專利名稱：利用孢子半組培法快速繁殖蜈蚣草的方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養方法,更具體地涉及利用蜈蟻草vittata L.)孢子，通過半組培法進行快速種苗繁殖的方法。
背景技術：
蜈蟻草vittata L.)是水龍骨目鳳尾蕨科鳳尾蕨屬的多年生草本植物, 在中國主要分布在秦嶺以南的熱帶、亞熱帶地區，生于路旁、石縫或石灰巖山地，是鈣質土或石灰巖的指示植物。民間全草藥用，能祛風、殺蟲、治疳瘡；也可盆栽供觀賞。自2001年發現蜈蚣草對砷具有先天耐性和超富集能力以來，其用于科學研究和修復水體或土壤重金屬污染方面的潛在價值已吸引了科學界、環保界和企業界人士的關注。蜈蚣草可以通過根莖、孢子和孢子體植株(外植體)多種方式繁殖。蜈蚣草孢子極小，抵御外界環境能力弱，因此自然條件下萌發率低，很難獲得大規模的植物材料。陳同斌等通過組織培養的方法繁殖蜈蚣草，具體包括蜈蚣草孢子經過無菌培養獲得孢子體， 以此作為外殖體，在適當的激素條件下誘導愈傷組織，后續增殖培養、生根培養、移栽等步驟。整個過程大概需要5-6個月，并且大多數步驟涉及到激素的運用和無菌操作，使得短期內通過組織培養方法獲得大量的種苗有相當的難度。如果依靠根莖進行繁殖，繁殖系數低，要從野外獲得大量的根莖費時費力且難以保證存活率，不能滿足實際需求。蜈蚣草孢子小但數量龐大，攜帶方便且容易保存，但如何突破孢子萌發困難的瓶頸是迅速獲得大量蜈蚣草種苗的關鍵步驟。而目前，利用蜈蚣草孢子繁殖蜈蚣草的方法還很少，申請號為 200510086732. 8的中國專利公開了一種利用蜈蚣草孢子進行快速組培繁殖的方法，主要是采用特定的培養基來誘導蜈蚣草孢子出芽，發明發現采用不同的培養基時，會在較大程度上影響孢子植株產生率，當采用MS培養基時，其產生率僅〈10%，效果不理想。

發明內容
本發明的目的在針對現有技術的不足，提供一種快速繁殖蜈蚣草的方法，具體來說是利用孢子半組培法快速繁殖蜈蚣草的方法。該方法不受自然條件、地區差異或時間的限制，繁殖系數高且速度快，能大規模快速繁殖蜈蚣草種苗用于砷污染土壤的修復和其它觀賞性用途。發明將蜈蚣草孢子消毒后，接種于MS基本培養基上，在合適的條件下進行培養， 發現其可以形成極大量的配子體；配子體與適當介質混勻直接散播于土壤表面，在合適的培養條件下迅速形成大量的蜈蚣草種苗。發明首先將蜈蚣草孢子進行無菌化處理后，在培養基上培養形成配子體，將配子體播種于土壤中培養成為蜈蚣草幼苗，其中培養形成配子體的過程，是將無菌的蜈蚣草孢子接種于MS培養基上進行培養，培養溫度22 28°C，培養過程進行定期光照，光照條件為光強度200(Γ2500 Ix,每天光照12 14小時，培養5 8天即形成配子體。其中將配子體培養成為蜈蚣草幼苗的過程為將配子體在MS培養基中浸泡O.5 1. 5小時，播種于土壤表面，并進行表面覆膜，自然光照條件下培養3飛天。在該培養過程中每天噴水1-5次；培養溫度為22 25 °C，空氣濕度6(Γ80%。發明優選采用以下方案進行
O孢子無菌化處理
選擇成熟的蜈蚣草孢子，以O. 1% HgCl2S消毒劑，消毒Γ8分鐘；或以5% NaClO為消毒劑，消毒8 12分鐘，而后均以無菌水沖洗4-8次，獲得無菌的的孢子懸濁液。2)蜈蚣草孢子的萌發(配子體(原葉體)的形成)
無菌的孢子懸濁液接種于MS基本培養基上(優選1/2 MS),培養溫度22 28°C，光強度 2000^2500 lx，光照時間12 14小時/天。孢子萌發而后形成原葉體。若要獲得更大量的配子體，可將已形成的配子體轉接到新的MS培養基上。3)孢子體的形成
配子體在1/10 MS中分散O. 5^1. 5小時后，散播于土壤中，表面覆膜，并且每天噴水1-5 次(一般持續7天)。自然光照條件下培養，溫度22 25 °C，空氣濕度6(Γ80%。約一周后在原葉體上會有孢子體幼苗產生。與現有技術相比，本發明具有以下突出效果
I)縮短蜈蚣草繁殖周期和簡化了操作步驟，成活率高。本發明的半組培方法既突破了蜈蚣草繁殖時孢子萌發慢及萌發率低的問題，又簡化了使用植株作為外植體進行組織培養時激素誘導、移栽、煉苗等繁瑣工序，僅孢子形成配子體這一步需要在一般無菌室內操作，其余步驟均在正常條件下進行，因此可簡便、快速、 大量繁殖As超富集植物蜈蚣草。利用優化方案僅Γ2個月就能繁育出大量種苗，移栽時由于其生活條件改變不大，成活率大于90%。2)繁殖系數大幅提高。利用優化的組培條件，孢子在一周內即可在培養基上萌發，并且萌發率達70%以上。3-4周就可形成配子體，如需要進一步擴大配子體，僅需將少量配子體轉接到新的培養基上，即可在1-2周形成大量的配子體，增殖系數超過100。配子體散播到土壤中后，在適當的光照和水份條件下，1-2周內即有超過50%的配子體會形成孢子體幼苗(孢子體植株)。
具體實施例方式以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案。實施例I蜈蚣草孢子無菌化處理
取成熟的蜈蚣草孢子，以O. 1% HgCl2為消毒劑，消毒1、2、4、6、8分鐘；和以5% NaClO 為消毒劑，消毒3、6、8、10、12分鐘，而后均以無菌水沖洗4-8次，獲得無菌的的孢子懸濁液。將上述處理下的無菌孢子懸濁液接種于MS基本培養基上，培養溫度2(T25 °C，光強度 1500^3000 lx，光照時間12 14小時/天，14天后觀察每個處理的染菌情況。實驗結果表明， 以O. 1% HgCl2消毒4-8分鐘或以5% NaClO消毒8_12分鐘，染菌率均低于20%。當以O. 1% HgCl2消毒6分鐘或以5% NaClO消毒10分鐘，染菌比例最低，低于10%。實施例2蜈蚣草孢子的萌發
將以上述最優條件滅菌過的蜈蚣草孢子，接種到不同比例的MS培養基(MS、1/2 MS、1/5 MSU/10 MS、無MS)，在不同的光強度(1000、1500、2000、2500、3000 Ix)和不同光照時間(8、10、12、14、16、18小時/天)下，14天后觀察每個處理的染菌情況和孢子萌發的情況。結果表明，這些培養基上3飛天均出現肉眼可見的綠色小點，表明孢子已經萌發，不同培養條件下萌發率均達到90%以上(隨機在培養基上接種孢子30處，以5天內培養基上出現綠點占總接種數的比例計)，但光強度200(Γ2500 lx，光照時間12 14小時/天下萌發率較其它條件略高(表I)。在以上培養基上，兩周內均出現配子體(原葉體)。無MS的所有光照培養條件下，配子體的增殖情況都很差。在1/2 MS培養基上，以及在光強度200(Γ2500 lx，光照時間12 14小時/天下，配子體的生長狀況最好和增殖速度最快，增殖系數平均值達到105。 在不同的實驗條件下接種同樣數量的配子體在培養基上，2周后通過接種前后重量的比較確定增殖系數，如表2所示
權利要求
1.利用孢子半組培法快速繁殖蜈蚣草的方法，將蜈蚣草孢子進行無菌化處理后，在培養基上培養形成配子體，將配子體播種于土壤中培養成為蜈蚣草幼苗，其特征在于所述的培養形成配子體的過程，是將無菌的蜈蚣草孢子接種于1/2 MS培養基上進行培養，培養溫度22 28°C，培養過程進行定期光照，光照條件為光強度200(Γ2500 Ix,每天光照12 14小時，培養51天即孢子萌發形成配子體。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述的MS培養基為1/2MS培養基。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述的培養成為蜈蚣草幼苗的過程為將配子體在1/10 MS培養基中浸泡O. 5" . 5小時,播種于土壤表面,并進行表面覆膜，自然光照條件下培養3飛天。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述的MS培養基為1/10MS培養基。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述培養過程中每天噴水1-5次。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述的培養溫度為22 2 5 °C，空氣濕度 60 80%。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述的無菌化處理是以0.1%HgCl2為消毒劑，消毒4、分鐘。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述的無菌化處理以5%NaClO為消毒劑，消毒8 12分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種利用孢子半組培法快速繁殖蜈蚣草的方法，將蜈蚣草孢子進行無菌化處理后，在培養基上培養形成配子體，將配子體播種于土壤中培養成為蜈蚣草幼苗；培養形成配子體的過程，是將無菌的蜈蚣草孢子接種于1/2MS培養基上進行培養，培養溫度22~28℃，培養過程進行定期光照，光照條件為光強度2000~2500lx，每天光照12~14小時，培養5~8天即孢子萌發形成配子體；將配子體培養成為蜈蚣草幼苗的過程為將配子體在1/10MS培養基中浸泡0.5-1.5小時，播種于土壤表面，并進行表面覆膜，自然光照條件下培養3~5天。本發明的培養方法可以縮短蜈蚣草繁殖周期和簡化了操作步驟，成活率高，并且繁殖系數大幅提高。
文檔編號A01H4/00GK102577971SQ201210061170
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日
發明者周密, 廖斌, 李金天, 束文圣, 楊兵 申請人:中山大學