專利名稱：一種增強基因表達的ubi1內含子序列及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及一種增強基因表達的ubil內含子序列。本發明還涉及該ubil 內含子的應用。
背景技術：
大多數真核基因都被一個或多個內含子所間隔，這些間隔序列可以轉錄成pre-mRNA，這些轉錄本只有在細胞核中經剪接復合體的作用去除內含子片段后，才能形成成熟mRNA，然后穿過核孔轉移到細胞質中進行翻譯。真核pre-mRNA的剪接是一個在細胞核中完成的、嚴格保守的化學反應，該過程包括剪接體識別外顯子-內含子連接區段，通過兩步轉酯反應切除內含子并使相鄰的外顯子連接。內含子雖然是基因中只被轉錄而不被翻譯的序列，但越來越多的研究發現，內含子并不是基因上的一段冗余序列，相反，內含子在基因表達方面起著重要的調控作用。這種由內含子介導的使基因表達活性增強的效應叫做內含子增強效應(intron-mediatedenhancement, IME) (Callis et al. ,Genes Development, 1987,1:1183-1200)。真核 mRNA內含子已成為提高轉基因生物外源基因表達的重要元件之一。單子葉植物的內含子增強效應高于雙子葉植物，雙子葉植物內含子增強效應一般在 2-5 倍，而單子葉植物可達 10-100 倍(Simpson 和 Filipowicz, Plant Mol. Biol.，1996，32 :1-41)。雙子葉植物內含子可以提高單子葉植物基因的表達，而由于單子葉植物內含子與外顯子AU的平均含量為59%和44%，雙子葉植物的分別為74%和55%，高AU含量可以使內含子更易形成莖環結構從而有利于剪接，因此，單子葉植物內含子通常不會提高雙子葉植物基因的表達(Vain et al.，Plant cell R印，1996，15:489-494)。Ueki 等將 PLD、Cat 和Ubi (玉米ubiquitin第一個內含子)內含子與不同啟動子連接,分別轉化玉米和煙草的原生質體，驗證各個載體表達特點，結果發現，含有內含子載體的報告基因表達水平在玉米原生質體中普遍高于同樣載體的煙草原生質體的表達水平，內含子載體增強效應與啟動子、內含子和報告基因等緊密相關(Ueki et al.，Plant Biotech, 2004, 21 (I) :15_24)。泛素(ubiquitin)是一種存在于大多數真核細胞中的由76個氨基酸殘基組成的高度保守的蛋白質。1992年，Christensen等從玉米中克隆出了編碼泛素蛋白的Ubi-I和Ubi-2基因，并準確定位了 Ubi-I的啟動子、轉錄起始位點、5’側翼序列處的0. 9kb轉錄調控區和完整的5’非編碼區，并構建pUBI-CAT載體，在玉米和其它單子葉植物的原生質體中進行驗證，發現Ubi-I啟動子比CaMV35S具有更高的增強基因表達的效應(Christensen etal.,Plant Mol Biol，1992，18 :675-689)。Vain等通過比較發現，ubil內含子與側翼外顯子的41nt所構建的載體(p35Subi⑶S)在玉米懸浮細胞中的增強效應高于其它載體，增強效應可提高71倍(Vainet al. ,Plant cell R印，1996，15 :489_494)。王悅冰比較了玉米泛素蛋白基因的第一內含子(ubil)、水稻肌動蛋白基因的第一內含子(actl)、玉米乙醇脫氫酶基因的第一內含子(adhl)和馬鈴薯高賴氨酸基因SBgLR基因的第二內含子(SBgLR2)對基因表達的增強作用，結果發現Ubil增強報告基因的表達能力最強；盡管已知并不是內含子中所有序列為提高基因表達所必需，但尚未見到有關通過缺失分析對Ubil內含子改造研究的報道。

發明內容
本發明的目的是對來源于玉米 泛素蛋白基因ubil內含子進行缺失分析，提供一種可以增強基因表達的內含子，通過構建該改造的泛素蛋白內含子的植物表達載體，將其應用于轉基因植物的培育中，可以提高其他基因在轉基因植物中的表達。本發明通過如下工作達到了上述發明目的I、內含子缺失載體的構建策略本發明以ubiquitin基因第一內含子序列(SEQ ID N0:1)為目標序列。在此序列中，有下劃線部分表示缺失備選位點。SEQ ID NO: II GTACGCCGCT CGTCCTCCCC CCCCCCCCCT CTCTACCTTC TCTAGATCGG CGTTCCGGTC61 CATGGTTAGG GCCCGGTAGT TCTACTTCTG TTCATGTTTG TGTTAGATCC GTGTTTGTGT121TAGATCCGTG CTGCTAGCGT TCGTACACGG ATGCGACCTG TACGTCAGAC ACGTTCTGAT181TGCTAACTTG CCAGTGTTTC TCTTTGGGGA ATCCTGGGAT GGCTCTAGCC GTTCCGCAGA241CGGGATCGAT TTCATGATTT TTTTTGTTTC GTTGCATAGG GTTTGGTTTG CCCTTTTCCT301TTATTTCAAT ATATGCCGTG CACTTGTTTG TCGGGTCATC TTTTCATGCT TTTTTTTGTC361TTGGTTGTGA TGATGTGGTC TGGTTGGGCG GTCGTTCTAG ATCGGAGTAG AATTAATTCT421GTTTCAAACT ACCTGGTGGA TTTATTAATT TTGGATCTGT ATGTGTGTGC CATACATATT481CATAGTTACG AATTGAAGAT GATGGATGGA AATATCGATC TAGGATAGGT ATACATGTTG541ATGCGGGTTT TACTGATGCA TATACAGAGA TGCTTTTTGT TCGCTTGGTT GTGATGATGT601 GGTGTGGTTG GGCGGTCGTT CATTCGTTCT AGATCGGAGT AGAATACTGT TTCAAACTAC661 CTGGTGTATT TATTAATTTT GGAACTGTAT GTGTGTGTCA TACATCTTCA TAGTTACGAG721 TTTAAGATGG ATGGAAATAT CGATCTAGGA TAGGTATACA TGTTGATGTG GGTTTTACTG781 ATGCATATAC ATGATGGCAT ATGCAGCATC TATTCATATG CTCTAACCTT GAGTACCTAT841 CTATTATAAT AAACAAGTAT GTTTTATAAT TATTTTGATC TTGATATACT TGGATGATGG901 CATATGCAGC AGCTATATGT GGATTTTTTT AGCCCTGCCT TCATACGCTA TTTATTTGCT961 TGGTACTGTT TCTTTTGTCG ATGCTCACCC TGTTGTTTGG TGTTACTTCT GCAG采用以下方法對上述序列進行改造首先，米用來自 “http: //korf lab, ucdavis. edu/CRi-bin/web-imeter. pi，，的應用檢索軟件對玉米ubil序列(1014bp)進行IME (intron-mediated enhancement)基序檢索，并得到內含子的得分值。由于該軟件所得的內含子分析數據來源于擬南芥和水稻基因組的序列信息，只針對擬南芥和水稻。考慮到玉米和水稻同屬于單子葉植物，所以本發明選用水稻物種的信息，通過生物信息學分析獲得內含子增強基因表達的初級信息。其次，根據內含子左右邊界序列特點(5’迎……M3’)，保證邊界序列不被破壞從而可以正確剪接，依據GT、AG位置篩選缺失序列。在選擇位置時，固定一端位置不變，從另一端選擇待缺失位點，以此獲得單一末端缺失序列。5’端GT序列待選位置52，96，110，143,231,281 (SEQ ID NO: I 劃線處)，3’ 端 AG 序列備選位置639，713，748，806，857 (SEQID NO: I劃線處)，同時分析缺失片段的AT含量及獲得的內含子序列分值。結果如表I和表2。表中“得分”為所得的內含子分值，分值越高，意味著增強基因表達的能力越強；“AT含量”表示在SEQ ID NOl中A堿基和T堿基的個數占總堿基個數的百分比。表Iubil內含子3’末端缺失序列分析
權利要求
1.一種可以提聞基因表達的內含子序列，其特征是具有SEQ ID NO :2所不的核昔酸序列。
2.權利要求I所述的內含子序列在培育轉基因植物中的應用。
3.一種提高ubil內含子增強基因表達水平的方法，其特征是對ubil內含子進行特定位置的缺失。
4.權利要求3所述的方法，所述內含子是泛素蛋白內含子，所述缺失是將SEQID NOI中l_142bp進行缺失。
5.一種植物表達載體，其特征是含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
6.權利要求5所述的載體在培育轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發明對來源于玉米ubiquitin第一內含子進行缺失分析，獲得了可以增強外源基因表達的新型內含子序列，該內含子序列長為872bp，AT含量為61.0%，可以提高基因表達13倍，與全長的ubiquitin第一內含子相比，提高外源基因表達能力增加30%。本發明獲得的內含子可以用于高效植物表達載體的構建，提高轉基因植物外源基因表達水平。本發明通過構建含該改造的內含子的植物表達載體，將其應用于轉基因植物的培育中，可以提高其他基因在轉基因植物中的表達。
文檔編號A01H5/00GK102747081SQ20121026298
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月26日 優先權日2012年7月26日
發明者朱莉, 潘陽陽, 郎志宏, 黃大昉 申請人:中國農業科學院生物技術研究所