專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高農(nóng)作物胚胎出生率的培養(yǎng)方法，尤其是一種提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，屬于植物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)球甘藍(lán)(B rassica oleracea L. var. Capitata)是十字花科、蕓薹屬的植物， 為甘藍(lán)(Brassica oleracea L.)的變種。又名卷心菜、洋白菜、包菜等。結(jié)球甘藍(lán)具有耐寒、抗病、適應(yīng)性強(qiáng)、易儲(chǔ)耐運(yùn)、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等特點(diǎn)，在我國(guó)各地普遍栽培，在蔬菜栽培和供應(yīng)中占有重要地位。對(duì)蔬菜的周年供應(yīng)起很大的作用。并且大量的出口到國(guó)外，在蔬菜出口貿(mào)易中也占有相當(dāng)重要地位。目前，我國(guó)結(jié)球甘藍(lán)主栽品種大部分被日本、韓國(guó)等國(guó)外的公司所壟斷，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種較少，究其原因是因?yàn)槲覈?guó)結(jié)球甘藍(lán)育種資源很少、 開(kāi)發(fā)利用不夠，未配制出良好的品種。傳統(tǒng)的育種方法主要是對(duì)市場(chǎng)上表現(xiàn)好的結(jié)球甘藍(lán)品種進(jìn)行多代自交分離，來(lái)獲得其親本，然后用于育種實(shí)踐當(dāng)中，然而，傳統(tǒng)的多代自交分離的方法一般需要5-6年的時(shí)間才能選育到一個(gè)純合的親本材料，但其表現(xiàn)是否優(yōu)良、能否與其它材料組配，以及配制出來(lái)的雜交種表現(xiàn)能否得到認(rèn)可還需要3-4年的時(shí)間。近年來(lái)，針對(duì)傳統(tǒng)方法出現(xiàn)的游離小孢子培養(yǎng)方法可以在1-2年內(nèi)快速獲得雙單倍體純系，比傳統(tǒng)的方法縮短了 3-4年的時(shí)間，從而大大縮短育種進(jìn)程，同時(shí)，隱性性狀也易于表達(dá)，豐富了育種資源。因此，結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)技術(shù)在優(yōu)良自交系的創(chuàng)制和提高新品種選育的效率等方面具有重要作用。在蕓薹屬作物中，自從Lichter (1982)首次報(bào)道油菜游離小孢子培養(yǎng)成功獲得再生植株以來(lái)，很多國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了大量深入的研究應(yīng)用，并取得了一些成果。關(guān)于結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)最早見(jiàn)于Lichter (1989)和Takahata (1990) 的報(bào)道，隨后國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這一培養(yǎng)技術(shù)上開(kāi)展了一系列的研究和改進(jìn)，在提高結(jié)球甘藍(lán)小孢子胚胎發(fā)生頻率方面的研究也做了大量深入的研究，取得了一些成果。隨后，嚴(yán)準(zhǔn)等 (1999，)、唐青林等(2000)、劉艷玲等(2006)、袁素霞(2009)等人也有報(bào)道，但結(jié)球甘藍(lán)小孢子胚胎發(fā)生的效率普遍不高，對(duì)難出胚的品種來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)效果很不理想。有關(guān)蕓薹屬游離小孢子培養(yǎng)的大量研究表明，供體植株的基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響極為重要，它不僅影響產(chǎn)胚率，而且也影響胚的質(zhì)量(Chuong et al.，1988),限制了小孢子培養(yǎng)技術(shù)在結(jié)球甘藍(lán)遺傳育種和基礎(chǔ)研究中的進(jìn)一步應(yīng)用。雖然人們?cè)谔岣呓Y(jié)球甘藍(lán)游離小孢子出胚率的影響因素方面做了一些研究工作，但是結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子出胚率仍舊不高，且在一些基因型中很難獲得胚狀體(方淑桂等，2005a，2005b ;劉艷玲等，2006 ;陸瑞菊等，2006)，嚴(yán)重妨礙了游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用，因此，尋找一種簡(jiǎn)便有效的提高結(jié)球甘藍(lán)難出胚基因型品種出胚率的方法具有重要的實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出一種提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，采用難出胚的結(jié)球甘藍(lán)與易出胚的油菜花蕾按一定數(shù)目配比共培養(yǎng)，從而促進(jìn)結(jié)球甘藍(lán)小孢子出胚，提高小孢子培養(yǎng)的出胚率。一種提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，包括以下步驟
步驟一，取結(jié)球甘藍(lán)和油菜花序上的花蕾進(jìn)行混合，得到甘藍(lán)和油菜的混合花蕾，進(jìn)行滅菌處理；
步驟二，在滅菌后的混合花蕾中加入B5洗滌培養(yǎng)基后研磨
成懸浮液，過(guò)濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入35 45ml的 NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基、8 12滴的活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液；
步驟三，將小孢子混合懸浮液在黑暗條件下32 33 1熱激處理I 3天后，移至黑暗、溫度為25±2 °C的條件下培養(yǎng)20 30天，得到子葉型胚狀體；
步驟四，將子葉期胚狀體接種至胚狀體固體分化培養(yǎng)基中，每天光照15±3小時(shí)、溫度 23±3°C下培養(yǎng)，直至分化，得到再生芽；
步驟五，切取所述再生芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)出苗后，按常規(guī)方法進(jìn)行煉苗和移栽， 得到再生植株；
步驟六，根據(jù)植株形態(tài)，按照田間觀察的方法區(qū)分結(jié)球甘藍(lán)和油菜的再生植株，即得結(jié)球甘藍(lán)植株。其中，所述步驟一，取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾，結(jié)球甘藍(lán)花蕾的花瓣和花藥長(zhǎng)度比為O. 8 I. 2，油菜花蕾的花瓣和花藥長(zhǎng)度比為O. 5 O. 75。所述的結(jié)球甘藍(lán)和油菜共培養(yǎng)花蕾中結(jié)球甘藍(lán)花蕾與油菜花蕾的用量一般不作特別的限定，為了達(dá)到更好的效果，優(yōu)選油菜花蕾的數(shù)量大于結(jié)球甘藍(lán)花蕾的數(shù)量。滅菌采用本領(lǐng)域常規(guī)的滅菌方法， 可采用滅菌液將混合花蕾滅菌10 20分鐘，無(wú)菌水沖洗干凈后得到無(wú)菌的混合花蕾。所采用的滅菌液為0.1% (質(zhì)量百分濃度)升汞溶液。以IL升汞溶液計(jì)，組成為Ig的升汞和 IL無(wú)菌水。所述的B5洗滌培養(yǎng)基為B5液體培養(yǎng)基IL和蔗糖30 g組成，pH 6. O 6.2 ;高溫高壓滅菌，備用。所述的NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基由NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130 g組成，pH 6. O 6. 2，微孔濾膜過(guò)濾滅菌，備用；所述的活性炭混合液由NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖 2 5g和Ig活性炭組成，高溫高壓滅菌，備用。進(jìn)一步地，所述的B5液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為NaH2PO4CH2O 169. 5mg, KNO3 2500mg, (NH4)2SO4 134mg,MgS04*7H20 500mg，MnSO4·4Η20 IOmg, H3BO3 3mg, ZnSO4*7H20 2mg, KI 0. 75mg, Na2MoO4*2H20 0. 25mg, CuSO4*5H20 0. 025mg, CoC12*6H20 0. 025mg, Na2-EDTA 37. 3mg, FeS04*7H20 27. 8mg, CaCl2. 2H20 150mg, VB1 IOmg, VB6 lmg, VPP lmg,肌醇IOOmg和余量的蒸懼水；所述的NLN液體培養(yǎng)基，以 IL 計(jì)，由 KNO3 125mg，Ca (NO3) 2·4Η20 500mg，MgSO4.7H20 125mg, KH2PO4 125mg, H3BO3
6.2mg, MnSO4lH2O 18. 95mg, ZnS04*7H20 8. 6mg, Na2MoO4*2H20 0. 25mg, CuS04*5H20 0. 025mg, CoC12WH2O 0. 025mg，維生素 BI 0. 5mg，維生素 B6 0. 5mg，生物素 0. 05mg，葉酸 0. 5mg， Na2EDTA 37. 3mg, FeS04*7H20 27. 8mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，煙酸 5mg，L-谷氨酰胺 800mg， 谷胱甘肽30mg, VB5 5mg,絲氨酸IOOmg和余量的無(wú)菌水組成。所述的沉淀重復(fù)以下操作I 2次在沉淀中加入B5洗滌培養(yǎng)基，研磨成懸浮液， 過(guò)濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液。重復(fù)操作后所得的沉淀中依次加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液。所述過(guò)濾得沉淀步驟進(jìn)行I 2次，所述小孢子混合懸浮液中小孢子的濃度為O. 8 X IO5 I. 2 X IO5個(gè)/mL ;采用45Mm無(wú)菌濾網(wǎng)，離心的條件為500 900 rpm/min 離心 3 5min。所述步驟三中，熱激處理后小孢子混合懸浮液移至避光、溫度為25±2 °C的條件下培養(yǎng)20 30天期間，當(dāng)肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)，再于相同條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使小孢子胚生長(zhǎng)健壯。所述步驟四中，所述胚狀體固體分化培養(yǎng)基由B5培養(yǎng)基1L、蔗糖20g和瓊脂10 12g組成，pH5. 8 6.1，高溫高壓滅菌。當(dāng)所述的胚狀體較大時(shí)可切成多塊后接種。所述步驟五中生根培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基IL、蔗糖或白砂糖20 30g和瓊脂7 9g組成，pH 5. 8 6. O。其中，所述的MS培養(yǎng)基，以IL計(jì)，由NH4HO3 1650 mg, KNO3 1900 mg, CaCl2·2Η20 440 mg, KH2PO4 170 mg, MgSO4*7H20 370 mg, FeSO4*7H20 27. 8 mg, Na2EDTA 37. 3 mg, H3BO3 6. 2 mg, MnSO4lH2O 16. 9 mg, ZnSO4*7H20 8. 6 mg, Na2MoO4*2H20 0. 25 mg, CuSO4*5H20 0.025 mg, CoC12.6H20 0.025 mg, KI 0. 83 mg，肌醇 100 mg，甘氨酸 2 mg，煙酸 0.5 mg,維生素BI 0.1 mg,維生素B6 0.5 mg和余量的無(wú)菌水組成。移栽時(shí)用清水洗凈組培苗根部的培養(yǎng)基，后植于育苗專(zhuān)用基質(zhì)穴盤(pán)，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養(yǎng)5 10天后移栽。通過(guò)給予一定的緩沖環(huán)境，以更好地使在生長(zhǎng)環(huán)境較好的實(shí)驗(yàn)室里生長(zhǎng)的組培苗適應(yīng)較嚴(yán)酷的自然環(huán)境。鑒定采用本領(lǐng)域常用的植株形態(tài)鑒定法鑒定區(qū)分結(jié)球甘藍(lán)和油菜植株，并利用流式細(xì)胞儀對(duì)小孢子植株進(jìn)行倍性分析、鑒定。本發(fā)明采用難出胚的結(jié)球甘藍(lán)與易出胚的油菜花蕾按一定數(shù)目比例共培養(yǎng)的方法，以易出胚的材料帶動(dòng)難出胚的材料出胚，使結(jié)球甘藍(lán)的出胚率顯著提高，所共培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)出胚率最高達(dá)27. 7個(gè)/蕾，而對(duì)照結(jié)球甘藍(lán)出胚率最高僅為2. 4個(gè)/蕾，經(jīng)植株形態(tài)鑒定及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在相同的條件下混合培養(yǎng)最后得到15株結(jié)球甘藍(lán)小孢子苗， 而單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照株數(shù)為I株。其有益效果是解決了結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生頻率低的問(wèn)題，提高了小孢子培養(yǎng)技術(shù)的利用效率。
具體實(shí)施例方式結(jié)球甘藍(lán)和油菜共培養(yǎng)花蕾中結(jié)球甘藍(lán)花蕾與油菜花蕾的用量一般不作特別的限定，為了達(dá)到更好的效果，優(yōu)選油菜花蕾的數(shù)量大于結(jié)球甘藍(lán)花蕾的數(shù)量，詳見(jiàn)以下實(shí)施例。實(shí)施例一
(I)本實(shí)施例中結(jié)球甘藍(lán)和油菜花序采摘自鎮(zhèn)江農(nóng)科所試驗(yàn)田，品種不限。(2)培養(yǎng)基配制包括小孢子不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基，其組分與各組分在每升培養(yǎng)基中所含的重量為
B5洗滌培養(yǎng)基B5液體培養(yǎng)基IL+蔗糖30 g/L, pH 6. 0，高溫高壓滅菌；其中， B5 液體培養(yǎng)基，以 IL 計(jì)，組成為=NaH2PO4·2Η20 169. 5mg, KNO3 2500mg, (NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7Η20 500mg，MnSO4·4Η20 IOmgj H3BO3 3mg，ZnSO4·7Η20 2mg，KI 0. 75mg， Na2MoO4*2H20 0. 25mg，CuSO4·5Η20 0. 025mg，CoC12*6H20 0. 025mg，Na2-EDTA 37. 3mg， FeS04*7H20 27.8mg，CaCl2. 2H20 150mg，VB1 IOmgj VB6 lmg, VPP lmg,肌醇 IOOmg 和余量的蒸餾水。
NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基NLN液體培養(yǎng)基IL+蔗糖130 g/L, pH 6. O,過(guò)濾滅菌；
其中，NLN 液體培養(yǎng)基，以 IL 計(jì)，由 KNO3 125mg, Ca (NO3) 2·4Η20
500mg, MgSO4·7Η20 125mg, KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4lH2O 18. 95mg, ZnS04*7H20 8. 6mg, Na2MoO4*2H20 0. 25mg, CuSO4*5H20 0. 025mg, CoC12*6H20 0. 025mg,維生素 BI 0. 5mg, 維生素 B6 0. 5mg,生物素 0. 05mg,葉酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4·7Η20 27. 8mg,肌醇 lOOmg,甘氨酸2mg,煙酸5mg, L-谷氨酰胺800mg,谷胱甘肽30mg,維生素B5 5mg,絲氨酸 IOOmg和余量的無(wú)菌水組成。胚狀體固體分化培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基+蔗糖20 g/L,瓊脂10 g/L, pH 6. O,高溫高壓滅菌；
生根培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g/L,瓊脂6 g/L, pH 5. 8，高溫高壓滅菌；
其中，MS 培養(yǎng)基，以 IL 計(jì)，由 NH4H03 1650 mg, KN03 1900 mg, CaC12*2H20 440 mg, KH2P04 170 mg, MgS04*7H20 370 mg, FeS04*7H20 27. 8 mg, Na2EDTA 37. 3 mg, H3BO3 6. 2 mg, MnSO4eH2O 16. 9 mg, ZnSO4·7Η20 8. 6 mg, Na2MoO4·2Η20 O. 25 mg, CuSO4·5Η20 O. 025 mg, CoC12.6H20 O. 025 mg，KI O. 83 mg，肌醇 100 mg，甘氨酸 2 mg，煙酸 0. 5 mg，維生素 BI 0. I mg,維生素B6 O. 5 mg和余量的無(wú)菌水組成。本實(shí)施例按以下方法培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)
步驟一，摘取結(jié)球甘藍(lán)花序和油菜花序上生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害、單核晚期至雙核早期的花蕾作為小孢子培養(yǎng)的供體植株，其中，結(jié)球甘藍(lán)的花瓣和花藥長(zhǎng)度比為O. 8、油菜的花瓣和花藥比為O. 5、將兩種花蕾進(jìn)行混合，得到甘藍(lán)和油菜的混合花蕾，進(jìn)行滅菌處理用Ig 升汞+IL無(wú)菌水配制成滅菌液；把油菜和結(jié)球甘藍(lán)混合花蕾放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒10分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水蕩洗3次后，備用； 步驟二，在超凈工作臺(tái)上將15個(gè)(混合花蕾總數(shù)，其中油菜花蕾10個(gè))滅菌后的結(jié)球甘藍(lán)和油菜混合花蕾一并置于無(wú)菌燒杯中，加入10mlB5洗滌培養(yǎng)基，用平頭玻璃棒擠碎后研磨成懸浮液，將懸浮液用45Mm無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾到50ml離心管中，蓋緊,600rpm/min離心 3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入IOml B5洗滌培養(yǎng)基，按上述方法再離心2次，棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基40ml、再加入由NLN-13液體培養(yǎng)基+ 瓊脂糖5g/L+lg/L活性炭配制、高溫滅菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的濃度為 I X IO5個(gè)/mL的小孢子混合懸浮液；
步驟三，將小孢子懸浮液分裝到60mm塑料無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4ml小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm膜封口，后置于32. 5°C恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理I天；后取出置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)；至肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)， 置于25°C搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)20天，得到子葉型胚狀體并發(fā)育成熟；
步驟四，將子葉型胚狀體接種至胚狀體分化培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、25°C下培養(yǎng)3周至形成胚狀體，將胚狀體切成3塊大小一致的塊，接種至分化培養(yǎng)基中在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)至分化，得到再生芽；
步驟五，切取生長(zhǎng)健康的再生芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、25°C下進(jìn)行生根培養(yǎng)；3周后將根生長(zhǎng)健壯的苗進(jìn)行煉苗3天；移栽時(shí)用清水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，把植株植于蔬菜育苗專(zhuān)用基質(zhì)穴盤(pán)，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養(yǎng)10天后移栽，得到再生植株；
7步驟六，根據(jù)植株形態(tài)，按照田間觀察的方法區(qū)分結(jié)球甘藍(lán)和油菜的再生植株，即得結(jié)球甘藍(lán)植株。對(duì)比實(shí)驗(yàn)
采用結(jié)球甘藍(lán)生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株，其余方法與上述步驟相同，得到的結(jié)球甘藍(lán)植株作為對(duì)照植株。分析檢測(cè)
取再生植株的嫩葉，用美國(guó)BD公司的BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，檢測(cè)實(shí)施例植株與對(duì)照植株倍性。結(jié)果混合培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)出胚率為18. 3個(gè)/蕾，而對(duì)照結(jié)球甘藍(lán)出胚率僅為2. 4 個(gè)/蕾；經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)最后得到13株結(jié)球甘藍(lán)小孢子苗，而對(duì)照結(jié)球甘藍(lán)花蕾單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照株數(shù)為I株。實(shí)施例二
本實(shí)施例中培養(yǎng)基與實(shí)施例一的培養(yǎng)基差別如下，B5液體培養(yǎng)基IL+蔗糖30g/L， pH6. O,高溫高壓滅菌；NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基NLN_13液體培養(yǎng)基IL+蔗糖130g/L，pH 6. 1，過(guò)濾滅菌；胚狀體固體分化培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基+蔗糖20g/L，瓊脂11 g/L, pH 6. 0，高溫高壓滅菌；生根培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+白糖20g/L，瓊脂7g/L，pH 5.9,高溫高壓滅菌；
本實(shí)施例按以下方法培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)
步驟一，摘取結(jié)球甘藍(lán)花序和油菜花序上生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害、單核晚期至雙核早期的花蕾作為小孢子培養(yǎng)的供體植株，結(jié)球甘藍(lán)花序的花瓣和花藥長(zhǎng)度比為I. 2、油菜花序的花瓣和花藥長(zhǎng)度比為為O. 75、將兩種花蕾進(jìn)行混合，得到甘藍(lán)和油菜的混合花蕾，進(jìn)行滅菌處理用Ig升汞+IL無(wú)菌水配制成滅菌液；把油菜和結(jié)球甘藍(lán)混合花蕾放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中， 加入滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒11分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水蕩洗4次后，備用;
步驟二，在超凈工作臺(tái)上將14個(gè)(混合花蕾總數(shù)，其中油菜花蕾8個(gè))滅菌后的結(jié)球甘藍(lán)和油菜混合花蕾一并置于無(wú)菌燒杯中，加入10mlB5洗滌培養(yǎng)基，用平頭玻璃棒擠碎后研磨成懸浮液，將懸浮液用45Mm無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾到50ml離心管中，蓋緊,900rpm/min離心 3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入IOml B5洗滌培養(yǎng)基，按上述方法再離心I次，棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基40ml、再加入由NLN-13液體培養(yǎng)基+ 瓊脂糖2g/L+lg/L活性炭配制、高溫滅菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的濃度為
O.8 X IO5個(gè)/mL的小孢子混合懸浮液；
步驟三，將小孢子懸浮液分裝到90mm塑料無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿加IOml小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm膜封口，后置于33°C恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理2 天；取出置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)；至肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)，置于25°C搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)30天，得到子葉型胚狀體并發(fā)育成熟；
步驟四，將子葉型胚狀體接種至胚狀體分化培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、25°C下培養(yǎng)2周至形成胚狀體，將胚狀體直接接種至胚狀體固體分化培養(yǎng)基中在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)至分化，得到再生芽；
步驟五，切取生長(zhǎng)健康的再生芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、25°C下進(jìn)行生根培養(yǎng)；3周后將根生長(zhǎng)健壯的苗進(jìn)行煉苗5天；移栽時(shí)用清水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，把植株植于蔬菜育苗專(zhuān)用基質(zhì)穴盤(pán)，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養(yǎng)7天后移栽，得到再生植株；
步驟六，根據(jù)植株形態(tài)，按照田間觀察的方法區(qū)分結(jié)球甘藍(lán)和油菜的再生植株，即得結(jié)球甘藍(lán)植株。對(duì)比實(shí)驗(yàn)
采用結(jié)球甘藍(lán)生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株，其余方法與上述步驟相同，得到的結(jié)球甘藍(lán)植株作為對(duì)照植株。分析檢測(cè)
取再生植株的嫩葉，用美國(guó)BD公司的BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，檢測(cè)實(shí)施例植株與對(duì)照植株倍性。結(jié)果混合培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)出胚率為21. 3個(gè)/蕾，而對(duì)照結(jié)球甘藍(lán)出胚率僅為2. 8 個(gè)/蕾；經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)最后得到14株結(jié)球甘藍(lán)小孢子苗，而對(duì)照結(jié)球甘藍(lán)花蕾單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照株數(shù)為O株。實(shí)施例三
本實(shí)施例中培養(yǎng)基與實(shí)施例一的培養(yǎng)基差別如下，B5液體培養(yǎng)基IL+蔗糖30g/L， pH6. O,高溫高壓滅菌；NLN-13培養(yǎng)基NLN_13液體培養(yǎng)基IL+蔗糖130g/L，pH 6. 1，過(guò)濾滅菌；胚狀體固體分化培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基+蔗糖20g/L，瓊脂12 g/L, pH 6. O,高溫高壓滅菌； 生根培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+白糖20g/L，瓊脂7g/L，pH 5.9,高溫高壓滅菌；
本實(shí)施例按以下方法培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)
步驟一，摘取結(jié)球甘藍(lán)花序和油菜花序上生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害、單核晚期至雙核早期的花蕾作為小孢子培養(yǎng)的供體植株，結(jié)球甘藍(lán)花序的花瓣和花藥長(zhǎng)度比為I. I、油菜花序的花瓣和花藥長(zhǎng)度比為O. 75、將兩種花蕾進(jìn)行混合，得到甘藍(lán)和油菜的混合花蕾，進(jìn)行滅菌處理用Ig升汞+IL無(wú)菌水配制成的滅菌液；把混合花蕾放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒12分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水蕩洗5次后，備用；
步驟二，在超凈工作臺(tái)上將16個(gè)(混合花蕾總數(shù)，其中油菜花蕾11個(gè))滅菌后的結(jié)球甘藍(lán)和油菜混合花蕾一并置于無(wú)菌燒杯中，加入10mlB5洗滌培養(yǎng)基，用平頭玻璃棒擠碎后研磨成懸浮液，將懸浮液用45Mm無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾到50ml離心管中，蓋緊,700rpm/min離心 5min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入10mlB5洗滌培養(yǎng)基，按上述方法再離心2次，棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基40ml、再加入由NLN-13液體培養(yǎng)基+瓊脂糖3. 5g/L+lg/L活性炭配制、高溫滅菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的濃度為
I.2 X IO5個(gè)/mL的小孢子混合懸浮液；
步驟三，將小孢子懸浮液分裝到60mm塑料無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4ml小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm膜封口，置于32. 5°C恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理3天；取出置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)；至肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)，置于 25°C搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)25天，得到子葉型胚狀體并發(fā)育成熟；
步驟四，將子葉型胚狀體接種至胚狀體固體分化培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、25°C 下培養(yǎng)2. 5周至形成胚狀體，將胚狀體切成2塊大小一致的塊，再接種至分化培養(yǎng)基中在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)至分化，得到再生芽；
步驟五，切取生長(zhǎng)健康的再生芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、25°C下進(jìn)行生根培養(yǎng)；3周后將根生長(zhǎng)健壯的苗進(jìn)行煉苗4天；移栽時(shí)用清水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，然后把植株植于蔬菜育苗專(zhuān)用基質(zhì)穴盤(pán)，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養(yǎng)9天后移栽， 得到再生植株；
步驟六，根據(jù)植株形態(tài)，按照田間觀察的方法區(qū)分結(jié)球甘藍(lán)和油菜的再生植株，即得結(jié)球甘藍(lán)植株。對(duì)比實(shí)驗(yàn)
采用結(jié)球甘藍(lán)生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株，其余方法與上述步驟相同，得到的結(jié)球甘藍(lán)植株作為對(duì)照植株。分析檢測(cè)
取再生植株的嫩葉，用美國(guó)BD公司的BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，檢測(cè)實(shí)施例植株與對(duì)照植株倍性。結(jié)果混合培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)出胚率為17. 6個(gè)/蕾，而對(duì)照結(jié)球甘藍(lán)出胚率僅為1.3 個(gè)/蕾；經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)最后得到17株結(jié)球甘藍(lán)小孢子苗，而對(duì)照結(jié)球甘藍(lán)花蕾單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照株數(shù)為3株。發(fā)明方法共培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)出胚率最高達(dá)21. 3個(gè)/蕾，而對(duì)照結(jié)球甘藍(lán)出胚率最高僅為2. 8個(gè)/蕾，經(jīng)植株形態(tài)鑒定及流式細(xì)胞儀檢測(cè)可知，在相同的條件下混合培養(yǎng)最多可以得到17株結(jié)球甘藍(lán)小孢子苗，而單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照株數(shù)為3株。用本發(fā)明的方法解決了結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生頻率低的問(wèn)題，提高了小孢子培養(yǎng)技術(shù)的利用效率。除上述實(shí)施外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，包括以下步驟步驟一，取結(jié)球甘藍(lán)和油菜花序上的花蕾進(jìn)行混合，得到甘藍(lán)和油菜的混合花蕾，進(jìn)行滅菌處理；步驟二，在滅菌后的混合花蕾中加入B5洗滌培養(yǎng)基后研磨成懸浮液，過(guò)濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀，在沉淀中加入35 45ml的NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基、8 12滴的活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液；步驟三，將小孢子混合懸浮液在黑暗條件下32 33 1熱激處理I 3天后，移至黑暗、溫度為25±2 °C的條件下培養(yǎng)20 30天，得到子葉型胚狀體；步驟四，將子葉期胚狀體接種至胚狀體固體分化培養(yǎng)基中，每天光照15±3小時(shí)、溫度 23±3°C下培養(yǎng)，直至分化，得到再生芽；步驟五，切取所述再生芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)出苗后，按常規(guī)方法進(jìn)行煉苗和移栽， 得到再生植株；步驟六，根據(jù)植株形態(tài)，按照田間觀察的方法區(qū)分結(jié)球甘藍(lán)和油菜的再生植株，即得結(jié)球甘藍(lán)植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟一中，取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾，結(jié)球甘藍(lán)花蕾的花瓣和花藥長(zhǎng)度比為0.8 I.2，油菜花蕾的花瓣和花藥長(zhǎng)度比為O. 5 O. 75。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟二中，所述的B5洗滌培養(yǎng)基由B5液體培養(yǎng)基IL和蔗糖30g組成；所述的NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基由NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130 g組成，pH 6. O 6. 2 ;所述的活性炭混合液由NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2 5g和Ig活性炭組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的 B5 液體培養(yǎng)基以 IL 計(jì)，組成為NaH2PO4·2Η20 169. 5mg, KNO3 2500mg, (NH4) 2S04 134mg, MgSO4·7Η20 500mg, MnSO4·4Η20 IOmg, H3BO3 3mg, ZnSO4·7Η20 2mg, KI 0. 75mg, Na2MoO4*2H20 0. 25mg, CuSO4*5H20 0. 025mg, CoC12*6H20 0. 025mg, Na2-EDTA 37. 3mg, FeSO4*7H20 27.8mg, CaCl2. 2H20 150mg, VB1 IOmg, VB6 lmg, VPP lmg,肌醇 IOOmg 和余量的蒸餾水；所述的NLN液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，由KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4Η20 500mg， MgSO4*7H20 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6. 2mg，MnSO4eH2O 18. 95mg，ZnSO4·7Η20 8. 6mg， Na2MoO4CH2O 0. 25mg, CuSO4AH2O 0. 025mg, CoC12WH2O 0. 025mg，維生素 BI 0. 5mg，維生素 B6 0. 5mg,生物素 0. 05mg,葉酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4·7Η20 27. 8mg,肌醇 IOOmg,甘氨酸2mg,煙酸5mg, L-谷氨酰胺800mg,谷胱甘肽30mg, VB5 5mg,絲氨酸IOOmg和余量的無(wú)菌水組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，其特征在于所述過(guò)濾得沉淀步驟進(jìn)行I 2次，所述小孢子混合懸浮液中小孢子的濃度為O. 8X IO5 I. 2X IO5 個(gè) /mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟三中，熱激處理后小孢子混合懸浮液移至避光、溫度為25±2 °C的條件下培養(yǎng)20 30天期間，當(dāng)肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)，再于相同條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟四中，所述胚狀體固體分化培養(yǎng)基由B5培養(yǎng)基1L、蔗糖20g和瓊脂10 12g組成，pH5. 8 ·6.1。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟五中生根培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基IL、蔗糖或白砂糖20 30g和瓊脂7 9g組成，pH 5. 8 6.O。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的MS 培養(yǎng)基，以 IL 計(jì)，由 NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2Η20 440 mg，KH2PO4 170 mg, MgSO4*7H20 370 mg，F(xiàn)eS04.7H20 27. 8 mg, Na2EDTA 37. 3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4.H2O 16. 9 mg, ZnSO4*7H20 8. 6 mg, Na2MoO4*2H20 0. 25 mg, CuSO4*5H20 0. 025 mg, CoC12*6H20 0. 025 mg,KI 0. 83 mg,肌醇 100 mg,甘氨酸 2 mg,煙酸 0. 5 mg,維生素 BI O. I mg,維生素 B6 0.5 mg和余量的無(wú)菌水組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高農(nóng)作物胚胎出生率的培養(yǎng)方法，尤其是一種提高結(jié)球甘藍(lán)胚胎出生率的培養(yǎng)方法，屬于植物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)將結(jié)球甘藍(lán)和油菜小孢子共同培養(yǎng)，使結(jié)球甘藍(lán)的出胚率顯著提高，解決了結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生頻率低的問(wèn)題。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577962SQ20121004724
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者姚悅梅, 張振超, 戴忠良, 潘永飛, 潘躍平, 秦文斌, 肖燕 申請(qǐng)人:江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 鎮(zhèn)江瑞繁農(nóng)藝有限公司