專利名稱：一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的應用。
背景技術：
辣椒疫病是一種發生于辣椒上的毀滅性真菌病害，該病害可以導致不同地區的多種作物發病，引起大量的經濟損失。辣椒疫病典型的癥狀特征植株被侵染后幾天就發生根莖部組織腐爛直至大量植株死亡。到目前為止，生產中還沒有對辣椒疫病很好的抗性品種。目前，國內外對辣椒疫病的防治中，化學防治占據重要的地位。化學防治成本較高且易污染環境，而且病原物易對殺菌劑產生耐藥性甚至抗藥性。所以生物防治逐漸成為人們所關注的焦點和熱點。

發明內容
本發明的目的是提供一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的應用。本發明提供的哈茨木霉(Trichodermaharzianum) HNA-12,已于 2012 年 04 月 11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5989。哈茨木霉(Trichoderma harzianum) HNA-12CGMCC No. 5989 簡稱哈茨木霉 HNA-12。所述哈茨木霉HNA-12可用于抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)。所述哈茨木霉HNA-12可用于促進辣椒植株生長。所述哈茨木霉HNA-12可用于防控辣椒植株發生辣椒疫病。本發明還保護一種產品，它的活性成份為所述哈茨木霉HNA-12，所述產品為具有如下(I)至(3)中的至少一種功能的產品(I)抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；(2)促進辣椒植株生長；(3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。本發明還保護哈茨木霉HNA-12在制備產品中的應用；所述產品為具有如下(I)至
(3)中的至少一種功能的產品(I)抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；(2)促進辣椒植株生長；(3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。
本發明還保護所述哈茨木霉HNA-12的孢子液或發酵物。所述孢子液具體可為5 X IO6個孢子/mL的孢子懸浮液。所述發酵物可為固體發酵物或液體發酵物。所述液體發酵物的制備方法具體如下收集哈茨木霉HNA-12孢子，接種到含有種子培養基的發酵罐中，發酵后得到濃度為2. 5X 108CFU/mL的液體發酵物(種子液)；所述發酵的條件為溶解氧濃度20%左右，溫度28-30°C，攪拌速度200-250r/min，通氣量為10-15L/min。所述種子培養基(pH6. 0-6. 5)由溶質和水組成；所述溶質在種子培養基中的濃度如下麥麩2g/100mL、葡萄糖I. 0g/100mL、硫酸鎂O. 5g/100mL、磷酸二氫鉀O. 3g/100mL、氯化鈣 O. 3g/100mL。所述固體發酵物的制備方法具體如下將所述液體發酵物與固體培養基混合均勻 (每克混合物中含有I. 5 X IO6CFU哈茨木霉HNA-12)，然后進行發酵，然后風干至7_10%，得到固體發酵物；所述發酵的條件為溫度28-30°C，空氣相對濕度95-100%，培養基厚度5-7cm，培養時間5-7天。所述固體培養基是將麥麩和稻殼和水混合得到的，麥麩和稻殼的質量比為7 :3，固體培養基的含水量為70%左右，pH6. 0-6. 5 ;121°C滅菌30min。所述孢子液或所述發酵物的應用，為如下(I)至(3)中的至少一種(I)抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；( 2 )促進辣椒植株生長；( 3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。本發明還保護一種產品，它的活性成份為所述孢子液或所述發酵物；所述產品為具有如下(I)至(3)中的至少一種功能的產品(I)抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；( 2 )促進辣椒植株生長； (3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。本發明還保護所述孢子液或所述發酵物在制備產品中的應用；所述產品為具有如下(I)至(3)中的至少一種功能的產品(I)抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；( 2 )促進辣椒植株生長；( 3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。本發明提供的哈茨木霉HNA-12，經室內對峙拮抗實驗、盆栽防治實驗和大田防治試驗發現，該菌株對多種病原菌(特別是辣椒疫病菌)具有良好的抑菌效果，并且利用木霉菌制劑防治植物病害具有對人畜無毒、產品無農藥殘留、不污染環境等優點。本發明在可持續農業發展中應用前景廣闊。本發明的社會效益推廣應用生物農藥可以保護生態環境平衡發展，提高農產品品質及降低農產品中有害物質殘留，增強農產品的市場競爭力，增加農民收入，進而增強農業生產的可持續性。本發明的經濟效益推廣應用生物制劑可減少化學農藥的使用量，能提高疫病防治效果，降低防治成本；能有效實現農產品安全生產及顯著降低農產品農藥殘留，提升農產品的經濟附加值，擴大我國農副產品外銷市場；推進綠色產業的發展，增加農民收入具有重要推進作用。


圖I為菌株HNA-12的PDA平板培養形態。 圖2為菌株HNA-12的分生孢子梗及分生孢子。圖3為哈茨木霉HNA-12和辣椒疫病菌對峙培養72小時后的照片。圖4為哈茨木霉HNA-12對辣椒疫病菌的重寄生作用。圖5為哈茨木霉HNA-12對辣椒疫病菌的重寄生作用。圖6為哈茨木霉HNA-12揮發性代謝物對辣椒疫病菌在平板上的抑制作用。圖7為哈茨木霉HNA-12非揮發性代謝物對辣椒疫病菌在平板上的抑制作用
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂20g，蒸餾水1000ml ;121°C滅菌20min后備用。木霉菌半選擇性培養基(TSM培養基)=MgSO4 (7H20) O. 2g、K2HPO4O. 9g、KCl O. 15g、NH4NO3L 0g、葡萄糖3. 0g、玫瑰紅0. 15g、60%敵克松可濕性粉劑O. 3克、PCNB O. 2g、瓊脂20g,蒸懼水950ml ;121°C滅菌20min備用。馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans):公眾可以從中國農業大學獲得；參考文獻Daayf F，Adam L and Fernando WGD (2003) Comparative screening ofbacteria for biological control of potato late blight(strainUS-8)using invitro, detached leaves, and whole plant testing systems. Canadian Journal of PlantPathology, 25:276 - 284。辣椒疫病菌(Phytophthora capsici):公眾可以從中國農業大學獲得；參考文獻Ahmed AS, Sanchez CP and Candela ME (2000) Evaluation of induction of systemicresistance in pepper plants(Capsicum annuum)to Phytophthora capsici usingTrichoderma harzianum and its relation with capsidiol accumulation. EuropeanJournal of Plant Pathology 106:817 - 824。辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum):公眾可以從中國農業大學獲得；參考文獻劉麗云.劉曉林,劉志恒,等.辣椒根腐病菌生物學特性研究.沈陽農業大學學報,2007，38(1) :54-58。實施例中所用的辣椒品種均為中華紅河北省定州市伯堡蔬菜良種繁育場。實施例中的孢子懸浮液都是收集孢子并重懸于水得到的。實施例I、哈茨木霉HNA-12的獲得和鑒定一、菌株HNA-12的獲得I、樣品采集樣品為采集自河南安陽辣椒農作物田間表層根際土壤。 用取土器材撥開田間3_5cm的表土層,將土壤連同植物的根系一起挖出，用聚乙烯塑料袋裝好，帶回實驗室分離。2、菌株HNA-12的獲得將粘附土壤的根系稍風干，輕拍根系，使粘附在上面的土壤脫落，用無菌水梯度稀釋，分別吸取O. ImL稀釋液滴入TSM培養基平板上，用滅菌的L形涂布棒涂布均勻，置于25-280C的恒溫培養箱中培養3-4天。挑取形態似木霉菌的單菌落轉接到PDA平板上進行純化培養，鏡鑒初步認定為木霉菌后編號，并保存到PDA斜面上。獲得一株菌株，將其命名為HNA-12。二、菌株HNA-12的鑒定在PDA培養基上20°C培養5d的菌落直徑為9. Ocm,生長速度很快，蛛絲狀至羊毛狀，白色，散生光下由于產孢表面呈綠色，背面無色，后期由于產孢量大使菌落呈稍綠色；多分枝的樹狀分生孢子梗形成相當疏松的菌叢；主枝寬4-5 μ m,側枝多，形成金字塔形；側生瓶梗可達5個，成擬輪狀排列或單個沿小側枝不規則排列；側生瓶梗基部略縊縮，中部膨大，向上漸狹成瓶梗，5-7Χ3_3.5μπι;頂生的和不典型的瓶梗相對長且纖細，13-18X2. 5-3. 5μπι ;瓶梗大多以大角度在其載體上著生，有時略彎向頂端；瓶梗孢子呈球狀分生孢子頭，分生孢子近球形或倒卵形，壁光滑，淡綠色，2. 8-3. 2X2. 5-2. 8 μ m。圖I為菌株HNA-12的PDA平板培養形態。圖2為菌株HNA-12的分生孢子梗及分生孢子。三、菌株HNA-12的保藏通過步驟二的鑒定,菌株HNA-12屬于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。哈茨木霉(Trichodermaharzianum) HNA-12,已于 2012 年 04 月 11 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5989。哈茨木霉(Trichoderma harzianum) HNA-12CGMCC No. 5989 簡稱哈茨木霉 HNA-12。實施例2、哈茨木霉HNA-12對病原菌的抑制作用實驗組在同一 PDA平板上接種哈茨木霉HNA-12菌餅和病原菌菌餅進行對峙培養(兩個菌餅中心的垂直距離為3cm，兩個菌餅的直徑均為5mm);以只接種病原菌菌餅的PDA平板作為對照組；25°C黑暗培養一定時間后測量病原菌的菌落直徑(最長直徑和最短直徑的平均值)并計算抑制率。抑制率=(對照組病原菌的菌落直徑-實驗組病原菌的菌落直徑)/對照組病原菌的菌落直徑*100%。每種致病菌設置三個重復處理，對照設置三個重復處理，結果取平均值。病原菌分別為辣椒疫病菌、馬鈴薯晚疫病菌和辣椒根腐病菌。
結果見表1(三次試驗的平均值)。哈茨木霉HNA-12和辣椒疫病菌對峙培養72小時后的照片見圖3。結果表明，哈茨木霉HNA-12對各個病原菌均具有抑制作用。表I各個培養時間后哈茨木霉HNA-12對各個病原菌的抑菌率(％)
病原菌24小時 36小時 48小時 60小時 72小時 84小時
辣椒疫病菌20 5 42Λ 4 Γ6 56^7 θθΓδ δΓ
馬鈴薯晚疫病菌 ΙδΓδ 42 5 54 5 59 8 69 2 Wl 辣椒根腐病菌 5Λ 3 Τ3 50 5 6573 69 7 72 5實施例3、哈茨木霉HNA-12的溫室生防效果實驗辣椒種子經55°C溫湯浸種30min后催芽，挑選長勢一致的發芽種子播種于培養缽，每缽20粒；在溫室中(25-30°C)培養直至辣椒植株長出4片真葉，分組進行如下操作(每組3個培養缽)實驗組每株辣椒接種IOmL哈茨木霉HNA-12孢子懸浮液(孢子濃度為5 X IO6個/mL)和IOmL辣椒疫病菌孢子懸浮液(孢子濃度為5 X IO6個/mL);接種方式為將孢子懸浮液用注射器注入根圍土壤；對照組每株辣椒接種IOmL辣椒疫病菌孢子懸浮液(孢子濃度為5 X IO6個/mL)；接種方式為將孢子懸浮液用注射器注入根圍土壤。接種孢子懸浮液30天后調查發病率(辣椒疫病分級調查標準見表2)并計算病情指數。表2辣椒疫病分級調查標準
病級分級標準 ~~O健康，根莖處無癥狀，腐爛面積小于1% ；
"I根莖基部有水浸狀病斑，或暗綠小病斑，腐爛部分環繞莖周1-25% ；
2根莖基部腐爛褐色，腐爛部分環繞莖周26-50% ；
I根莖基部腐爛褐色至深褐色，腐爛部分環繞莖周51-75%，稍有縊縮;
~根莖基部腐爛深褐至黑色，腐爛部分環繞莖周76-89%，明顯縊縮;
~根莖基部腐爛黑色，腐爛部分環繞莖周90%以上，嚴重縊縮。
== ——— X 200

權利要求
1.哈茨木霉(Trichodermaharzianum) HNA-12，它的保藏編號為 CGMCC No. 5989。
2.權利要求I所述哈茨木霉HNA-12在抑制病原菌中的應用；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)。
3.權利要求I所述哈茨木霉HNA-12在促進辣椒植株生長中的應用。
4.權利要求I所述哈茨木霉HNA-12在防控辣椒植株發生辣椒疫病中的應用。
5.一種產品，它的活性成份為權利要求I所述哈茨木霉HNA-12 ;所述產品為具有如下(I)至(3)中的至少一種功能的產品 (O抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)； (2)促進辣椒植株生長； (3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。
6.權利要求I所述哈茨木霉HNA-12在制備產品中的應用；所述產品為具有如下(I)至(3)中的至少一種功能的產品 (O抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)； (2)促進辣椒植株生長； (3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。
7.權利要求I所述哈茨木霉HNA-12的孢子液或發酵物。
8.權利要求7所述孢子液或發酵物的應用，為如下(I)至(3)中的至少一種 (O抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)； (2)促進辣椒植株生長； (3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。
9.一種產品，它的活性成份為權利要求7所述孢子液或發酵物；所述產品為具有如下(I)至(3)中的至少一種功能的產品 (O抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)； (2)促進辣椒植株生長； (3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。
10.權利要求7所述孢子液或發酵物在制備產品中的應用；所述產品為具有如下(I)至(3)中的至少一種功能的產品 (O抑制病原菌；所述病原菌為如下微生物中的至少一種馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；(2)促進辣椒植株生長；(3)防控辣椒植株發生辣椒疫病。全文摘要
本發明公開了一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的應用。本發明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HNA-12，保藏號為CGMCC No.5989。所述哈茨木霉HNA-12可用于抑制病原菌、促進辣椒植株生長、防控辣椒植株發生辣椒疫病。本發明在可持續農業發展中應用前景廣闊。
文檔編號A01N63/04GK102719364SQ20121020769
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者姚彥坡, 李燕, 王 琦 申請人:中國農業大學