專利名稱：一種制備龜裂鏈霉菌孢子的方法
技術領域：
本發明涉及土霉素發酵生產菌種的培養制備方法，具體地說是龜裂鏈霉菌孢子的制備方法。
背景技術：
孢子制備是發酵エ業生產中不可缺少的一個環節，孢子質量的好壞將直接影響到發酵生產的成功與否。土霉素發酵生產所用龜裂鏈霉菌菌種孢子，歷來都是在瓊脂斜面上制備。斜面的種類依使用容器的不同而分為試管斜面和扁瓶斜面兩種，后者因斜面表面積大，在生產中使用更為廣泛。但這種斜面孢子因受平面表面積的限制，生長的孢子數量難以滿足生產的要求。對于每個大試管來說，充其量也就3(Γ40億個孢子，每個扁瓶也只有200億左右孢子。在發酵生產上接種ー個2m3的種子罐，一般需要9支大試管斜面或3瓶扁瓶斜面，致使接種操作十分煩雜，也是造成雜菌污染的ー個隱患。另外。瓊脂斜面在冰箱中存放容易干縮而ー步步縮小其表面積，更不能通過真空干燥方法延長其保存期，其有效保存時間往往不超過ー個月。這就不得不在生產中頻繁更換孢子批號，往往造成生產的不穩定，同時也加大了菌種孢子制備的工作量。

發明內容
本發明的目的就是要提供一種新的制備龜裂鏈霉菌孢子的方法，以有效提高生產批次的產量、提高所得龜裂鏈霉菌孢子的保藏期限。本發明的目的是通過以下技術方案得以實現
本發明所提供的一種龜制備裂鏈霉菌孢子的方法，它包括以下步驟
(a)為以谷粒為培養載體，室溫下用水或稀營養液將谷粒浸泡2飛h，浙除水分，制成濕谷粒;
(b)在濕谷粒外層包裹麩皮粉，然后平鋪于培養容器中進行高壓蒸汽滅菌；
(c)冷卻至33 36°C，按照3、億個孢子/10g谷粒的比例，接種土霉素生產菌種龜裂鏈霉菌孢子懸浮液廣5 mL，充分搖勻，置33 38°C恒溫室培養Γ4 d，轉入28 31°C恒溫室繼續培養廣2 d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。上述的龜裂鏈霉菌孢子懸浮液可采用常規方法制成
(a)配制麩皮斜面,爺瓶斜面裝量為50mL,大管斜面為15mL,蓋上棉賽,兩層紗布,進行 消毒，冷卻到60°C左右鋪成斜面。麩皮斜面的組成為以質量百分比計，麩皮:Γ10%，瓊脂廣3%，余量為自來水；
(b)用接種針挖取120#砂土孢子約5mg接種到茄瓶培養基上；
(c)接種好的茄瓶斜面置33 38°C恒溫室培養Γ4d，轉入28 31°C恒溫室繼續培養廣2d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。(d)把長好的成熟茄瓶斜面加50 mL水或大管斜面加10 mL水，使用接種針或接種鏟刮制成孢子懸浮液。
本發明通過使用松散的顆粒狀谷粒作為培養載體從而有效提高了孢子生長環境的體表面積，從而大幅度提高了龜裂鏈霉菌孢子的批次產量(即每個培養容器中所生長的龜裂鏈霉菌孢子數量)。同吋，由于谷粒在干燥狀態下不會或很少干縮，因此對可含有成熟龜裂鏈霉菌孢子的培養載體進行真空干燥，然后密封保存，由此大大提高了龜裂鏈霉菌孢子的保藏期限。本發明所述的谷粒優選去殼谷粒，由此有利于谷物浸泡后能充分吸水或營養液，也更便于龜裂鏈霉菌菌絲的深入生長。谷粒的浸泡時間以谷粒將水分吃透又保持一定硬度為宜，特別是要保證在滅菌后谷粒熟透而相互之間又不粘連。為此，在不同的室溫下需要浸泡不同的時間，如夏天2 3 h，冬天5 6 h，春秋Γ5 h。一般以控制浸泡后的谷粒含水量40% 60%為準，最好是45% 50%。如浸泡后含水量偏高，可攤開后用風扇吹一會，以降低水分含量。本發明所述谷粒可以是小麥粒、大麥粒、大米粒、小米粒或其他谷物的完整顆粒。
如所述谷粒選擇麥粒，其平鋪在培養容器底部的厚度優選50_。所述谷粒為米粒，其平鋪在平底容器底部的厚度為20mm。本發明可根據谷粒所含營養多寡和性質的不同，選擇水浸泡或是營養液浸泡。由于谷粒本身所含的營養一般都比較豐富，故即使采用營養液浸泡，也只是稀營養液(如選擇使用O. 01%玉米漿營養液，可以略微增加磷含量，利于孢子的豐滿程度)，其主要目的是為了調節培養載體中的還原糖和磷酸鹽含量，以滿足微生物生長和孢子生成的需要，特別是滿足前期菌絲生長的營養需要而又避免菌絲過分生長抑制孢子的生成。濕谷粒中的還原糖含量可控制在O. 19Γ0. 5%之間，最好是在O. 29ΓΟ. 3%之間，溶磷含量6(Tl20 ppm,最好是80 100 ppm。蛋白質類高分子氮源對于龜裂鏈霉菌孢子的形成是必不可少的，而某些谷粒中的蛋白質含量不足，或所含的蛋白質種類不適合龜裂鏈霉菌孢子形成的需要，為此可以在浸泡后的谷粒中混入一定細度的小麥麩皮粉，使其均勻包裹在谷粒的外表面。所用的麩皮粉細度以20 60目為宜，最好是30 40目。為了確保培養過程中通氣良好，所選用的培養容器如大底三角瓶、扁平羅氏瓶、扁平茄形瓶或大試管，其谷粒裝量不能過多，一般以平鋪后形成< 50mm厚度為宜。分裝后將培養容器的瓶ロ部塞蓋、密閉，牛皮紙包頭后121°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至35 °C左右用龜裂鏈霉菌孢子懸浮液接種。滅菌后的谷粒中龜裂鏈霉菌孢子接種量一般控制在:T9億個/10 g，最好是5飛億個/10 g。在這ー接種量下，為了不過分加大谷粒的含水量，接種的孢子懸浮液以孢子含量5^8 X IO8個/mL為宜，最好是6 7 X IO8個/mL，如是，每個茄形瓶的接種量應為2 3 mL,每個大試管的接種量應為O. 7 I. O mL。為了加快培養前期菌絲的生長速度，培養溫度可控制在33 38°C之間，最好是35 36°C之間。菌絲生長充分后則改為28 31 °C之間培養，最好是在29 30°C之間培養。為了使谷粒不沾壁，以便菌絲在谷粒的各個表面均勻生長，在33 38°C培養的前兩日毎天要輕輕搖動谷粒一次，直至出現肉眼可辯的灰色孢子后不再搖動，直至孢子長滿并成熟。培養成熟的谷粒孢子經孢子計數和無菌檢查后可立即用于土霉素發酵種子罐的接種，也可在真空干燥后置4°C冰箱保存一段時間后使用，干燥溫度不得超過40°C，4°C保存時間不得超過半年。如此，可以三個月至半年時間為間隔，批量制備谷粒孢子一次，從而保持三個月至半年時間的生產種子質量穩定。
具體實施例方式以下是本發明實施的舉例，不作為發明范圍的限制。實施例I :
挑選顆粒飽滿、無蟲蛀、無黑頭、顔色均勻的小麥粒，在脫皮機上進行脫皮，剔除有裂紋、破碎的顆粒，晾干，必要使用風扇吹干，以防霉變、酸敗。取自來水在室溫(約26°C )下浸泡脫皮后的麥粒3 h左右(泡好的麥粒用手捏只有約1/3表層發軟，麥芯較硬，用牙咬會裂成兩半，不粘連)。浙除水，制成濕粒(浙除水后，置于牛皮紙上，不斷稱重，至吃水量達50%為好)。 在浸泡好的麥粒中加入40目2%的小麥麩皮粉，輕輕地充分振搖，使其均勻地包裹在濕麥粒的表面，按照30 g/茄形瓶或10 g/大試管的裝量進行分裝，121±1°C(0. 11±0.05MPa)高壓蒸汽滅菌30 min,取出冷卻至35°C左右。配制龜裂鏈霉菌孢子懸浮液
(a)配制麩皮斜面,爺瓶斜面裝量為50mL,大管斜面為15mL,蓋上棉賽,兩層紗布,進行消毒，冷卻到60°C左右鋪成斜面。麩皮斜面的組成為以質量百分比計，麩皮3%，瓊脂3%，余量為自來水；
(b)用接種針挖取120#砂土孢子2mg接種到茄瓶培養基上；
接種好的大管斜面置33°C恒溫室培養4 d，轉入31°C恒溫室繼續培養f 2 d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。取長好的120#龜裂鏈霉菌的大管孢子斜面上加上10 mL無菌水，使用接種針刮制成孢子懸浮液(約7億孢子量/mL)，按照O. 8 mL/10 g麥粒的接種量接種至茄形瓶/大試管中，搖勻使麥粒外表面均勻沾上孢子液，平鋪在33 38°C恒溫室培養3 4 d，轉入28 31°C恒溫室繼續培養廣2 d。培養第一天、第二天搖動麥粒至所有麥粒不會粘壁，第三天、第四天不再翻動。培養成熟后用稀釋梯度法進行孢子計數，結果為600億/茄形瓶，300億/大試管，而同時期培養的對照茄形瓶和大試管斜面分別為200億和30億個孢子。實施例2
挑選顆粒整齊均勻，大小適中的小米，冷藏備用。每管裝小米5 g加自來水10 mL，茄瓶裝小米15 g，加自來水30 mL，蓋好塞子，包上雙層紗布，進行消毒。121±1°C (O. 11±0· 05 MPa)滅菌 30 min，取出冷卻至 35°C左右，敲碎。用接種針挖取122#砂土孢子約2mg接種到大管麩皮斜面培養基上，麩皮斜面的組成為以質量百分比計，麩皮10%，瓊脂1%，余量為自來水。接種好的大管斜面置38°C恒溫室培養4 d，轉入31°C恒溫室繼續培養廣2 d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。取長好的122#龜裂鏈霉菌的大管孢子斜面上加上10 mL無菌水，使用接種針刮制成孢子懸浮液(約7. 5億孢子量/mL),按照O. 4 mL/5 g小米粒的接種量接種至爺形瓶/大試管中,搖勻使麥粒外表面均勻沾上孢子液，平鋪培養，在33 38°C恒溫室培養3 4 d，轉入28 31°C恒溫室繼續培養f 2d至孢子成熟。培養第一天、第二天搖動培養基，至所有麥粒不會粘壁，第三天、第四天不再翻動。培養成熟后用稀釋梯度法進行孢子計數，結果為800億/茄形瓶，300億/大試管，而同時期培養的對照茄形瓶和大試管斜面分別為200億和30億個孢子。實施例3:
挑選顆粒飽滿、無蟲蛀、無黑頭、顔色均勻的大麥粒，在脫皮機上進行脫皮，剔除有裂紋、破碎的顆粒，晾干，必要使用風扇吹干，以防霉變、酸敗。按照重量比為1:3，取自來水在室溫(約26°C)下浸泡脫皮后的麥粒3 h左右，泡好的大麥粒用手捏只有約1/2表層發軟，麥芯較硬，用牙咬會裂成兩半，不粘連。浙水后置于牛皮紙上，不斷稱重，至吃水量達45°/Γ50%為好。
在浸泡好的麥粒中加入40目3%的小麥麩皮粉，輕輕地充分振搖，使其均勻地包裹在濕麥粒的表面，按照30 g/茄形瓶或10 g/大試管的裝量進行分裝，121±1°C(0. 11±0.05MPa)滅菌30 min,取出冷卻至35°C左右。用接種針挖取123#砂土孢子約2mg接種到大管麩皮斜面培養基上，麩皮斜面的組成為以質量百分比計，麩皮3 10%，瓊脂f 3%，余量為自來水。接種好的大管斜面置33 38°C恒溫室培養Γ4 d，轉入28 31°C恒溫室繼續培養f 2 d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。取長好的120#龜裂鏈霉菌的大管孢子斜面上加上10 mL無菌水，使用接種針刮制成孢子懸浮液(約6. 5億孢子量/mL)，按照O. 8 mL/10 g大麥粒的接種量接種至茄形瓶/大試管中，搖勻使麥粒外表面均勻沾上孢子液，平鋪培養，在33 38°C恒溫室培養3 4 d，轉入28 31°C恒溫室繼續培養f 2 d至孢子成熟。培養第一天、第二天搖動培養基，至所有麥粒不會粘壁，第三天、第四天不再翻動。培養成熟后用稀釋梯度法進行孢子計數，結果為600億/茄形瓶，300億/大試管，而同時期培養的對照茄形瓶和大試管斜面分別為200億和30億個孢子。對比實施例I
常規孢子的制備方法
(a)根據配方稱取麩皮和瓊脂,加自來水,爺瓶斜面裝量為50mL,蓋上棉賽,兩層紗布，進行消毒，冷卻到60°C左右鋪成斜面。麩皮斜面的組成為以質量百分比計，麩皮:Γ10%，瓊脂廣3%，余量為自來水；
(b)用接種針挖取120#砂土孢子約5mg接種到茄瓶培養基上；
(c)接種好的茄瓶斜面置33 38°C恒溫室培養Γ4d，轉入28 31°C恒溫室繼續培養廣2d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。對比實施例2
(a)根據配方稱取麩皮和瓊脂，加自來水，大管斜面裝量為15mL，蓋上棉賽，兩層紗布，進行消毒，冷卻到60°C左右鋪成斜面。麩皮斜面的組成為以質量百分比計，麩皮:Γ10%，瓊脂廣3%，余量為自來水；
(b)用接種針挖取120#砂土孢子約5mg接種到茄瓶培養基上；
(c)接種好的茄瓶斜面置33 38°C恒溫室培養Γ4d，轉入28 31°C恒溫室繼續培養廣2d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。實施例4采用實施例I所制備小麥粒孢子，按照10 mL水/10 g小麥粒孢子的濃度制備小麥粒孢子懸液，以I 2 mL孢子液接種至母瓶培養基，30°C，220 rpm，培養26 h 28 h。以5%接種量接種至發酵培養基，30°C，220 rpm，培養5 d后放瓶，檢測土霉素效價。按照對比實施I方法制備常規茄瓶斜面孢子，挖去斜面2cm2接種母瓶為對照，匯總實驗數據如下
權利要求
1.ー種龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于它包括以下步驟 (a)為以谷粒為培養載體，室溫下用水或稀營養液浸泡2飛h，浙除水，制成濕谷粒； (b)在濕谷粒外層包裹麩皮粉，然后平鋪于培養容器中進行高壓蒸汽滅菌； (c)冷卻到33 36°C時，按照；T9億個孢子/10g谷粒的比例，接種土霉素生產菌種龜裂鏈霉菌孢子懸浮液廣5 mL,充分搖勻，置33 38°C恒溫室培養3 4 d，轉入28 31 °C恒溫室繼續培養廣2 d至孢子成熟。
2.根據權利要求I所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述谷粒為去殼谷粒。
3.根據權利要求I或2所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述谷粒浸泡后的含水量可控制在40% 60%。
4.根據權利要求I或2所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述谷粒浸泡后的含水量控制在45% 50%。
5.根根據權利要求I所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述谷粒其平鋪在培養容器底部的厚度為50 mm。
6.根根據權利要求I所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述濕谷粒其還原糖含量控制在O. 1%"0. 5%之間，溶磷含量控制在6(Tl20 ppm。
7.根根據權利要求6所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述濕谷粒其還原糖含量控制在O. 29ΓΟ. 3%之間，溶磷含量控制在8(Tl00 ppm。
8.根據權利要求7所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述麩皮粉細度為.20 60目。
9.根據權利要求I或2所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于c步所述接種土霉素生產菌種龜裂鏈霉菌孢子的接種量控制在5飛億個/10 g谷粒。
全文摘要
本發明公開了一種龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，它包括以下步驟(a)為以谷粒為培養載體，室溫下用水或稀營養液將谷粒浸泡2~6h，瀝除水分，制成濕谷粒；(b)在濕谷粒外層包裹麩皮粉，高壓蒸汽滅菌；冷卻，接種土霉素生產菌種龜裂鏈霉菌孢子懸浮液，培養至龜裂鏈霉菌孢子成熟。本發明可大幅度提高了龜裂鏈霉菌孢子的批次產量，同時可大大提高龜裂鏈霉菌孢子的保藏期限。
文檔編號C12R1/59GK102690778SQ201210184399
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者徐親民, 趙麗紅, 鄭萬靜, 齊巧娟 申請人:河北圣雪大成制藥有限責任公司