專利名稱：在輕度低溫下能促進基因表達的序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及在輕度低溫下促進基因轉錄或翻譯的輕度低溫應答元件。
背景技術：
利用生物技術已經生產出許多種藥物和分析用試劑，例如單克隆抗體、生長因子 和凝血因子。一般來說，在10_15°C的低溫下，促進了異源重組蛋白正確折疊并抑制了蛋白酶 P華角軍蛋白(Baneyx, F. , In vitro folding of recombinantproteins in Escherichia coli.In Manual of industrial microbiology andbiotechnology,第 2 版，(Demain, A. L. Davis, J. E.，Altas, R. M.，等,編輯)ASM Press, ffashingtonn D. C.，pp. 551-1999)。 因此，當利用細菌生產重組蛋白時，在低于20°C的低溫而非37°C下進行培養。在該情況 下，由于在低溫下蛋白合成通常減少，可能出現期望蛋白產量降低。通過在期望蛋白的表 達載體中使用冷激蛋白CspA基因啟動子和CspA mRNA的5、非翻譯區(UTR)解決了該難 題(Baneyx, F.禾口 Mujacic, M. , Cold-inducible promoters for heterologous protein expression, Methods in Molecular Biology,205,1-18,2001)。但是，細菌與哺乳動物細胞中的翻譯后修飾明顯不同。特別是對于藥物而言，糖 基化狀態對治療效果是很重要的。因此，哺乳動物細胞，特別是中國倉鼠細胞系，被用于 制備蛋白質藥物。為降低細胞培養生產成本，必須要增加蛋白產量。通常在37°C下進行 培養，但是其缺點在于，因為細胞在快速生長后死亡，則細胞存活并產生期望蛋白所持續 的時間就短。因此，通過添加細胞生長抑制劑、表達細胞周期抑制基因P27、在輕度低溫 (30-32°C )下培養等以實現抑制細胞生長并使細胞存活更長時間的嘗試(參見Schatz SM 等，Biotechnol. Bioeng, 2003，Nov. 433—438)。其中，在輕度低溫下培養具有如下特征1)較在37°C下培養，細胞存活及產生重組蛋白的時間更長；2)蛋白水解酶活性降低以減少期望蛋白降解；3)糖基化和同工蛋白質譜(isoprotein pattern)類似于在37°C下培養的那些， 且唾液酸化較在37°C下培養的更好；4)可能改善如細菌中的期望蛋白的正確折疊(Kaufmann H，MazurX，Marone R， Bailey JE, Fussengger M.，Biotech Bioeng.，2001-3—20，72(6) :592_602 ；Yoon SK, Song JY, Lee GM.，Biotech Bioeng.，2003-5—5，82(3) :289_98)。就重要的重組蛋白產量而論，由于細胞存活時間延長，總產量通常增加。但是，每 單位時間每細胞蛋白的單位生產率由于未知的原因而改變，可能取決于細胞類型、期望蛋 白類型等等。許多情況下單位生產率較在37°C下更低，難以解決(Kaufmann H, Mazur X，Marone R, Bailey JE, Fussenegger M.，Biotech Bioeng. ,2001Mar. 20,72(6) :592_602 ； Yoon SK, Song JY, Lee GM. , Biotech Bioeng. , 2003May. 5,82(3) :289_98)。因為基因表達 調控機制不同于細菌，所以細菌的冷激蛋白CspA啟動子和CspA mRNA的5、非翻譯區(UTR) 不能用于哺乳動物細胞。本發明的目的是提供一種在低溫下增加每單位時間每細胞的蛋白生產和總產量 的方法。

發明內容
本申請發明人之前發現并報道了冷激蛋白Cirp (冷誘導的RNA結合蛋白質)，其 基因組DNA序列如SEQ ID No 1所示，以及Rbm3 (RNA結合基序蛋白3) (Fujita J.，Cold shock response in mammalian cells, J. Mol Microbiol. Biotechnol. ,1999 年 11 月， 1(2) 243-55)?，F在，本發明是在這些蛋白基因啟動子的5、端發現能促進轉錄的基因表達調控 序列的基礎上做出的。也就是說，本發明涉及一種輕度低溫轉錄調控元件，包含核苷酸序列XiCcccXgX^g其中，X:是t，g或a ;X6是g，a或c ;X7是c，a，或t ；以及X8是c，a和t，或與該序 列互補的核苷酸序列。在此術語“輕度低溫”指15_36°C的溫度，優選30_34°C的溫度以及最優選32°C的 溫度。術語“輕度低溫轉錄調控元件”指在輕度低溫下能特異性促進基因轉錄的核苷酸序 列。本發明的輕度低溫轉錄調控元件在基因轉錄中起輕度低溫特異性增強子的作用。本發明的輕度低溫轉錄調控元件在單獨使用時能起作用。但是，優選使用連接的 2-50個，優選2-10個相同或不同的元件。當元件連接使用時，相同或不同的元件可直接連 接，或通過任何數量和類型的核苷酸連接。在本說明書中連接的輕度低溫轉錄調控元件稱 為“輕度低溫轉錄調控增強子”。本發明的輕度低溫轉錄調控元件和輕度低溫轉錄調控增強 子并不涉及與啟動子的距離。本發明涉及一種包含上述輕度低溫轉錄調控元件或輕度低溫轉錄調控增強子的 載體。本發明涉及上述載體所轉化的哺乳動物細胞。本發明涉及一種篩選輕度低溫轉錄調控元件的方法，包括1)提供在輕度低溫下，特別優選在32°C的培養溫度下，能促進轉錄的基因；2)克隆基因的一部分，從該基因轉錄起始位點5’的1. 5kb到第一外顯子3、末端；3)將所克隆的核苷酸序列和合適的啟動子插入表達報道基因的載體中；4)用所述載體轉化哺乳動物細胞；5)在輕度低溫或37°C下培養細胞以表達報道基因，來鑒定能在輕度低溫下促進 報道基因轉錄的核苷酸序列；和6)對于能促進報道基因轉錄的核苷酸序列，截短要被插入載體的核苷酸序列，以 鑒定對于在輕度低溫下促進報道基因轉錄必需的核苷酸序列。本發明涉及一種改良輕度低溫轉錄調控元件的方法，包括
1)合成突變的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代輕度低溫轉錄調控元件中的一 個或兩個核苷酸；2)將突變的核苷酸序列與合適的啟動子整合入表達報道基因的載體中；3)用所述載體轉化哺乳動物細胞；4)在輕度低溫或37°C下培養細胞以表達報道基因，來鑒定在輕度低溫下能促進 報道基因轉錄的核苷酸序列。發明人在Cirp基因mRNA的非翻譯區(UTR)中還發現了能在輕度低溫下促進 翻譯的基因表達調控序列。更確切地說，本發明涉及一種輕度低溫翻譯調控元件，包含核苷酸序列actcg cgcct tagga agctt gggtg tgtgt ggcgc gctgt cttcc cgctcgcgtc aggga cctgc ccgac tcagc ggctg cc (SEQ ID NO :23)，置于編碼序列的5、端和啟動子的3、端。在此術語“輕度低溫翻譯調控元件”指在輕度低溫下特異性促進轉錄的mRNA翻譯 的元件。當輕度低溫翻譯調控元件轉錄時，其形成mRNA的5、非翻譯區(UTR)。在此術語“輕度低溫應答元件”指的是輕度低溫轉錄調控元件和/或輕度低溫翻 譯調控元件。發明效果本發明在輕度低溫下可促進基因轉錄和翻譯。


圖1是pCAT3基礎載體示意圖。MCS是多克隆位點。CAT是氯霉素乙酰轉移酶的 編碼序列。PA是來自SV40病毒的多腺苷酸化信號。Amp1^是氨芐青霉素抗性基因。圖2是pCAT3啟動子載體示意圖。MCS是多克隆位點。SV40啟動子是來自SV40 病毒的啟動子。CAT是氯霉素乙酰轉移酶的編碼序列。PA是來自SV40病毒的多腺苷酸化 信號。Amf是氨芐青霉素抗性基因。圖3是pcDNA 3. 1⑴載體(Invitrogen)示意圖。MCS是多克隆位點。熒火蟲熒 光素酶編碼序列被插入到多克隆位點的EcoRV和Xbal之間。Cirp mRNA的5、非翻譯區 (UTR)的互補DNA(cDNA)被插入到多克隆位點的Kpnl和BamHI之間。
具體實施例方式本發明的輕度低溫轉錄調控元件的例子包括，但不限于，tcccc gcc (SEQ ID NO: 2)，gcccc gcc (SEQ ID NO 9),acccc gcc (SEQ IDN0 10),tcccc gtc(SEQ ID NO 11),tcccc get(SEQ ID NO: 12)，tcccc gaa(SEQ ID NO :21)，ggegg gga(SEQ ID NO :22)，和 ggggg gga(SEQ ID NO 7)(i)制備輕度低溫應答元件可制備本發明的輕度低溫轉錄調控元件、輕度低溫轉錄調控增強子和輕度 低溫翻譯調控元件，例如，通過氨基磷酸鹽(phosphoroamidide)法的固相合成法或 膦酸氫鹽法的固相合成法，使用四種帶有保護基團的脫氧核糖核苷酸(參見，例如， OligonucleotideSynthesis :A practical Approach, IRL Press,35-81,83-115 (1984)； J. Org. Chem. ,49,2139(1984) ；Tetrahedron Lett.，27，469(1986) ；TetrahedronLett. ,22,1859-1862 ；Tetrahedron Lett.，21，719—722 J.Am. Chem. Soc.，103,3185—3191(1981)。) 現今可容易地用可商購的DNA合成儀(例如，Applied Biosystem制造的)合成它們。(ii)要使用的啟動子原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子可用作為啟動子。優選哺乳動物啟動子和 病毒啟動子。優選的啟動子的例子包括小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動子，巨細胞病 毒(CMV)啟動子和SV40啟動子。(iii)編碼序列要表達的基因沒有限制，編碼任何蛋白的核苷酸序列都可使用。(iv)要使用的載體將本發明的輕度低溫轉錄調控元件或輕度低溫轉錄調控增強子，啟動子和編碼所 要表達的蛋白的編碼序列連接在一起并插入載體中。可以使用原核細胞和真核細胞表達載 體。優選的載體的例子包括，但不限于，pCMV(Invitrogen)、pCAT3啟動子載體(Promega) 和pSV2-neo載體。(v)要使用的宿主細胞用載體轉染宿主細胞。優選使用哺乳動物細胞作為宿主細胞。優選的哺乳動物細 胞的例子是人細胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela細胞；猴細胞系，例如C0S-7和 Vero細胞；小鼠細胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中國倉鼠細胞系，例如 CH0。轉染的方法包括磷酸鈣法，脂質轉染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有 DNA (載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀 物。當該溶液添加到宿主細胞時，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進入宿主細胞使得DNA 轉染入細胞。(vi)培養條件宿主細胞在輕度低溫下培養。無需使用專用培養基作為培養基。可使用哺乳動物 細胞培養的常用培養基。培養基的代表例子是補充有10%胎牛血清(FCS) (Invitrogen)的 Dulbecco 改良的 Eagle 培養基(D-MEM)。本發明涉及一種篩選輕度低溫轉錄調控元件的方法，包括1)提供在輕度低溫下，特別是優選在32°C的培養溫度下，能促進轉錄的基因；2)克隆基因的一部分，從距該基因轉錄起始位點5’的1. 5kb到第一外顯子3、末 端；3)將所克隆的核苷酸序列和合適的啟動子插入表達報道基因的載體中；4)用所述載體轉化哺乳動物細胞；5)在輕度低溫或37°C下培養細胞以表達報道基因，來鑒定能在輕度低溫下促進 報道基因轉錄的核苷酸序列；和6)對于能促進報道基因轉錄的核苷酸序列，截短要被插入載體的核苷酸序列以鑒 定對于在輕度低溫下促進報道基因轉錄必需的核苷酸序列。通過在37 °C和輕度低溫下，優選在32°C下，培養哺乳動物細胞并應用DNA芯片 (微陣列)或cDNA扣除法(參見，例如，Moody，D. E.，Genomic techniques :An overview of methods for study of geneexpression, J. Anim. Sci. ,79(E. Suppl.) :E128_E135. 2001)于從其中抽提的RNA，可獲得在輕度低溫下能促進轉錄的基因。原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子可用作為啟動子。優選哺乳動物啟動子和 病毒啟動子。優選的啟動子的例子包括，但不限于，小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動 子，巨細胞病毒(CMV)啟動子和SV40啟動子。報道基因是編碼能容易地被檢測的蛋白的基因，包括但不限于，熒光素酶基因和 氯霉素乙酰轉移酶基因?？墒褂迷思毎驼婧思毎d體。優選的載體的例子包括，但不 限于，pCMV(Invitrogen)，pCAT3 啟動子載體(Promega)和 pSV2_neo 載體。用載體轉染宿主細胞。優選使用哺乳動物細胞作為宿主細胞。優選的哺乳動物細 胞的例子是人細胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela細胞；猴細胞系，例如C0S-7和 Vero細胞；小鼠細胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中國倉鼠細胞系，例如 CH0。轉染的方法包括磷酸鈣法，脂質轉染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有 DNA (載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀 物。當該溶液添加到宿主細胞時，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進入宿主細胞使得DNA 轉染入細胞。無需使用專用培養基作為培養基。可使用哺乳動物細胞培養的常用培養基。培養 基的代表例子是補充有10%胎牛血清(FCS) (Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培養 基(D-MEM)。如果報道基因產物在輕度低溫下，優選在32°C下的表達量，與37°C下的表達量的 比率大于1，則核苷酸序列可以是在輕度低溫下能特異性促進基因轉錄的增強子。截短在輕 度低溫下能促進基因轉錄的核苷酸序列以獲得本發明的輕度低溫轉錄調控元件?？赏ㄟ^確 認與該輕度低溫轉錄調控元件互補的核苷酸序列在輕度低溫下也可促進基因轉錄來確認 它是增強子。本發明涉及一種改良輕度低溫轉錄調控元件的方法，包括1)合成突變的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代輕度低溫轉錄調控元件中的一 個或兩個核苷酸；2)將突變的核苷酸序列與合適的啟動子整合入表達報道基因的載體中；3)用所述載體轉化哺乳動物細胞；4)在輕度低溫或37°C下培養細胞以表達報道基因，來鑒定在輕度低溫下能促進 報道基因轉錄的核苷酸序列。輕度低溫轉錄調控元件中的一個或兩個核苷酸為其他核苷酸所取代的突變的核 苷酸可通過上述方法合成。原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子可用作為啟動子。優選哺乳動物啟動子和 病毒啟動子。優選的啟動子的例子包括，但不限于，小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動 子，巨細胞病毒(CMV)啟動子和SV40啟動子。報道基因是編碼能容易地被檢測的蛋白的基因，包括熒光素酶基因和氯霉素乙 酰轉移酶基因?？墒褂迷思毎驼婧思毎d體。優選的載體的例子包括，但不限于， pCMV(Invitrogen)，pCAT3 啟動子載體(Promega)和 pSV2_neo 載體。用載體轉染宿主細胞。優選使用哺乳動物細胞作為宿主細胞。優選的哺乳動物細胞的例子是人細胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela細胞；猴細胞系，例如C0S-7和 Vero細胞；小鼠細胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中國倉鼠細胞系，例如 CH0。轉染的方法包括磷酸鈣法，脂質轉染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有 DNA (載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀 物。當該溶液添加到宿主細胞時，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進入宿主細胞使得DNA 轉染入細胞。無需使用專用培養基作為培養基。可使用哺乳動物細胞培養的常用培養基。培 養基的代表例子是補充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培養基(D-MEM) (Invitrogen)。如果報道基因產物在輕度低溫下，優選在32°C下的表達量，與37°C下的表達量的 比率大于1，則該核苷酸序列可以是在輕度低溫下能特異性促進基因轉錄的增強子。可通過 確認與該輕度低溫轉錄調控元件互補的核苷酸序列在輕度低溫下也可促進基因轉錄來確 認它是增強子。本發明也涉及一種輕度低溫翻譯調控元件，包含核苷酸序列aCtCgCgCCt taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctcgcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc (SEQ ID NO :23)，置于編碼序列的5、端和啟動子的3、端。原核啟動子，真核啟動子和病毒啟動子可用作為啟動子。優選哺乳動物啟動子和 病毒啟動子。優選的啟動子的例子包括小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動子，巨細胞病 毒(CMV)啟動子和SV40啟動子。本發明的輕度低溫轉錄調控元件或輕度低溫轉錄調控增 強子，以及啟動子可與本發明的輕度低溫翻譯調控元件一起使用?？墒褂迷思毎驼婧思毎d體。優選的載體的例子包括，但不限于， pCMV(Invitrogen)，pCAT3 啟動子載體(Promega)和 pSV2_neo 載體。用載體轉染宿主細胞。優選使用哺乳動物細胞作為宿主細胞。優選的哺乳動物細 胞的例子是人細胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela細胞；猴細胞系，例如C0S-7和 Vero細胞；小鼠細胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中國倉鼠細胞系，例如 CH0。轉染的方法包括磷酸鈣法，脂質轉染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有 DNA (載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀 物。當該溶液添加到宿主細胞時，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進入宿主細胞使得DNA 轉染入細胞。無需使用專用培養基作為培養基。可使用哺乳動物細胞培養的常用培養基。培 養基的代表例子是補充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培養基(D-MEM) (Invitrogen)。實施例實施例1假定Cirp基因轉錄起始位點的“actcgc... ”的“a”為+1，跨越了核苷酸-970 (轉 錄起始位點5’的970個核苷酸)至+56(在第一外顯子內)的Cirp基因，及其5、端缺失 的片段(見表1)被插入PCAT3-基礎載體(Promega)的多克隆位點中。該載體帶有氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因作為報道基因。接著將2. 5-5. 0 u g/35-mm培養皿的質粒與0. 5-1. 0 u g/35-mm培養皿的 CDM8-LacZ (其為0 -半乳糖苷酶表達載體并用于校正轉染效率)共轉染入人細胞系293。將轉染的細胞分成兩組。一組在32°C下培養，另外一組在37°C下培養。培養基是 補充有10% FCS的D-MEM。36小時后，離心回收細胞并制備全細胞裂解物。使用CAT ELISA試劑盒(Roche Diagnostic)測定每一溫度下所產生的氯霉素乙酰轉移酶(CAT)蛋白的量，使用半乳糖 苷酶分析試劑盒(Stratagene)測定半乳糖苷酶活性。每一片段的轉錄促進活性如表 1所示。將CAT蛋白質量除以半乳糖苷酶活性計算轉錄促進活性。表1Cirp基因組5、端片段的轉錄促進活性 轉染后24小時的數據類似于該結果。從這些數據中，可以看到基因轉錄的基礎啟動子可能存在于基因組基因的-220 到0，響應于32°C促進轉錄的增強子可能存在于-340到-220。實施例2除使用人細胞系293T，U-20S或Huh-7，猴細胞系C0S-7或小鼠細胞系NIH/3T3， Balb/3T3,B-6或Ifepal-6代替人細胞系293作為宿主細胞外，重復實施例1，獲得類似的結果.實施例3制備多種來自Cirp基因-340到-240核苷酸的缺失突變體并插入到pCAT3啟動 子載體(Promega)的多克隆位點中(圖2)。該載體帶有SV40啟動子。如實施例1所述，在 用磷酸鈣法使用人293細胞轉染DNA的基因轉移后，在32°C下測定轉錄促進活性。不含有 插入片段的PCAT 3啟動子載體作為陰性對照(模擬物)。所示的是轉染后36個小時的數據。將CAT蛋白質量除以半乳糖苷酶活性計 算轉錄促進活性(表2)。MJlCirp基因組5、端片段的轉錄促進活性 從這些結果中可以看到在2個基因組片段-310到-290和-260到-220中存在增 強子，其在32°C應答中促進轉錄。比較了這兩個片段中的核苷酸序列，發現tcccc gcc(SEQ ID NO 2)的共有序列。實施例4將含有上述發現的tcccc gcc的10個核苷酸的三個分子串聯形成序列ttccc cgccg ttccc cgccg ttccc cgccg(SEQ ID NO :3)。如實施例 3 所述，將該序列插入pCAT3 啟 動子載體的多克隆位點中。作為陰性對照，使用不含有插入片段的PCAT 3啟動子載體(模 擬物)。作為陽性對照，使用含有Cirp基因組的-340到-220位作為增強子的pCAT3啟動 子載體和含有SV40增強子的pCAT3啟動子載體。轉染入293細胞后24小時獲得的結果示 于表3中。表3 實施例5如果一個序列是增強子，則反向序列也應當是有效的。將含有cggcg gggaa(SEQ ID NO 4)的10個核苷酸的三個分子串聯形成序列cggcg gggaa cggcg gggaa cggcg gggaa(SEQ ID NO :5)，所述cggcggggaa序列是包含tcccc gcc的序列的反向序列。將該序 列插入到PCAT3啟動子載體的多克隆位點中，進行與實施例4類似的試驗。在這種情況下，32°C /37°C的比是3. 83，證實了該序列為輕度低溫轉錄調控增強 子。實施例6
通過將在小鼠Cirp基因組中發現的8個核苷酸tcccc gcc (SEQ IDN0 2)的兩個 分子串聯所獲得的序列tcccc gcctc cccgc c(SEQ IDNO 6)插入到pCAT3啟動子載體的多 克隆位點中，進行與實施例4類似的試驗。在這種情況下，32°C /37°C的比是2. 51，證實了 該序列為輕度低溫轉錄調控增強子。實施例7將發現位于人RBM基因組(GenBank NT_011568)轉錄起始位點5、端約260核苷 處的8個核苷酸ggggg gga(SEQ ID NO 7)的三個分子串聯形成序列ggggg ggagg ggggg agggg ggga(SEQ ID NO :8)。將該序列插入到pCAT3啟動子載體的多克隆位點中，進行與實 施例4類似的試驗。在這種情況下，32°C /37°C的比是2. 52，證實了該序列為輕度低溫轉錄調控增強子。實施例8將含有在上述發現的序列tcccc gcc (SEQ ID NO :2)中的一個或兩個堿基取代 (見下表)的10個核苷酸的3個分子串聯形成序列。將該序列插入到與實施例4相同的載 體中，并用該載體轉染293細胞。24小時后，測定CAT/LacZ，各突變體的輕度低溫轉錄促進 (增強)活性示于下表中，當使用不含有插入片段的PCAT3啟動子載體時，規定32°C /37°C 的比為1。M4帶有一個堿基取代的突變體的低溫轉錄促進(增強)活性 魁帶有2個堿基取代的突變體的低溫轉錄促進(增強)活性 第一位堿基被G或A取代的，第七位堿基被T取代的，以及第八位堿基被T取代的 突變體與野生型序列相比具有類似的轉錄促進活性。盡管與野生型序列相比，第六位堿基 被A或C取代降低了活性，但它們也顯示了明顯的活性。第七和第八位堿基被AA取代的突 變體78具有與野生型相同程度的轉錄促進活性。因此，序列tcccc gcc是顯示轉錄促進活性的序列，且序列t (或g或a)CCCCg(或 a或c) c (或a或t) c (或a或t)可具有轉錄促進活性。因為它們是增強子，所以與它們互補的序列，例如與tcccc gcc(SEQID NO 2)互補 的 ggcgg gga(SEQ ID NO 22)也可以使用。實施例9將從pGL3_基礎質粒(Promega)上切除下的螢火蟲熒光素酶cDNA插入到帶有巨 細胞病毒(CMV)啟動子的pcDNA3. 1(+)載體(Invitrogen)的多克隆位點(EcoR和Xbal 之間)中。然后，將相應于Cirp mRNA+1到+82核苷酸的cDNA片段(小鼠Cirp轉錄產物 (mRNA) "act…，，的"a，，假定為+1), actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctcgcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc (SEQ ID NO :23)插入到 pcDNA3. 1 (+) 載體(Invitrogen)的多克隆位點(Kpnl和BamHI之間)中。在Kpnl和BamHI之間無插入 片段的質粒作為對照。接著將2. 5-5. 0 u g/35-mm培養皿的這些質粒與0. 5-1. 0 y g/35-mm培養皿的 pRLTK質粒(其為renila熒光素酶表達載體，用于修正每一轉染的效率)共轉染入已培養 一天的人細胞系293。將轉染的細胞分成兩組。一組在32°C下培養，另外一組在37°C下培 養。培養基為補充有10% FCS的D-MEM。36小時后，離心回收細胞，制備全細胞裂解物。使用雙重熒光素酶報告試劑盒 (Promega)測定螢火蟲和renila熒光素酶活性。每一片段的翻譯促進活性示于表6中。將螢火蟲熒光素酶活性除以renila熒光素酶活性來計算翻譯促進活性。戲Cirp mRNA的5、非翻譯區(UTR)的翻譯促進活性 上述結果表明當Cirp mRNA的5—UTR存在于載體中時，與不存在其的載體相比， 在32°C下所產生的蛋白的量增加到1. 7倍，該量與在37°C下用不含Cirp mRNA的5—UTR的 質粒轉染的細胞所產生的量相當。
權利要求
一種輕度低溫轉錄調控元件，由選自以下的核苷酸序列組成gcccc gcc(SEQ ID NO9)，acccc gcc(SEQ ID NO10)，tcccc gtc(SEQ ID NO11)，tcccc gct(SEQ ID NO12)，tcccc gaa(SEQ ID NO21)，和tcccc ccc(SEQ ID NO14)，或與該核苷酸序列互補的核苷酸序列，其中所述輕度低溫是30-34℃的溫度。
2.一種輕度低溫轉錄調控增強子，其中相同或不同的權利要求1的輕度低溫轉錄調控 元件被連接。
3.一種輕度低溫轉錄調控增強子，其中相同或不同的權利要求1的輕度低溫轉錄調控 元件通過其他核苷酸被連接。
4.一種載體，包含權利要求1的輕度低溫轉錄調控元件或權利要求2或3的輕度低溫 轉錄調控增強子。
5.一種用權利要求4的載體轉化的哺乳動物細胞。
6.一種篩選權利要求1所示的輕度低溫轉錄調控元件的方法，包括1)提供在輕度低溫下，能促進轉錄的基因；2)克隆從位于該基因轉錄起始位點5、上游的1.5kb到該基因第一外顯子的范圍；3)將所克隆的核苷酸序列和合適的啟動子插入表達氯霉素乙酰轉移酶(CAT)作為報 道基因的載體中；4)用所述載體轉化哺乳動物細胞；5)在輕度低溫和37°C下分別培養細胞以表達報道基因，來獲得能在輕度低溫下促進 報道基因轉錄的核苷酸序列；和6)截短要被整合入載體的該核苷酸序列以鑒定對于在輕度低溫下促進報道基因轉錄 必需的核苷酸序列；其中所述輕度低溫是30-34°C的溫度。
7.權利要求6的方法，其中步驟1)中所述的輕度低溫為32°C的培養溫度。
8.一種改良權利要求1所示的輕度低溫轉錄調控元件的方法，包括1)合成突變的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代輕度低溫轉錄調控元件中的一個或 兩個核苷酸；2)將突變的核苷酸序列與合適的啟動子整合入表達氯霉素乙酰轉移酶(CAT)作為報 道基因的載體中；3)用所述載體轉化哺乳動物細胞；4)在輕度低溫和37°C下分別培養細胞以表達報道基因，來鑒定在輕度低溫下促進報 道基因轉錄所必需的核苷酸序列；其中所述輕度低溫是30-34°C的溫度。
9.一種在哺乳動物細胞中促進靶基因的轉錄和翻譯的方法，包括下述步驟用包含輕度低溫轉錄調控元件或輕度低溫轉錄調控增強子的載體轉化哺乳動物細胞;和培養轉化的哺乳動物細胞，其中所述輕度低溫轉錄調控元件由選自以下的核苷酸序列組成gcccc gcc(SEQ ID NO 9)，acccc gcc(SEQ ID NO 10)，tcccc gtc (SEQ ID NO :11)，tcccc get(SEQ ID NO 12)，tcccc gaa(SEQ ID NO :21)，和tcccc ccc(SEQ ID NO 14)，或與該核苷酸序列互補的核苷酸序列，其中所述輕度低溫是30-34°C的溫度，且其中相同或不同的所述輕度低溫轉錄調控元件在所述輕度低溫轉錄調控增強子中 直接或通過其他核苷酸被連接。
全文摘要
本發明的一個目的是提供一種在使用哺乳動物細胞的重組DNA方法中增加蛋白產量的方法。當輕度低溫轉錄調控元件，其包含至少一個核苷酸序列X1ccccX6X7X8，其中，X1是t，g，或a；X6是g，a或c；X7是c，a，或t；以及X8是c，a和t，或與該核苷酸序列互補的核苷酸序列，用作為增強子及在輕度低溫下培養哺乳動物細胞時，促進了期望蛋白的轉錄。當將SEQ ID NO23的輕度低溫翻譯調控元件置于編碼序列的5`端和啟動子的3`端及在輕度低溫下培養哺乳動物細胞時，促進了期望蛋白的翻譯。
文檔編號C12N15/113GK101857864SQ201010170098
公開日2010年10月13日 申請日期2005年3月1日 優先權日2004年3月23日
發明者藤田潤 申請人:藤田潤