專利名稱：編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因aroA及其應用，該基因是從高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌菌株中克隆得到的，對草甘膦表現出增強的抗性。
背景技術：
草甘膦(Glyphosate)因理化性質穩定并具有高效、廣譜、低毒、低殘留、易分解和不破壞土壤環境等優點，自1971年孟山都公司成功開發以來，備受市場青睞，現已成為全球銷量最大的植物保護產品。由此，草甘膦也成為抗除草劑轉基因作物研究的首選對象，抗草甘膦轉基因作物是目前全球播種面積最大的轉基因作物。草甘膦作用靶標酶EPSP合成酶(EPSPS)基因的克隆、表達及其功能驗證等也因此成為現代分子生物育種研究的重點。 在自然界中，植物和微生物都含有編碼EPSP合成酶(EPSPS)的基因。植物中編碼該合酶的基因為epsps,而在微生物中編碼該合酶的基因為aroA。1983年孟山都公司和華盛頓大學的科學家分離得到了根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) CP4,該株系的EPSPS對草甘膦不敏感，具有很高的抗性。1986年孟山都公司將CP4EPSPS基因導入到大豆基因組中，成功培育出抗草甘膦大豆新品種。此后科學家們分別從細菌包括大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、可變鹽單胞菌、假單胞菌、金黃色釀膿葡萄球菌、結合分支桿菌中克隆得到編碼EPSP合成酶的aroA基因，從擬南芥、煙草、牛筋草、小蓬草等植物中克隆得到了 epsps基因(He etal. , 2001 ；Borgesetal. , 2007 ；Melanie etal.,2005;Brotherton etal. , 2007;Dinelli etal.,2006;Zhaoetal. , 2011; Baerson etal.，2002;劉柱等，2004)。其中牛筋草、胡蘿卜及煙草epsps基因可耐受 IOOuM 以下的草甘勝(Baerson etal. , 2002 ；Shyr etal. , 1992;Dyer etal. , 1988)，水稻epsps基因突變體可耐受IOOmM以下的草甘膦(Zhou etal.，2006);可變鹽假單胞菌的EPSP合酶基因可耐受50mM以下的草甘膦(劉光全等，2004);人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)中的EPSP合酶基因可耐受300mM以下的草甘膦(金蕪軍等,2010)。目前關于雜草對草甘膦抗性機制有多方面的說法。Lorraine-Colwill等認為瑞士黑麥草抗性生物型和敏感生物型EPSPS酶的活性以及印sps基因序列都沒有差異，主要是由植物體內的吸收輸導差異而產生了對草甘膦的抗性。而Gaines等認為，EPSPS酶的表達量增加也可以使植物對草甘膦產生抗性。而草甘膦靶標酶EPSP合成酶基因epsps的核酸序列位點發生突變，致使生物體對草甘膦產生抗性，有很多研究報道。

發明內容
為了克服現有轉基因作物草甘膦抗性偏低的缺陷，本發明的首要目的在于提供一種編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因ar0AS(l(ll。本發明的另一目的在于提供上述基因UroAstltll)在提高農作物草甘膦抗性中的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA■，其堿基序列如SEQID NO. 3 所示。上述基因(aroA.)是利用同源克隆的方法從一株高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)kpSOOl菌株中克隆得到的,該菌株已于2012年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6189。上述基因(aroAS(m)可用于提高農作物的草甘膦抗性，包括將aroA_、含有aroAS001的表達載體或克隆載體、含有上述表達載體或克隆載體的菌株轉化入農作物中。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果肺炎克雷伯氏菌ar0AS(l(ll基因是一種優良的草甘膦抗性基因，轉入該基因的aroA 基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培養基中生長，與目前已報道的其它物種EPSP合成酶基因相比，表現出優良的草甘膦抗性，取得了意料不到的有益效果。


圖I為實施例2中aroAS(m基因PCR擴增產物電泳圖；其中M_DL2000Marker，l-aroAS001 基因 PCR 擴增產物(1284bp)。圖2為實施例3中重組質粒pProA-aroAS(l(ll的菌落PCR檢測結果圖；其中，M-DL2000Marker, 1-9-第1_9號克隆的擴增結果。圖3為實施例4中，kpSOOIEPSPS蛋白的誘導表達SDS-PAGE檢測結果圖；M_低分子量標準蛋白，I-含空載體PProA菌株DH5 a IPTG誘導表達6小時，2-含pProA-aroAS(l(ll重組質粒菌株DH5 a IPTG誘導表達6小時。圖4為實施例5中，分別轉入pProA和pPr0A-ar0AS(l(ll質粒的ER2799菌株分別在含OmM和50mM草甘膦培養基中的生長曲線圖；其中,aroAS001-0是轉入ProA-aroAS(l(ll質粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培養基中的生長曲線圖，aroAS(l(ll-50是轉入Pr0A-ar0AS(l(ll質粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培養基中的生長曲線圖，pProA-0是轉入pProA質粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培養基中的生長曲線圖，pProA-50是轉入pProA質粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培養基中的生長曲線圖。圖5為實施例5中，分別轉入pProA和pProA-aroAS(l(ll質粒的ER2799菌株在不同濃度草甘膦濃度的培養基中的生長曲線圖；其中，aroAS(l(ll是轉入pProA-aroAS(l(ll質粒的ER2799菌株在不同濃度草甘膦濃度的培養基中的生長曲線圖，pProA是轉入pProA質粒的ER2799菌株在不同濃度草甘膦濃度的培養基中的生長曲線圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例I高抗草甘膦菌株的篩選分離，是從廣東蔬菜田間取土樣，以草甘膦為篩選標記，分離獲得肺炎克雷伯氏菌kpSOOl菌株；具體包括以下步驟
I、高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌的分離(I)取廣東蔬菜田間土樣10g，加入到90mL 150mmol/L草甘膦(原粉)的基礎鹽培養基(液體)中，置于37°C、120r/min培養72h。(2)取步驟(I)IOmL培養液加入到含200mmol/L草甘膦(原粉)的基礎鹽培養基(液體)培養，370C、120r/min培養72h ;依此類推，將前一輪培養液逐級加入300、350、400mmol/L草甘膦(原粉)的基礎鹽培養基(液體)培養，370C、120r/min培養72h。(3)取適量培養液分別在含350mmol/L草甘膦的營養瓊脂、馬丁、高氏一號平板培養基上，劃線分離。(4)挑取步驟(3)中的單菌落接種于含400mmol/L草甘膦(原粉)的基礎鹽培養基(液體)培養，37 0C、120r/min 培養 72h。(5)取適量培養液在含400mmol/L草甘膦的營養瓊脂馬丁高氏平板培養基上，劃線分離。獲得耐受400mmOl/L草甘膦的菌株。

2、利用革蘭氏染色法，在顯微鏡下觀察步驟I分離得到的菌株，為短桿狀、單個、成雙或短鏈狀排列，革蘭氏陰性桿菌。3、利用通用引物27F、1492R PCR擴增該菌株的16S DNA序列。PCR反應體系如下
權利要求
1.一種編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因BroAscitll，其堿基序列如SEQID NO. 3 所示。
2.權利要求I所述的基因aroAS(l(ll在提高農作物草甘膦抗性中的應用。
3.根據權利要求2所述的基因ar0AS(l(ll在提高農作物草甘膦抗性中的應用，其特征在于將基因aroAS(l(ll轉化入農作物中。
4.根據權利要求2所述的基因ar0AS(l(ll在提高農作物草甘膦抗性中的應用，其特征在于將含有基因aroAS(l(ll的表達載體或克隆載體轉化入農作物中。
5.根據權利要求4所述的基因ar0AS(l(ll在提高農作物草甘膦抗性中的應用，其特征在于將含有權利要求4所述的表達載體或克隆載體的菌株轉化入農作物中。
全文摘要
本發明公開了一種編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroAS001及其應用，該基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示；該基因可用于提高農作物的草甘膦抗性，具體的是將基因aroAS001、含有基因aroAS001的表達載體或克隆載體，或含有上述的表達載體或克隆載體的菌株轉化入農作物中。本發明的基因是一種優良的草甘膦抗性基因，轉入該基因的aroA基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培養基中生長，與目前已報道的其它物種EPSP合成酶基因相比，表現出優良的草甘膦抗性，取得了意料不到的有益效果。
文檔編號A01H5/00GK102766643SQ201210262308
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月26日 優先權日2012年7月26日
發明者馮莉, 吳丹丹, 岳茂峰, 崔燁, 張妤, 張純, 楊彩宏, 田興山 申請人:廣東省農業科學院植物保護研究所