專利名稱：一種多孢靈芝的選育方法
技術領域：
本發明涉及一種多孢靈芝的選育方法，屬于食用菌遺傳選育技術領域。
背景技術：
靈芝(Ganoderma Iucidum)是祖國中醫藥寶庫中的珍品,素有“仙草”之譽。古今藥理與臨床研究均證明，靈芝確有防病治病、延年益壽之功效。東漢時期的《神農本草經》、明代著名醫學家李時珍的《本草綱目》，對靈芝的功效都有詳細和肯定的記載。現代藥理學與臨床實踐進一步證實了靈芝的藥理作用，并證實靈芝多糖是靈芝扶正固本、滋補強壯、延年益壽的主要成分。現在靈芝作為藥物已正式被國家藥典收載，2005年美國藥典正式收錄了靈芝，同時它又是國家批準的新資源食品，無毒副作用，可以藥食兩用。科學研究表明，靈芝的藥理成分非常豐富，其中有效成份可分為十大類，包括靈芝多糖、靈芝多肽、三萜類、16種氨基酸(其中含有七種人體必須氨基酸)、蛋白質、留類、甘露醇、香豆精苷、生物堿、有機酸(主要含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。靈芝對人體具有雙向調節作用，所治病種，涉及心腦血管、消化、神經、內分泌、呼吸、運動等各個系統，尤其對腫瘤、肝病變、失眠以及衰老的防治作用十分顯著。靈芝的應用范圍非常廣泛。就中醫角度辯證看，出于靈芝入五臟補益全身五臟之氣，所以無論心、肺、肝、脾、腎臟虛弱，均可服之。靈芝所治病種涉及呼吸、循環、消化、神經、內分泌及運動等各個系統；涵蓋內、外、婦、兒、五官各科疾病。就其根本原因在靈芝扶正固本，增強免疫功能，提高機體抵抗力的巨大作用。它不同于一般藥物僅針對某種疾病起治療作用，亦不同于一般營養保健食品只對某一方面營養的不足進行補充和強化，而是在整體上雙向調節人體機能平衡，調動機體內部活動，調節人體新陳代謝機能，提高自身免疫能力，促使全部的內臟或器官機能正常化。

靈芝孢子是靈芝在生長成熟期，從靈芝菌孔中彈射出來的極其微小的卵形生殖細胞，孢子淡褐色至黃褐色，大小只有5.2 6.9 μ mX 8.5 11.2 μ m，是活體生物，更適合人體腸胃直接吸收。它凝聚了靈芝的精華，具有靈芝的全部遺傳物質和作用。據測定它所含的靈芝多糖、靈芝多肽、三萜類、氨基酸、蛋白質等活性物質的量，是靈芝子實體的70倍。然而，傳統的靈芝品種產孢量較低(產孢量一般僅為4% )，難以滿足人們對靈芝孢子日益增長的需求；且靈芝出芝試驗的時間較長(需耗時幾個月)，使得多孢靈芝育種工作進展緩慢。

發明內容
目前用于生產的靈芝菌種分兩類:一類主要是采收靈芝子實體的菌種，另一類主要是用來采集靈芝孢子粉的菌種。本發明的目的在于針對主要用來采集靈芝孢子粉的菌種提供一種新的靈芝品種遺傳選育方法，選育出的靈芝品種可使其產孢量達8 16%，為一般靈芝品種(產孢量4%)的I倍以上，且選育出的多孢靈芝品種遺傳及主要生產性狀(產孢量)穩定，從而實現靈芝人丁種植由數量型向質量型的轉變，提高靈芝的商品性狀，同時縮短了多孢靈芝育種時間。實現上述目的本發明采用的技術方案本發明采用食用菌遺傳選育技術，具體主要涉及常規選育(靈芝組織分離法)，輔以現代生物技術中的孢子誘變育種，進行多孢靈芝遺傳選育技術研究，主要包括如下5個步驟:I)親本選擇從全國各地采集品質優良、產孢量較高的靈芝品種作為多孢靈芝的培育親本；2)常規選育將步驟I)培育親本通過靈芝組織分離法分離培養獲得菌絲體，經過栽培試驗，篩選獲得產孢量較高的靈芝品種(靈芝組織分離法即采用靈芝的幼蕾或菌蓋幼組織進行分離，獲得純菌絲的方法。它們具有較強的再生能力和保持親本種性的能力，屬于無性繁殖范疇。組織分離取材廣泛、操作簡便、易于成功，是靈芝純菌種的簡便分離方法)；3)誘變處理將步驟2)得到的靈芝品種孢子制成孢子懸浮液，通過紫外線誘變處理:誘變處理應在暗箱內進行，箱內裝15w紫外燈I支，懸掛于30cm高處，誘變處理時應先開燈20min，使波長穩定，然后將孢子懸 浮液倒入直徑為6cm的無菌培養皿中，打開皿蓋，照射時間I 3min ;用無菌水將照射后的孢子懸浮液稀釋1000倍以上，再取稀釋液0.2ml涂布于馬鈴薯瓊脂培養基的培養皿上，在25°C下培養5 10d，就能在每個平板上得到數十個單菌落，選純正、健壯的單個菌落移入斜面試管內，一個菌落只接一支斜面，待斜面菌絲長好后，再分別接入2 4瓶原種中，然后進行栽培試驗，反復比較各菌落的生物學特性，擇優留取；4)品種篩選通過步驟2)和3)，選育-誘變-再選育-再誘變，篩選出符合主要生產性狀要求的菌株(產孢量高)，從而減少常規育種時間，實現多孢靈芝品種遺傳選育工作的快速高效；5)人工栽培將通過步驟4)得到的優良品種，進行人工栽培，實現多孢靈芝的速生豐產(產孢量達8 16%);品種遺傳及主要生產性狀(產孢量)穩定，同時縮短了多孢靈芝育種時間。本發明的有益效果本發明采用食用菌遺傳選育技術，具體主要涉及常規選育(靈芝組織分離法)，輔以現代生物技術中的孢子誘變育種，進行多孢靈芝遺傳選育技術研究。篩選出優良品種，實現多孢靈芝的速生豐產(產孢量達8 16% );品種遺傳及主要生產性狀(產孢量)穩定。本發明提供的多孢靈芝選育方法可以規模化、產業化，為靈芝的遺傳育種開辟了一條新路，從而實現靈芝種植數量型向質量型的轉變，提高品種的商品性狀，同時縮短了多孢靈芝育種時間。
具體實施例方式實施例1靈芝采收標準:當子實體菌蓋邊緣黃色消失，進入成熟期，此期菌蓋不再擴展，但可繼續增重、增厚，適當控制通風，有促進子實體生長作用。當子實體菌蓋邊緣黃色消失、逐漸變成褐色時，即可采收。靈芝采收方法如下:I)采收時間:8月 9月份/每年；2)采收方法:靈芝采收時，用果樹剪從芝蓋以下3cm部位剪去，留下菌柄以便再生
第二潮靈芝；3)注意事項:靈芝采收時，不可手握菌蓋，以免菌蓋創傷，造成感染:雨天不得采收，下大雨后至少隔2天采收。靈芝采收過程中要輕采輕放，防止碰傷、壓傷和黏上沙土和雜質。實施例2靈芝組織分離培養:選擇貴州梵凈山產孢量較高的靈芝品種，采用靈芝的幼蕾或菌蓋幼組織進行分離培養，獲得純菌絲；它們具有較強的再生能力和保持親本種性的能力，具體操作如下:I)幼蕾分離:切取靈芝菌柄先端膨大的幼蕾，在無菌條件下，用75%酒精棉球擦拭，再用灼燒后的刀片從柄部淺切I刀，掰開兩半后用鋒利的接種刀挑切取幼蕾內菌肉I小塊，移接至斜面中央，28 °C下遮光培養，菌絲長滿斜面即為母種；2)菌蓋分離:選取生長正常、健壯和未成熟的子實體，切去菌柄，用75%酒精棉球擦拭菌蓋正反面，然后在菌蓋邊緣黃色生長圈處，切破皮殼，掰下幼嫩菌蓋I塊，用灼燒后的解剖刀將斷面菌肉縱橫切割成米粒大小的組織粒，置無菌培養皿內，最后用接種針將組織粒移接至斜面上，28°C下遮光培養，整個操作需在嚴格無菌條件下進行。實施例3`誘變育種:選擇貴州梵凈山產孢量較高的靈芝品種進行誘變育種，誘變劑為紫外線，誘變育種包括以下四個步驟:I)新鮮靈芝無菌孢子的收集:將滅菌處理過的多套培養皿、玻璃漏斗及不銹鋼掛鉤，置于超凈工作臺上；選擇正在彈射孢子的靈芝子實體菌蓋用75%酒精棉球擦拭，在無菌操作狀態下將其掛于玻璃漏斗內，靈芝子實體經過12 20h自然彈射后，培養皿中可收集得到一定數量的新鮮靈芝無菌孢子；2)孢子懸浮液的制備:將收集得到的靈芝無菌孢子移入無菌生理鹽水或磷酸緩沖液中，搖勻后即成孢子懸浮液；3)誘變處理:用紫外線處理，誘變處理應在暗箱內進行，箱內裝15w紫外燈I支，懸掛于30cm高處，誘變處理時應先開燈20min，使波長穩定，然后將孢子懸浮液倒入直徑為6cm的無菌培養皿中，打開皿蓋,照射時間I 3min,用無菌水將照射后的孢子懸浮液稀釋1000倍以上，然后取稀釋液0.2ml涂布于馬鈴薯瓊脂培養基的培養皿上，在25°C下培養5 10d，這時就能在每個平板上得到數十個單菌落，選純正、健壯的單個菌落移入斜面試管內，供進一步篩選；4)挑菌篩選:將誘變后的孢子經培養長出菌落后及時挑菌，選發育健全的單個菌落移入斜面試管內，一個菌落只接一支斜面，待斜面菌絲長好后，再分別接入2 4瓶原種中，然后進行栽培試驗，反復比較各菌落的生物學特性，擇優留取。實施例4人工栽培:將上述通過“選育-誘變-再選育-再誘變”得到的優良品種，進行人工栽培，實現多孢靈芝的速生豐產。人工栽培過程中應注意以下事項:I)搞好栽培環境的清潔衛生:芝房內要清除菌渣、垃圾，徹底清洗栽培用架，并進行空間消毒，消滅雜菌隱匿場所，減少傳播媒介，搞好環境衛生對防止污染能起到事半功倍的效果；2)嚴格選料:培養料要求新鮮、無霉變，用前要曝曬數天，培養料配方要求合理，主料和輔料要充分拌勻，含水量控制在60% 70%左右，裝量合適、松緊適度，裝好后立即進行高壓或常壓滅菌，以防培養基的酸化，滅菌要求徹底；3)接種中樹立嚴格的無菌觀念:由于空氣中到處漂浮有雜菌孢子，操作時不能因為肉眼看不見而麻痹大意，操作人員的雙手、衣物和所用接種工具、材料須嚴格消毒，如選用接種室接種的操作人員應戴上帽子，以防頭發上落有雜菌孢子。接種動作要盡量快捷、熟練，防止接種過程中帶入雜菌、雜菌孢子，對滅菌過程中破損的袋子用膠布封好，并在封口處用75%酒精消毒；4)適當加大接種量:可使靈芝菌絲以絕對優勢迅速占領地盤，減少雜菌的污染，起到以芝抑菌的作用；5)保證培養室內具有適宜的小氣候,把好菌絲培養關:控制25°C左右的溫度、60 % 70 %的濕度，注意通風換氣，嚴防高溫高濕，創造靈芝菌絲生長的最適宜環境條件，促進靈芝菌絲快速生長，迅速占領整個料面；6)認真抓好出芝階段的培養管理工作:靈芝栽培一般選在春季進行，出芝時正好是6、7月份的高溫季節，子實體生長階段由于需要較高的濕度，因此是防治雜菌污染的重要時期。靈芝原基長出后，要及時拔去棉塞或開袋，以免原基損壞而感染雜菌。做好保溫保濕工作，同時加強通風和給予一定的光照，促使原基健康地長成子實體，子實體成熟后及時米摘； 7)加強早期防治:定期檢查生長情況，一旦發現污染，應采取有效措施，控制雜菌的生長、蔓延。一般可采用石灰水擦洗患處，或用石灰漿封殺；如子實體感染雜菌，應及時摘除，以防蔓延。在栽培中也可選用一些高效、低毒、低殘留的殺菌劑進行拌料或治療，但在選用殺菌劑時一定要慎重，以免殺死菌絲，或引起農藥殘留。本方法選育出的多孢靈芝品種可使其芝產孢量達8 16%,為一般靈芝品種(產孢量4% )的I倍以上，且選育出的多孢靈芝在遺傳及主要生產性狀(產孢量)上穩定，從而實現靈芝人工種植由數量型向質量型轉變，提高品種的商品性狀，同時縮短了多孢靈芝育種時間。
權利要求
1.一種多孢靈芝的選育方法，其特征在于:該方法采用常規選育即靈芝組織分離法，輔以現代生物技術中的孢子誘變育種，進行多孢靈芝遺傳選育技術研究，主要包括如下5個步驟: 1)親本選擇 從全國各地采集品質優良、產孢量較高的靈芝品種作為多孢靈芝的培育親本； 2)常規選育 將步驟I)培育親本通過靈芝組織分離法分離培養獲得純菌絲體，經過栽培試驗，篩選獲得產孢量較高的靈芝品種——靈芝組織分的法V.采用靈芝的幼2或菌‘幼組織只I i分離培養，獲得純菌絲的方法: 3)誘變處理 將步驟2)得到的靈芝品種孢子制成孢子懸浮液，通過紫外線誘變處理，用無菌水將紫外線照射后的孢子懸浮液稀釋，再取稀釋液涂布于馬鈴薯瓊脂培養基的培養皿上，在25°C下培養5 10d，在平板上得到單菌落，選純正、健壯的單個菌落移入斜面試管內，一個菌落只接一支斜面，待斜面菌絲長好后，再分別接入2 4瓶原種中，然后進行栽培試驗，反復比較各菌落的生物學特性，擇優留取； 4)品種篩選 通過步驟2)和3)，選育-誘變-再選育-再誘變，篩選出符合主要生產性狀要求的產孢量高的菌株，從而減少常規育種時間，實現多孢靈芝品種遺傳選育工作的快速高效； 5)人工栽培 將通過步驟4)得到的優良品種，進行人工栽培，實現多孢靈芝的速生豐產，其產孢量達8 16% ;品種遺傳及主要產孢量性狀穩定，同時縮短了多孢靈芝育種時間。
2.根據權利要求1所述一種多孢靈芝的選育方法，其特征在于: 步驟2)靈芝組織分離法具體操作包括:A.幼蕾分離:切取靈芝菌柄先端膨大的幼蕾，在無菌條件下，用75%酒精棉球擦拭，再用灼燒后的刀片從柄部淺切I刀，掰開兩半后用鋒利的接種刀挑切取幼蕾內菌肉I小塊，移接至斜面中央，28°C下遮光培養，菌絲長滿斜面即為母種菌蓋分離:選取生長正常、健壯和未成熟的子實體，切去菌柄，用75%酒精棉球擦拭菌蓋正反面，然后在菌蓋邊緣黃色生長圈處，切破皮殼，掰下幼嫩菌蓋I塊，用灼燒后的解剖刀將斷面菌肉縱橫切割成米粒大小的組織粒，再用接種針將組織粒移接至斜面上，28 °C下遮光培養，整個操作需在嚴格無菌條件下進行。
步驟3)誘變處理具體操作包括:A.新鮮靈芝無菌孢子的收集:將滅菌處理過的多套培養皿、玻璃漏斗及不銹鋼掛鉤，置于超凈工作臺上；選擇正在彈射孢子的靈芝子實體菌蓋用75%酒精棉球擦拭，在無菌操作狀態下將其掛于玻璃漏斗內，靈芝子實體經過12 20h自然彈射后，培養皿中可收集得到一定數量的新鮮靈芝無菌孢子孢子懸浮液的制備:將新鮮的靈芝無菌孢子移入無菌生理鹽水或磷酸緩沖液中，搖勻后即成孢子懸浮液；C.誘變處理:用紫外線處理，誘變處理應在暗箱內進行，箱內裝15w紫外燈I支，懸掛于30cm高處，誘變處理時應先開燈20min，使波長穩定，然后將孢子懸浮液倒入直徑為6cm的無菌培養皿中，打開皿蓋，照射時間I 3min，用無菌水將照射后的孢子懸浮液稀釋1000倍以上，然后取稀釋液0.2ml 涂布于馬鈴薯瓊脂培養基的培養皿上，在25°C下培養5 10d，選純正、健壯的單個菌落移入斜面試管內，供進一步篩選；D.挑菌篩選:將誘變后的孢子經培養長出菌落后及時挑菌，選發育健全的單個菌落移入斜面試管內，一個菌落只接一支斜面，待斜面菌絲長好后，再分別接入2 4瓶原種中，然后進行栽培試驗，反復比較各菌落的生物學特性，擇優留 取。
全文摘要
本發明涉及一種多孢靈芝的選育方法，屬于食用菌遺傳選育技術領域；具體方法主要涉及常規選育(靈芝組織分離法)，輔以現代生物技術中的孢子誘變育種，其步驟包括親本選擇、常規選育、誘變處理、品種篩選、人工栽培。與現有技術相比，本發明在于選育出的多孢靈芝品種可使其芝產孢量達8～16％，為一般靈芝品種(產孢量4％)的1倍以上，且選育出的多孢靈芝在遺傳及主要生產性狀(產孢量)上穩定，從而實現靈芝種植由數量型向質量型轉變，提高品種的商品性狀，同時縮短了多孢靈芝育種時間。
文檔編號A01G1/04GK103238459SQ201210038310
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月14日 優先權日2012年2月14日
發明者張倫, 張 林, 賀紅早, 張超然, 袁鋮巍 申請人:貴州省生物研究所