開了一種雙孢蘑菇菌種的液體發酵培養方法，包括(1)取活化的0.5cm2斜面母種接種到裝有60~120mL液體培養基的250mL培養瓶中，控溫21~27℃，90~180rpm振蕩培養5~7d得一級搖瓶菌種，按接種量為5~10%轉接一級種子到二級培養液進行培養，再將培養好的二級搖瓶液體菌種轉接到三級液體培養液進行培養，相同方法依次進行各級培養得種子液；(2)將種子液按5%的接種量接種至裝有6L發酵培養基的10L發酵罐進行發酵培養，25℃培養5~6d即可。該方法生產周期短、菌齡一致、生產成本低、接種簡便，一支試管種通過五級種培養就可以放大200000倍，液體二級菌種生長速度明顯優于固體傳統栽培種，速度提高了33%，同時，液體種各級之間的生長速度并沒有太大差異，平均滿瓶時間是27.5d，完全可以在工廠生產中實際應用。
文檔編號A01G1/04GK102550293SQ201210023708
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月3日 優先權日2012年2月3日
發明者劉耀鴻, 劉輝, 華國棟, 孟德龍, 李冠喜, 溫以斌, 王多明 申請人:連云港市農業科學院