專利名稱：一種誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法。
背景技術(shù)：
植物生物技術(shù)是一種重要和先進(jìn)的技術(shù)，而組織培養(yǎng)則是生物技術(shù)的重要組成部分。由于大豆愈傷組織和葉片等的植株再生技術(shù)還沒有確立，下胚軸成為唯一能夠再生不定芽的外植體材料。但是，迄今為止下胚軸的不定芽再生效率一直不盡人意，不定芽的質(zhì)量也較差，由此嚴(yán)重地影響了生物技術(shù)改良大豆品種的進(jìn)程。在以大豆下胚軸作為外植體誘導(dǎo)不定芽再生時，通常是在大豆種子萌發(fā)培養(yǎng)基或/和下胚軸外植體不定芽再生培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素，而最常用的細(xì)胞分裂素為芐基腺嘌呤(BA)，濃度為1-3 mg/L。在這種條件下外植體的不定芽再生效率很低，芽體的質(zhì)量也較差。造成這種情況的原因首先是由于長時間培養(yǎng)外植體不能夠用高濃度的細(xì)胞分裂素，因?yàn)殚L期高濃度激素培養(yǎng)外植體將導(dǎo)致外植體受傷甚至死亡，而低濃度的細(xì)胞分裂素的刺激不定芽再生的作用又不夠強(qiáng)。其次是在不定芽形成以后殘存在培養(yǎng)基和外植體組織中的細(xì)胞分裂素對不定芽的進(jìn)一步生長有十分不利的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種高效的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下具體步驟
(1)將大豆幼苗在MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，進(jìn)行切割獲取下胚軸外植體；
(2)對下胚軸外植體的形態(tài)學(xué)上端部分用芐基腺嘌呤(BA)溶液浸泡處理；
(3)將步驟(2)處理后的下胚軸外植體接種至MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng)。優(yōu)選地，步驟(I)和步驟(3)所述MSB5培養(yǎng)基中BA的濃度為O。不添加BA的萌發(fā)培養(yǎng)基上所獲得下胚軸外植體再生效果最佳。優(yōu)選地，步驟(2)的浸泡處理時間為20-40 min，此時外植體的不定芽再生效果最好。優(yōu)選地，步驟(2)的芐基腺嘌呤溶液濃度為30mg/L，此濃度下能獲得較高的不定芽再生率和單株芽數(shù)，并且再生的不定芽能夠繼續(xù)生長。優(yōu)選地，步驟(2)浸泡處理后清除殘留在下胚軸外植體表面的芐基腺嘌呤溶液，以進(jìn)一步減少對不定芽生長的影響。步驟(2)的BA溶液采用一般方法配制成所需即可，具體地，可以采用如下方法配制稱取一定量的BA粉末,用lmol/L NaOH充分溶解,再用去離子水定容,配制成30mg/L的BA溶液；采用lmol/L HCl調(diào)整BA溶液的pH至5. 8-6. O。步驟(I)和步驟(2)的培養(yǎng)條件均為室溫為25°C、光照強(qiáng)度為20001x、光照時間為每天12小時。步驟(I)和步驟(3)的MSB5培養(yǎng)基中含有MS培養(yǎng)基配方的無機(jī)成分、B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分、25 g/L鹿糖、100 mg/L肌醇、300 mg/L蛋白胨、7 g/L瓊脂,pH為5. 8-6. O。具體來說，MS培養(yǎng)基配方的無機(jī)成分包括16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、I. 7 g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L 二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、8. 6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025 mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵；B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分包括10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸吡哆醇、I mg/L煙酸、100mg/L肌醇。本發(fā)明還提供一種合適的處理裝置，用于方便地對下胚軸外植體進(jìn)行短期激素處 理，即用于步驟(2)的浸泡處理采用一塊通常用于核苷酸片段擴(kuò)增的4 cmX6 cm PCR板，整齊的切掉PCR板底部的小管，保留四個角上的小管作支架，放在有蓋的培養(yǎng)皿中。該裝置可置于高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行常規(guī)滅菌。本發(fā)明對通常的大豆下胚軸外植體不定芽再生培養(yǎng)方法進(jìn)行了創(chuàng)新，即在為獲取下胚軸外植體的萌發(fā)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)下胚軸不定芽的再生培養(yǎng)基中都不添加BA，取而代之的是利用高濃度的BA溶液對從幼苗取得的下胚軸外植體的上端切口附近進(jìn)行短期的浸泡處理，給予外植體上端切口附近具有分化能力的細(xì)胞相對于普通添加BA的培養(yǎng)基更強(qiáng)的刺激，誘導(dǎo)形成更多的不定芽。同時，由于僅是局部短時的浸泡處理，BA在細(xì)胞中的濃度隨后很快降低，減少了在培養(yǎng)后期對所形成的不定芽的發(fā)育的負(fù)面影響，也不會影響下胚軸外植體下端切口的不定根再生，可以達(dá)到一次培養(yǎng)操作就可以得到完整植株的高效目的。本發(fā)明的有益效果1)方法簡便，可以顯著縮短整個培養(yǎng)周期；2)得到數(shù)量更多、質(zhì)量更好的不定芽，現(xiàn)有方法的不定芽獲得率一般為10 %-30 %，而采用本發(fā)明的方法的不定芽獲得率為31. 94 %-54. 17 % ;3)由在上方形成了芽和下方形成了根的下胚軸外植體所產(chǎn)生的再生植株更容易煉苗和移栽成活。


圖I :處理外植體的裝置；
圖2 :切割部位與外植體形態(tài);A :切割部位(黑線表示齊靠幼苗子葉分叉處基部切割)；B :外植體形態(tài)學(xué)上端形態(tài)結(jié)構(gòu)；
圖3 :不同濃度的BA溶液處理下胚軸20分鐘后的再生效果；A 0 mg/L ；B :15 mg/L ；C 30 mg/L；D 60 mg/L ；E 120 mg/L ；
圖4 :下胚軸再生植株的移栽生長;A :下胚軸再生植株的馴化移栽；B :成熟植株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
一種誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其中使用到的溶液如下
(I)BA溶液稱取一定量的BA粉末，用I mg/L NaOH充分溶解，再用去離子水定容，配制成30 mg/L的BA溶液；采用I mg/L HCl調(diào)整BA溶液的pH至5. 8-6. O ;使用高壓蒸汽滅菌鍋，在121°C、0. I MPa的條件下，對已配制好的BA溶液進(jìn)行20 min滅菌。
(2)MSB5培養(yǎng)基將MS培養(yǎng)基配方的無機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、1.7 g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L 二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、8.6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、0. 83 mg/L碘化鉀、0. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、0. 025mg/L五水硫酸銅、0. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)、B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)、25 g/L蔗糖、300 mg/L蛋白胨、7 g/L瓊脂依次加入到容積為2 L的塑料廣口容器(事先已向其中加入了 200 mL的去離子水)中充分溶解，用去離子水定容，采用I mol/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8-6.0，最后把培養(yǎng)基分裝至容積為200 mL的玻璃培養(yǎng)瓶中，每瓶加入20 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)基在121°C、0. I MPa的條件下滅菌20 min。預(yù)先制備一種處理裝置，用于方便地對下胚軸外植體進(jìn)行短期激素處理采用一塊通常用于核苷酸片段擴(kuò)增的4 cmX6 cm PCR板，整齊的切掉PCR 板底部的小管，保留四個角上的小管作支架，放在有蓋的培養(yǎng)皿中。該裝置可置于高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行常規(guī)滅菌。制備好的裝置如圖I所示。本實(shí)施例的方法包括如下具體步驟
(1)將大豆幼苗在MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，進(jìn)行切割獲取下胚軸外植體；
(2)對下胚軸外植體的形態(tài)學(xué)上端部分用BA溶液浸泡處理；
(3)將步驟(2)處理后的下胚軸外植體接種至MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng)。其中步驟(I)中獲取大豆下胚軸外植體供體材料的方法為選取大小均一的成熟大豆種子，經(jīng)常規(guī)滅菌后，接種至無激素MSB5培養(yǎng)基上，在室溫為25°C、光照強(qiáng)度為20001x、光照時間為每天12小時的條件下培養(yǎng)5天，獲得大豆幼苗作為下胚軸外植體供體材料。步驟(I)中獲取下胚軸外植體的方法為選取具有長度大于I cm的胚軸的大豆幼苗為供體材料，在齊靠幼苗子葉分叉處基部切割，獲得長度為I cm左右的下胚軸切段為外植體，切口平齊。切割部位與外植體形態(tài)見圖2。步驟(2)中BA溶液處理下胚軸外植體的方法為在超凈工作臺中，把切好的下胚軸外植體逐個插入上述處理裝置的各個孔中，使外植體的形態(tài)學(xué)上端朝下，然后向該裝置組成部分的培養(yǎng)皿中倒入上述BA處理溶液至約I mm深度，蓋上培養(yǎng)皿蓋，靜置20 min。倒掉BA溶液，取出下胚軸外植體，放置在無菌吸水紙上，吸去外植體表面殘留的BA溶液。步驟(3)中下胚軸外植體的再生培養(yǎng)方法為把經(jīng)過處理后的下胚軸外植體以豎插方式接種至無激素MSB5培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000 lx、光照時間為每天12小時的條件下培養(yǎng)20天。經(jīng)上述方法處理后，再使用如下再生苗的出瓶煉苗和種植方法從培養(yǎng)瓶中取出上端具有再生芽和下端具有再生根的下胚軸，洗凈根上的培養(yǎng)基后，即可栽植到干凈的細(xì)砂基質(zhì)中，進(jìn)行常規(guī)的保濕煉苗。幾天之后，即可把再生苗種植在一般的土壤中進(jìn)行常規(guī)管理。下胚軸再生植株的移栽生長見圖4。實(shí)施例2
種子萌發(fā)培養(yǎng)基中添加不同濃度的BA對下胚軸外植體再生的影響本實(shí)施例中，采用在添加不同濃度BA的MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后的大豆幼苗，對其進(jìn)行切割獲取下胚軸外植體；對下胚軸外植體的形態(tài)學(xué)上端部分用30 mg/L BA溶液浸泡處理20 min后，接種至無激素MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示。
表I萌發(fā)培養(yǎng)基中不同BA濃度對下胚軸外植體再生的影響
bTwl) I不定芽再生率/%I單株芽數(shù)/顆I不定根形成率/%
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將大豆幼苗在MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，進(jìn)行切割獲取下胚軸外植體； (2)對下胚軸外植體的形態(tài)學(xué)上端部分用芐基腺嘌呤溶液浸泡處理； (3)將步驟(2)處理后的下胚軸外植體接種至MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于步驟(1)和步驟(3)所述MSB5培養(yǎng)基中芐基腺嘌呤的濃度為O。
3.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于步驟 (2)的浸泡處理時間為20-40min。
4.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于步驟(2)的芐基腺嘌呤溶液濃度為30mg/L。
5.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于步驟(2)浸泡處理后清除殘留在下胚軸外植體表面的芐基腺嘌呤溶液。
6.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于步驟(2)的芐基腺嘌呤溶液配制方法為稱取一定量的芐基腺嘌呤粉末，用I mol/L NaOH溶解，再用去離子水定容，配制成30 mg/L的芐基腺嘌呤溶液；采用I mol/L HCl調(diào)整芐基腺嘌呤溶液的pH至5. 8-6.0。
7.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于步驟(I)和步驟(2)的培養(yǎng)條件均為室溫為25°C、光照強(qiáng)度為20001x、光照時間為每天12小時。
8.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于步驟(I)的培養(yǎng)時間為5天。
9.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于步驟(I)和步驟(3)的MSB5培養(yǎng)基中含有MS培養(yǎng)基配方的無機(jī)成分、B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分、25 g/L 鹿糖、100 mg/L 肌醇、300 mg/L 蛋白胨、7 g/L 瓊脂，pH 為 5. 8-6. O。
10.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)大豆下胚軸外植體的不定芽再生的方法，其特征在于步驟(2)中浸泡處理使用的裝置為采用一塊用于核苷酸片段擴(kuò)增的4 cmX6 cm PCR板，整齊的切掉PCR板底部的小管，保留四個角上的小管作支架，放在有蓋的培養(yǎng)皿中。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。在以大豆下胚軸作為外植體誘導(dǎo)不定芽再生時，一般是在大豆種子萌發(fā)培養(yǎng)基或/和下胚軸外植體不定芽再生培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素，在這種條件下胚軸外植體的不定芽再生效率很低，芽體的質(zhì)量也較差。本發(fā)明，在種子萌發(fā)培養(yǎng)基和不定芽再生培養(yǎng)基中都不添加BA，在取得外植體后，配制顯著高濃度的BA溶液對大豆下胚軸外植體形態(tài)學(xué)上端切口附近進(jìn)行短期浸泡處理，給予該部位具有分化能力的細(xì)胞較強(qiáng)的不定芽分化刺激作用，因此，也就可以獲得數(shù)量較多和質(zhì)量較好的不定芽。應(yīng)用本發(fā)明可以極顯著地提高大豆下胚軸外植體不定芽再生的效率和質(zhì)量，使下胚軸成為大豆遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體。
文檔編號A01H4/00GK102754597SQ20121020707
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者于磊, 劉潁, 年海, 張奇, 楊躍生, 郭振飛 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)