專利名稱：水稻雌性不育基因及其在雜交水稻制種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻雜交制種，特別涉及一種導(dǎo)致水稻麥狀葉與雌性完全不育表型的蛋白質(zhì)及其基因，本發(fā)明還涉及利用該基因構(gòu)建的恢復(fù)系及對恢復(fù)系后代進(jìn)行檢測篩選的方法，以及該恢復(fù)系在雜交水稻機(jī)械混播制種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
有性生殖是植物傳種接代的主要方式，也是培育作物新品種的重要途徑，由此而產(chǎn)生的種子和果實是人類賴以生存的主要糧食來源。作物雜交具有旺盛的雜種優(yōu)勢和巨大的增產(chǎn)潛力，雜種優(yōu)勢的利用是發(fā)展糧食生產(chǎn)的必然趨勢。過去幾十年來，以有性生殖為基礎(chǔ)的雜交育種為農(nóng)作物產(chǎn)量提高做出了巨大貢獻(xiàn)。水稻作為我國第一大糧食作物，約占糧食總產(chǎn)量的40%。稻米是我國人民賴以生存的主食，水稻生產(chǎn)不僅擔(dān)負(fù)確保我國糧食安全 的重任，并肩負(fù)實現(xiàn)種糧增效、稻農(nóng)增收和全面推進(jìn)新農(nóng)村建設(shè)的重大使命，也是新階段我國農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的中心任務(wù)之一。人口增加和耕地減少是我國的基本國情，預(yù)計到2030年，我國人口將達(dá)到16億，我國農(nóng)作物的單產(chǎn)需在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上提高50%以上才能滿足糧食的安全供給。然而，自花授粉作物雜種優(yōu)勢的利用難度極大，只能通過“三系”或“兩系”的配套進(jìn)行種子生產(chǎn)。袁隆平院士發(fā)明的“三系”雜交稻是指雄性不育系、保持系和恢復(fù)系三系配套育種(袁隆平.雜交水稻超高產(chǎn)育種.雜交水稻，1997，12 ￠) :126.)。雄性不育系即一種雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉無生活力，不能自花授粉結(jié)實；再用保持系使這種不育系能不斷繁殖，不至于絕種；再育成恢復(fù)系，使不育系育性得到恢復(fù)，自交結(jié)實并產(chǎn)生雜種優(yōu)勢。后來提出的“兩系”雜交稻即沒有保持系，其育性轉(zhuǎn)換與日照長短和溫度高低有密切關(guān)系，分為光敏和溫敏兩種類型。袁隆平院士對此有一個形象的比喻三系法像包辦婚姻，兩系法是自由戀愛。目前兩系雜交稻占雜交稻種植的20%左右，三系雜交稻占70% 80%。一般情況下，為了增強(qiáng)雜種優(yōu)勢，每個雜交組合的父母本性狀差異都很大。進(jìn)行雜交種子生產(chǎn)(由不育系與恢復(fù)系雜交，俗稱制種)時需按各個組合父母本的生育特性，植株高矮及抽穗季節(jié)的風(fēng)向，確定合理的父母本株行比例。制、繁種時父母本必須按行或分條塊種植，加上自花授粉作物花粉量少、傳粉距離短、開花時間集中，導(dǎo)致了異交結(jié)實率低、種子成本高，一定程度上限制了自花授粉作物雜種優(yōu)勢利用的發(fā)展速度。其次，無論是繁種(不育系種子繁殖，由不育系與保持系雜交，俗稱繁種)，還是制種，父本自交產(chǎn)生的種子均不能混入母本所產(chǎn)的異交種子中，否則就會造成重大的種子純度問題。因此，到目前為止，雜交稻種子的生產(chǎn)很難完全適應(yīng)機(jī)械化作業(yè)，雜交種子的成本居高不下(朱啟升，王安東，楊前進(jìn)，等.水稻除草劑敏感基因的研究與利用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，28 (2) :141-142;朱啟升.雜交水稻混播制種技術(shù)研究進(jìn)展.作物研究，2004，4 :204-207 ;朱啟升，王安東，楊前進(jìn)，等.水稻除草劑敏感基因?qū)牖謴?fù)系的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，15 (3) :5-6.)。如何解決“三系” “兩系”雜交稻種子純度問題一直是一個世界難題，既是科研人員攻關(guān)的難點，也是種子企業(yè)關(guān)心的焦點、農(nóng)民擔(dān)心的疑點。袁隆平院士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組運(yùn)用白化標(biāo)記育種的新技術(shù)嘗試解決這個難題，他們將白化標(biāo)記基因?qū)胨静挥蹬c保持系，可在苗期識別白化的不育系與保持系雜株，簡化雜交水稻種子純度鑒定工作，使雜交水稻種子純度風(fēng)險下降為零。但該方法并不能夠在制種源頭上保證種子的純度，只有在雜交種子賣給農(nóng)民，播種后才能夠發(fā)現(xiàn)并去除雜苗，還是增加了人力成本，也降低了種子的可靠性和信譽(yù)，目前該方法并沒有在實際生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。水稻“三系” “兩系”雜交稻種子制種技術(shù)性強(qiáng)，人工成本高，勞動效益降低，制種面積逐年萎縮。水稻制種不僅對生產(chǎn)條件要求較高，而且對整地播種、水肥管理、化學(xué)調(diào)控、趕花授粉、育秧收曬等技術(shù)要求較高。由于農(nóng)村勞動力大量轉(zhuǎn)移，適于水稻制種的青壯勞動力逐步減少，一般的老人、婦女、兒童難以較好地承擔(dān)，一旦生產(chǎn)條件不適合、技術(shù)措施不到位或遭遇不利天氣，就會影響制種產(chǎn)量和種子質(zhì)量，給制種農(nóng)戶和種子企業(yè)造成很大損失。另一方面，制種基地難上規(guī)模，難以連片，難以管理，而且伴隨著基地整體素質(zhì)偏低、生產(chǎn)成本被動提升、制種比較效益低等負(fù)面因素，導(dǎo)致水稻制種成本增高，勞動收益率降低。近幾年全國范圍內(nèi)雜交稻制種面積減少30多萬畝。農(nóng)業(yè)部預(yù)測，雜交稻種子市場供應(yīng)將由充足有余向供應(yīng)偏緊狀況轉(zhuǎn)變，并且各地制種規(guī)模將出現(xiàn)逐年下降趨勢。 水稻“三系” “兩系”雜交稻種子制種難以實現(xiàn)機(jī)械化。我國現(xiàn)行雜交水稻制種技術(shù)，自播種至收獲完全依靠人工操作，父母本分期播種，先栽父本，后栽母本，工序繁雜，整個制種過程需要足夠的勞動力做保證，只適宜在勞動密集型的農(nóng)村推廣應(yīng)用，大型農(nóng)場因缺少足夠的勞動力而不能制種。安徽省農(nóng)科院綠色食品所報道過“混播制種”雜交水稻育種方法(張德文，楊前進(jìn)，王士梅，汪婉琳，朱啟升.混制I號機(jī)械化混播制種生產(chǎn)技術(shù).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，2008，24 (10) 66-69 ;張德文，陳多璞，楊前進(jìn)，等.不同時期噴施苯達(dá)松對“混制I號”制種產(chǎn)量的影響 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35 (11) :3212-3213. 3215.)。經(jīng)過安徽省農(nóng)業(yè)專家測評，由于混播使得花粉利用率高，該技術(shù)培育出的雜交一代，畝產(chǎn)達(dá)到了 400多公斤，比中國現(xiàn)行的制種技術(shù)增產(chǎn)40%以上。而安徽省農(nóng)科院綠色食品工程研究所改變了此種傳統(tǒng)的雜交水稻種子生產(chǎn)方法，在我國首次提出選育能進(jìn)行混播制種且可以進(jìn)行機(jī)械收割的強(qiáng)優(yōu)勢雜交水稻組合，創(chuàng)立了嶄新的雜交水稻種子生產(chǎn)技術(shù)。通過生物技術(shù)首次發(fā)明了攜帶苯達(dá)松敏感基因的水稻父本(恢復(fù)系)。在生產(chǎn)種子時,改變過去父母本分開播種栽插的繁瑣方法，采用父母本一次混合播種，或拋秧、或機(jī)插、或直播，簡化栽插工序，在完成授粉后通過改變環(huán)境條件(噴施苯達(dá)松)使父本死亡，而未攜帶該基因的母本則可正常生長，最后進(jìn)行機(jī)械化收割。然而該方法中苯達(dá)松噴施時間和劑量很容易受到外界環(huán)境的影響，很容易發(fā)生恢復(fù)系“殺不徹底”，引起種子純度問題，而且苯達(dá)松本身對環(huán)境有一定的污染，同時也增加制種成本。由于以上原因，目前還沒有企業(yè)或農(nóng)場大規(guī)模應(yīng)用該方法。Maruyama提出了選育具有恢復(fù)力的雌性不育系來解決上述問題(Maruyama, K.,RKato and H. Araki. Mechanized production of Fl seeds in rice by mixed planting.JARQ 1991. 24 :243-252.)，在文中Maruyama提出雜交制種時，將母本和父本混播提高授粉率，然后通過種子顏色、大小或者其他特征來分離Fl雜交種子和父本可育后代。同時也設(shè)想用雌雄全不育的父本來混播制種的思路。但限于當(dāng)時的技術(shù)水平和實驗材料，這個想法沒有實現(xiàn)。農(nóng)業(yè)是整個國家的基礎(chǔ)，種子是農(nóng)業(yè)的基礎(chǔ)，種子供種安全是國家農(nóng)業(yè)安全的重中之重。粳稻“三系” “兩系”雜交稻種子制種技術(shù)急需突破。我們國家雜交水稻面積占水稻總面積的57%，主要在南方。北方種的是粳稻，南方種的是秈稻，秈稻是大頭，4億多畝里面有3億多畝種的是秈稻，占四分之三。現(xiàn)在雜交水稻里面，主要是雜交秈稻。現(xiàn)在在北方，雜交水稻還很少。如果雜交粳稻突破了，很可能雜交稻的面積會達(dá)到80%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是為雜交水稻制 種提供雌性完全不育的水稻突變體育種材料，同時以該材料為親本改造雜交水稻恢復(fù)系，并利用改造好的恢復(fù)系進(jìn)行混播雜交制種。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種具有葉片下垂、雌性完全不育表型的水稻突變體，命名為sfsl，其雌性不育是由于外珠被異常增生細(xì)胞堵塞珠孔而不能完成受精引起。遺傳分析表明該突變是一個單基因控制的隱性突變，申請者通過圖位克隆方法確定了突變基因，是0s03g0215200基因第二個外顯子(exon)的第8位胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸(T)突變?yōu)榘奏っ撗鹾颂呛塑账?C)，使得該基因編碼的DROOPING LEAF蛋白的第26位氨基酸殘基從野生型的纈氨酸(Val)突變?yōu)楸彼?Ala)。本發(fā)明導(dǎo)致水稻葉片下垂(麥狀葉)、雌性完全不育表型的基因編碼序列表中SEQID NO :1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO: I氨基酸序列由194個氨基酸殘基組成，其第26位氨基酸殘基從野生型的纈氨酸(Val)突變?yōu)楸彼?Ala)。編碼上述蛋白質(zhì)的基因可以是所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列。所述基因的cDNA序列如序列表中SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，第77位堿基由野生型的胸腺嘧啶(T)突變?yōu)榘奏?C)。本發(fā)明的另一個目的是提供一種構(gòu)建新型雜交水稻恢復(fù)系的方法，該方法包括以具有麥葉狀和雌性完全不育表型的水稻突變體sfsl為原始父本親本，與現(xiàn)有高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)、廣適型恢復(fù)系(例如秈稻明恢63,粳稻嘉恢30、嘉恢52和嘉恢69)雜交,通過輪回雜交，高代純合，篩選具有高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)、廣適型、雌性完全不育的新型恢復(fù)系。本發(fā)明的又一個目的是提供一種對所獲得的新型恢復(fù)系進(jìn)行檢測的方法。可以利用水稻基因組DNA提取技術(shù)和PCR、酶切、電泳技術(shù)快速檢測帶有sfsl突變位點植株，具體是首先提取水稻基因組DNA，然后以基因組DNA為模板，通過下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增DL-HinfI-F :5' -GACAGTGCCATGCAACAA-3'DL-HinfI-R :5' -GGCCACATTTCACGGTCA-3'擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶HinfI酶切后進(jìn)行電泳檢測，全長PCR產(chǎn)物是149bp，野生型的PCR產(chǎn)物會被切成129bp和20bp兩個條帶。通過電泳檢測結(jié)果對恢復(fù)系基因型進(jìn)行鑒定被切為129bp和20bp兩個條帶的為野生型；只有149bp單一條帶的為sfsl突變體；具有149bp、129bp和20bp三個條帶的為雜合體。本發(fā)明的又一個目的是提供一種雜交水稻的制種方法，通過sfsl雜交改造所獲得的高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)、廣適型、雌性完全不育的新型恢復(fù)系(具有SfSl突變位點的恢復(fù)系)作為父本，可以利用其與雄性不育系母本進(jìn)行混播雜交制種，提高雜交制種產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的雄性完全可育、雌性完全不育突變體sfsl，其雌性完全不育表型是由于子房珠被增生一層細(xì)胞，產(chǎn)生物理屏障堵塞珠孔引起。該表型為隱性遺傳，通過配種繁育，獲得雌性完全不育的恢復(fù)系，將雌性不育特性用在雜交水稻制種上。在雜交種子生產(chǎn)時實行混播，以縮小父母本的傳粉距離，提高異交結(jié)實率，降低種子成本并可確保極高純度的種子質(zhì)量。這不僅提高制、繁種產(chǎn)量、降低種子生產(chǎn)成本和確保所產(chǎn)雜交種子的純度，而且完全實現(xiàn)雜交水稻種子的機(jī)械化生產(chǎn)和輕型栽培。另一方面突變體在表現(xiàn)雌性不育的同時，中上部葉片在葉環(huán)處彎曲倒掛的“麥狀葉”特征，是雜交水稻工作者多年尋求的目標(biāo)，這種上層葉片自然彎下又表現(xiàn)為隱性遺傳的性狀，轉(zhuǎn)到雜交稻親本上，就可減少制、繁種時傳粉的阻擋，提高制種產(chǎn)量，并降低勞動成本。因此，本發(fā)明所述突變基因和雌性不育恢復(fù)系將在雜交水稻改良中發(fā)揮巨大作用。


圖I是sfsl突變體和野生型植株的表型比較圖，其中A顯示的是抽穗前外觀表型；B顯示的是成熟后外觀表型；C-F顯示的是雌蕊掃描電鏡外觀表型；G-J顯示的是水稻花粉管萌發(fā)實驗結(jié)果。圖2是sfsl突變體和野生型的胚珠發(fā)育過程的組織切片圖，其中左邊為野生型， 右邊為sfsl突變體。圖3A是sfsl突變體的突變位點在染色體上的位置模式圖；圖3B是具有麥狀葉、雌性不育表型植株和野生型植株的共分離電泳圖(內(nèi)切酶為HinfI)，其中泳道I是以野生型植株DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切電泳圖；泳道2是以人工雜合體(野生型和麥狀葉DNA I I混合)為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切電泳圖；泳道3是以麥狀葉植株DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切電泳圖。圖4是本發(fā)明突變株的恢復(fù)系和正常恢復(fù)系的植株照片，其中A為帶有sfsl突變位點的恢復(fù)系為正常的恢復(fù)系。圖5顯示了以本發(fā)明恢復(fù)系為父本的混播制種方式，其中A是混播制種示意圖；B是混播制種實際操作圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不因此限制本發(fā)明的范圍。實施例一、sfsl突變體的表型分析I.突變體的獲得2005年我們在海南省陵水縣嘉興市農(nóng)科院水稻南繁育種基地早秈稻(Oryzasativa. L. Indica)雜交選種圃第308號(早秈X早秈F5)株系中發(fā)現(xiàn)的一例水稻雌性不育突變體(初步命名為fs308)。該突變體是早秈常規(guī)品種雜交后代中自然產(chǎn)生的雌性不育突變體,經(jīng)過多次雜合體自交純化后保存種質(zhì)(后改命名為sfsl)。2.突變體的表型sfsl突變體具有3個顯著特點1)中上部葉片在葉環(huán)處彎曲、倒掛，呈現(xiàn)出“麥狀葉”特征(圖1A)。2)雌蕊徹底敗育，自交或人工輔助授粉均不結(jié)實，不育率100% (圖1B);3)雌蕊柱頭乳突狀組織減少、花柱中部融合(圖1C，D);進(jìn)一步的花粉管萌發(fā)實驗表明，突變體中花粉管伸長受到抑制(圖II，J)。sfsl突變體雄蕊發(fā)育正常，6個花藥齊全，花粉生活力良好，與其他雌性正常的水稻雜交，均可結(jié)實(圖1H)。通過切片觀察胚珠的發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)外珠被異常增厚(圖2，D，F(xiàn)，H，G);此外，該突變體的雌性不育和雄性可育性均不受環(huán)境條件影響，浙江、海南不同地域、不同季節(jié)等生態(tài)條件，都表現(xiàn)非常穩(wěn)定。二、sfsl突變體表型的遺傳學(xué)行為在嘉興、海南兩地將sfsl突變體與秈亞種“嘉育293”、“明恢63”，與粳亞種“嘉991”、恢復(fù)系“嘉恢32”雜交，配制的不同秈粳雜交組合，觀察雜交后代F1 F3的表型，發(fā)現(xiàn)sfsl突變體麥狀葉和雌性全不育表型完全連鎖，屬于同一個基因突變引起的不同表型(表I)。而且F1代中沒有麥狀葉和不育表型，說明突變是由一個隱性基因控制(表I)。F2代中直立葉可育植株和麥狀葉不育植株比符合經(jīng)典的3 I分離比，說明突變是由單個核基因控制的隱性突變(表I)。表I. sfsl麥狀葉和育性遺傳學(xué)分析
卒補(bǔ)入植株數(shù)量2a
__可育直立葉j不育麥狀葉 X
Fi 嘉優(yōu) 293(秈稻)$ xsfsJ^__64__0__
Bi 嘉優(yōu) 293$__200__0__
Bi Y x^sfsl $__101__99__
F2 嘉優(yōu) 293$xsfsl$__1504__496__0.033
Fi明恢 63(indica)S><sfsliS640BiF1 X 矽鮮對__200__0__
Bi__100__100__
F2明恢 63$xsfsl<S__1503__497__0.017
F1嘉 991(粳稻y^sfsl$__64__0__
BiFig__200__0__
BiS__100__100__
F2M 99 l^xsfsl S__1502__498__0.06
F1 嘉恢 32(粳稻)$ Xsfsl^__64__0__
Bi 秘 \Jiahui323__200__0__
Bi Figx^y^__101__99__
F2 嘉恢 32$xsfsl$__1499__501__0.001
X2檢測按直立葉麥狀葉為3:1期望值。_三、突變基因的圖位克隆遺傳分析表明該突變是一個單基因控制的隱性突變，申請者通過圖位克隆方法來確定突變基因。由于Sfsl是秈稻背景，首先構(gòu)建了 “sfsl突變體”和粳稻背景的“嘉991”雜交組合，F(xiàn)2代植株出現(xiàn)表型分離，表現(xiàn)出正常葉片和麥狀葉3 I的分離比。利用CTAB法提取F2代植株中具有麥狀葉表型單株葉片基因組DNA，利用實驗室已經(jīng)建立的圖位克隆方法進(jìn)行初定位分析，發(fā)現(xiàn)突變位點定在水稻第三號染色體長臂中上部，5452kb到6757kb范圍內(nèi)。根據(jù)秈粳稻序列多態(tài)性，繼續(xù)在interval內(nèi)設(shè)計新的引物，經(jīng)過幾輪精細(xì)定位，將突變位點縮小在5993kb到6025kb約32kb的范圍內(nèi)，里面僅包括3個基因(圖3A)。對這3個基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)在基因0s03g0215200的第二個外元(exon)第8位堿基由胸腺嘧啶(T)突變?yōu)榘奏?C)，導(dǎo)致0s03g0215200編碼蛋白DROOPING LEAF第26位纈氨酸(Val)突變?yōu)楸彼?Ala)(圖3A)。因為該突變剛好破壞了一個HinfI酶切位點，所以，設(shè)計DL-HinfI-F/DL-HinfI-R引物跨過該突變位點，對PCR產(chǎn)物用HinfI酶切電泳。發(fā)現(xiàn)野生型能切出兩條帶，凡是具有麥狀葉、雌性不育表型植株只有一條帶，而雜合體具有三條帶(圖3B)。說明該突變和表型完全連鎖，說明的確是由于該突變引起了突變體表型。已有報道表明DROOPING LEAF蛋白的多種突變都能導(dǎo)致葉片下垂，出現(xiàn)麥狀葉表型，但麥狀葉表型與雌性不育的相關(guān)性尚未見報道(Nagasawa，N. et a I. SUPERWOMAN I andDROOPING LEAF genes control floral organ identity in rice.Development,2003,130,705-18 ；Yamaguchi, T. et al. The YABBY gene DROOPING LEAF regulates carpelspecification and midrib development in Oryza sativa. Plant Cell,2004,16,500-9 ;Ohmori, Y. , Abiko, M. ,Horibata,A. &Hirano,H. Y. Atransposon,Ping,is integrated int ointron 4 of the DROOPING LEAF gene of rice, weakly reducing its expression andcausing a mild drooping leaf phenotype.Plant Cell Physiol,2008,49,1176-84.)。I) 0s03g0215200 基因相關(guān)信息基因組DNA全長7440bp，CDS全長585bp，蛋白序列全長194氨基酸。CDS第77bp胸腺嘧啶⑴突變?yōu)榘奏?C)(見SEQ ID No :2)，相應(yīng)的蛋白序列第26位纈氨酸(Val)突變?yōu)楸彼?Ala)(見SEQ ID No :1)。2)共分離CAPS弓丨物信息如下DL-HinfI-F :5' -GACAGTGCCATGCAACAA-3'DL-HinfI-R :5' -GGCCACATTTCACGGTCA-3'全長PCR產(chǎn)物是149bp，用內(nèi)切酶Hinf I酶切后，野生型被切出129bp和20bp的條帶，突變體不能被酶切仍然是149bp，雜合體就具有三條帶，見圖3B。四、基于sfsl突變體改造恢復(fù)系以sfsl突變體為父本，與目前生產(chǎn)應(yīng)用的高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)、廣適應(yīng)性秈稻/粳稻恢復(fù)系進(jìn)行雜交，在F2代中篩選具有麥狀葉表型單株，接著與已有恢復(fù)系進(jìn)行回交，篩選。回交6代后，得到具有麥狀葉、雌性完全不育、高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)、廣適應(yīng)性新型秈稻/粳稻恢復(fù)系(圖4)。在此基礎(chǔ)上，再與已有恢復(fù)系回交一代，收集回交7代(B7)的雜交種子，作為新型秈稻/粳稻恢復(fù)系種質(zhì)保存。將B7代種下去，提取葉片直立植株的DNA，通過PCR鑒定，篩選雜合體種質(zhì)并保存。五、新型恢復(fù)系混播制種將雄性不育系種子通過直播方式，散播在平整好的稻壟上。同時，對新型秈稻/粳稻恢復(fù)系雜合體種子在拋秧盤上按行點播，待長出3片真葉，對小苗編號，提取葉片DNA，PCR鑒定帶有sfsl位點的純合體。將確定好的新型恢復(fù)系純合體以拋秧方式按I : 6的比例種植于雄性不育系中(圖5A右圖)。以傳統(tǒng)父本、母本分行播種(圖5A左圖)制種方式為對照一，同時以已有恢復(fù)系采用拋秧混播(圖5A右圖)制種為對照二。待水稻長到幼穗分化期，新型恢復(fù)系的“麥狀葉”表型出現(xiàn)(圖5B)。水稻揚(yáng)花期，進(jìn)行簡單的人工輔助趕粉。種子成熟后，收割烤干稱重，統(tǒng)計最終結(jié)果。結(jié)果表明，以新型恢復(fù)系(改良嘉興優(yōu)04-1)為父本的組合(表2第4行)比傳統(tǒng)分行制種(表2第I行)增產(chǎn)約25%。盡管已有恢復(fù)系組合也有約18%的增產(chǎn)(見表2第3行)，但是由于已有恢復(fù)系本身種子可育，混播收種后，雜交種子混有大量的恢復(fù)系種子，因而不能使用(表2)。表2.新型恢復(fù)系混播制種結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種導(dǎo)致水稻麥狀葉與雌性完全不育表型的蛋白質(zhì)，其特征在于，它是序列表中SEQID NO 1所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo 2所示。
4.一種構(gòu)建雜交水稻恢復(fù)系的方法，以具有麥狀葉與雌性完全不育表型的水稻突變體sfsl為原始親本父本，與現(xiàn)有恢復(fù)系雜交，通過輪回雜交、高代純合，篩選出雌性完全不育的新型恢復(fù)系，其中所述水稻突變體sfsl的0s03g0215200基因編碼的蛋白質(zhì)序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。
5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建雜交水稻恢復(fù)系的方法，其特征在干，所述水稻突變體sfsl的0s03g0215200基因的CDS序列如序列表中SEQ ID No 2所示。
6.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建雜交水稻恢復(fù)系的方法，其特征在干，所述現(xiàn)有恢復(fù)系選自秈稻明恢63，粳稻嘉恢30、嘉恢52和嘉恢69中的ー種。
7.一種對通過權(quán)利要求4所述方法構(gòu)建的雜交水稻恢復(fù)系進(jìn)行基因型檢測的方法，包括提取水稻基因組DNA，然后以基因組DNA為模板，通過以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增DL-HinfI-F :5' -GACAGTGCCATGCAACAA-3'DL-HinfI-R :5' -GGCCACATTTCACGGTCA-3' 擴(kuò)增產(chǎn)物全長149bp，用內(nèi)切酶HinfI酶切后進(jìn)行電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被切為129bp和20bp兩個條帶的為野生型；只有149bp單一條帶的為sfsl突變體；具有149bp、129bp和20bp三個條帶的為雜合體。
8.一種雜交水稻制種方法，以具有sfsl突變位點的恢復(fù)系為父本，雄性不育系為母本，父本和母本混播制種，其中所述具有sfsl突變位點的恢復(fù)系的0s03g0215200基因編碼的蛋白質(zhì)序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，呈麥狀葉與雌性完全不育表型。
9.如權(quán)利要求8所述的雜交水稻制種方法，其特征在于，所述具有sfsl突變位點的恢復(fù)系的0s03g0215200基因的CDS序列如序列表中SEQ ID No 2所示。
10.如權(quán)利要求8所述的雜交水稻制種方法，其特征在于，所述父本和母本的混播種植比例為I : 6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻雌性不育基因及其在雜交水稻制種中的應(yīng)用。水稻Os03g0215200基因第二個外顯子的第8位核苷酸殘基由T突變?yōu)镃，獲得葉片下垂、雌性完全不育表型的水稻突變體，命名為sfs1，其雌性不育是由于外珠被異常增生細(xì)胞堵塞珠孔而不能完成受精引起。利用該水稻突變體為父本，與現(xiàn)有恢復(fù)系雜交，通過輪回雜交、高代純合，篩選出雌性完全不育的新型恢復(fù)系。基于該恢復(fù)系與雄性不育系母本混播制種，不僅可以提高制、繁種產(chǎn)量、降低種子生產(chǎn)成本和確保所產(chǎn)雜交種子的純度，而且可完全實現(xiàn)雜交水稻種子的機(jī)械化生產(chǎn)和輕型栽培。
文檔編號A01H1/02GK102731635SQ201210096970
公開日2012年10月17日 申請日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者劉敬婧, 李林川, 李金軍, 瞿禮嘉, 高榮村 申請人:北京大學(xué)