專利名稱：一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞突變體的方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞突變體的方法。
背景技術：
sativum L.)為百合科蔥屬植物,起源于中亞地區,4000多年前就已經開始種植，具有藥食兩用的功效，長期以來在我國廣泛栽培種植。但近年來，隨著大蒜種植面積和產業化發展迅速，病蟲害也日益嚴重，成為限制其進一步發展的主要因素，其中大蒜葉枯病對大蒜蒜薹、蒜頭產量為害嚴重。大蒜葉枯病(Garlic leaf blight)屬于真菌病害，其病原菌的無性階段為半知菌類的匍柄霉，有性階段為子囊菌門的格孢腔菌。兩個階段的病菌均可侵染大蒜，但以無性階 段的病菌侵染為主。該病主要危害大蒜的葉和花梗，嚴重時造成蒜葉枯死、大蒜不抽薹等癥狀，此病的發生造成嚴重損失，影響大蒜的穩產高產；目前，雖然有一些化學藥物可用來防治葉枯病，但效果不明顯，而且大量用藥還會引起產品農藥殘留增加，降低食用安全性，因此，要從根本上解決葉枯病，必須選育抗病品種，然而到目前為止，國內外對大蒜抗病突變體篩選方法的報道很少，僅張林青(2008)報道了大蒜抗白腐病細胞無性系變異，但是僅獲得少于的抗性鱗莖，且未利用分子手段進行鑒定。因此目前急需開發出能成功地篩選大蒜抗病突變體的方法。

發明內容
本發明為了解決上述背景技術中的不足之處，本發明提供一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞突變體的方法，本方法操作簡便，易于掌握。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞突變體的方法，其特征在于包括以下步驟(1)以大蒜莖盤為外植體，分別接種在粗毒素體積分數分別為0%、10%、20%、30%、40%的篩選培養基上，確定篩選壓；(2)以大蒜莖盤為外植體，在MS+B5有機+2，4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L +5%毒素的培養基上培養30天，誘導出抗性胚性愈傷組織；(3)將誘導出的抗性胚性愈傷組織逐次接種到粗毒素體積分數分別為5 %，10%, 15%，20%, 25%的愈傷組織增殖培養基MS+B5有機+2，4-D O. 5 mg/L+KT I. Omg/L上，以利用多步法篩選抗性胚性愈傷；(4)將步驟3中所得到的抗性胚性愈傷接種至不含毒素的增殖培養基中，使篩選到的抗性胚性愈傷恢復生長；(5)將步驟4中抗性胚性愈傷組織接種到含25%粗毒素的芽分化培養基MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L上，促使芽分化，獲得抗性芽；(6)將得到的抗性芽接種至無毒素的芽分化培養基上，使抗性芽恢復生長；(7)將得到的抗性芽接種至無激素的MS基本培養基上誘導生根，使其繼續長成具有根、莖、葉的完整再生植株；(8)用SSR和SRAP標記對抗性植株進行分子標記鑒定。所述步驟(I)中的大蒜選擇健康飽滿的蒜瓣，去皮，在自來水下沖洗lh，后在無菌條件下用75%酒精浸lmin，再用O. 5%次氯酸鈉消毒20 25min，無菌水沖洗4 5次待用，在超凈工作臺上切去蒜瓣上部的貯藏葉，剩下約5mm厚帶發芽葉基的莖盤，十字切成4塊為外植體，分別接種在粗毒素體積分數分別為O %、10 %、20 %、30 %、40 %的篩選培養基上，接種時使外植體傷口與培養基表面充分接觸，培養條件為溫度20 25°C，光照2000Lx, 14h光照/IOh黑暗條件下培養30天后，根據各處理愈傷組織誘導率及發育狀況，確定適宜的抗性篩選壓為25%。所述步驟(2)的具體方法為以大蒜帶發芽葉基的莖盤為外植體，接種在含粗毒素為5%的MS+B5有機+2，4-D 2. O mg/L +KT O. 5 mg/L的培養基上，培養30天，得到抗性胚性愈傷組織。所述步驟(3)的具體方法為配置附加不同體積分數的粗毒素增殖培養基MS+B5有機+2，4-D 0.5 mg/L+KTl. O mg/L，粗毒素按每5%為一個梯度，直至粗度素體積分數為25%,分別將抗性愈傷組織接種到上述粗毒素的增殖培養基上，使胚性愈傷組織增殖，每30天為一個培養周期。所述步驟(5)的具體方法為將所得到的抗性愈傷組織接種至粗毒素分數為25% 的MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L的芽分化培養上，培養30天，獲得抗性芽。所述步驟(8)的具體方法為對所得到部分再生植株利用SSR和SRAP標記手段進行分子鑒定。與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下(1)操作簡便，易于掌握；(2)適應范圍廣本發明多用于多個大蒜品種，如在大蒜品種G025、G064等中均獲得抗病突變體；
(3)結果可信利用了分子手段進行鑒定。


圖I為大蔥葉枯病病原菌孢子；
圖2為大蒜莖盤在無毒素的愈傷組織誘導培養基上的初期狀態；
圖3為大蒜在粗毒素分數為5%的毒素培養基上的生長狀態；
圖4為大蒜莖盤在粗毒素分數為30%的培養基上的生長狀態；
圖5為在無毒素的培養基上誘導的胚性愈傷組織；
圖6為抗性胚性愈傷組織在無毒素的增殖培養基上生長狀態；
圖7為非抗性胚性愈傷分化芽的初期狀態；
圖8為在粗毒素分數為25%的芽分化培養基上得到的抗性芽；
圖9為所得到抗性叢生芽；
圖10為分離得到單棵抗性植株；
圖11為在無植株的MS培養基上根的形成；
圖12為試管小鱗莖的形成初期；
圖13為得到的抗性鱗莖；
圖14為栽植鱗莖后得到的抗性植株；
圖15為G025的SSR電泳圖。
具體實施例方式 本發明的篩選大蒜抗葉枯病體細胞無性系的方法，包括以下步驟(1)以大蒜莖盤為外植體，分別接種在粗毒素體積分數分別為O %、10 %、20 %、30 %、40 %的篩選培養基上，確定篩選壓；(2)以大蒜莖盤為外植體，在MS+B5有機+2，4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L +5%毒素的培養基上培養30天，誘導出抗性胚性愈傷組織；(3)將誘導出的抗性胚性愈傷組織逐次接種到粗毒素體積分數分別為5%，10%, 15%，20%, 25%的愈傷組織增殖培養基MS+B5有機+2，4-D O. 5 mg/L+KT I. O mg/L上，以利用多步法篩選抗性胚性愈傷；(4)將步驟3中所得到的抗性胚性愈傷接種至不含毒素的增殖培養基中，使篩選到的抗性胚性愈傷恢復生長；(5)將步驟4中抗性胚性愈傷組織接種到含25%粗毒素的芽分化培養基MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L上，促使芽分化，獲得抗性芽；(6)將得到的抗性芽接種至無毒素的芽分化培養基上，使抗性芽恢復生長；(7)將得到的抗性芽接種至無激素的MS基本培養基上誘導生根，使其繼續長成具有根、莖、葉的完整再生植株；(8)用SSR和SRAP標記對抗性植株進行分子標記鑒定。具體包括以下步驟
(I)篩選適宜的篩選壓。選擇G064、G025、正月早三個大蒜品種，選擇健康飽滿的蒜瓣，去皮，在自來水下沖洗I h，后在無菌條件下用75%酒精浸I min，再用O. 5%次氯酸鈉消毒20 25 min，無菌水沖洗4 5次待用，在超凈工作臺上切去上部的貯藏葉，剩下約5 mm厚帶發芽葉基的莖盤，十字切成4塊為外植體，分別接種在粗毒素體積分數分別為O %、10 %、20%,30%、40%的篩選培養基上，接種時外植體傷口與培養基表面充分接觸，培養條件為溫度20 25°C，光照20001x，14h光照/IOh黑暗，培養30天后，統計各處理愈傷組織誘導·率及發育狀況，篩選出適宜的抗病篩選壓為25% ；
為了提高篩選效果，所述步驟(I)中，首先以大蒜莖盤為外植體，在愈傷組織形成的培養基中加入不同體積分數的粗毒素，統計組織的成活率，因粗毒素濃度為30%時，外置體幾乎不能適應，以至死亡，所得選擇最適宜的篩選壓為25%，并以5%為一個梯度，進行抗性胚性愈傷的多步法篩選。(2)以大蒜外植體為外植體，接種在粗毒素分數為5%的MS+B5有機+2，4-D 2.0mg/L +KT 0.5 mg/L的培養基上，培養30天，誘導出抗性胚性愈傷組織。(3)將所得到的抗性胚性愈傷組織逐次接種至粗毒素體積分數逐級增加(5%，10%，15%，20%)的愈傷組織增殖培養基上直至粗毒素分數為25%，每個培養周期為30天，使抗性胚性愈傷組織增殖，經過多次的繼代培養除去非抗性的胎性愈傷組織，增殖培養基為MS+B5 有機+2，4-D O. 5 mg/L+KT I. O mg/L，每 5%為一個梯度。配置附加不同體積分數的粗毒素增殖培養基MS+B5有機+2，4-D O. 5 mg/L+KT I. Omg/L，粗毒素按每5%為一個梯度，直至粗度素分數為25%，分別將抗性愈傷組織接種到上述粗毒素的增殖培養基上，使胚性愈傷組織增殖，每30天為一個培養周期。(4)將所得到的抗性胚性愈傷組織接種至無毒素的愈傷組織增殖培養上，使篩選到的抗性胚性愈傷恢復生長。(5)將所得到的抗性胚性愈傷組織接種至粗毒素體積分數為25%的MS+KT 0.5mg/L +6-BA 1.0 mg/L的芽分化培養基上，培養30天，促使芽分化，得到抗性芽。(6)將所得的抗性芽接種至無毒素的芽分化培養基上，使抗性芽恢復生長。(7)將得到的抗性芽接種至無激素的MS基本培養基上誘導生根，使其繼續生長具有根、莖、葉完整的再生抗性植株。(8)對所得到部分抗性植株利用SSP和SRAP標記進行鑒定，進一步在分子水平上確定體細胞突變的植株。其中MS基本培養基的組成如表1，B5培養基的有機成分見表2，
權利要求
1.一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞突變體的方法，其特征在于包括以下步驟(1)以大蒜莖盤為外植體，分別接種在粗毒素體積分數分別為0%、10 %、20 %、30 %、40 %的篩選培養基上，確定篩選壓；(2)以大蒜莖盤為外植體，在MS+B5有機+2，4-D 2.0 mg/L +KT 0.5mg/L +5%毒素的培養基上培養30天，誘導出抗性胚性愈傷組織；(3)將誘導出的抗性胚性愈傷組織逐次接種到粗毒素體積分數分別為5%，10%，15%, 20%, 25%的愈傷組織增殖培養基MS+B5有機+2，4-D 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L上，以利用多步法篩選抗性胚性愈傷；(4)將步驟3中所得到的抗性胚性愈傷接種至不含毒素的增殖培養基中，使篩選到的抗性胚性愈傷恢復生長；(5)將步驟4中抗性胚性愈傷組織接種到含25%粗毒素的芽分化培養基MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L上，促使芽分化，獲得抗性芽；(6)將得到的抗性芽接種至無毒素的芽分化培養基上，使抗性芽恢復生長；(7)將得到的抗性芽接種至無激素的MS基本培養基上誘導生根，使其繼續長成具有根、莖、葉的完整再生植株；(8)用SSR和SRAP標記對抗性植株進行分子標記鑒定。
2.根據權利要求I所述的一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞突變體的方法，其特征在于所述步驟(I)中的大蒜選擇健康飽滿的蒜瓣，去皮，在自來水下沖洗lh，后在無菌條件下用75%酒精浸lmin，再用0. 5%次氯酸鈉消毒20 25min，無菌水沖洗4 5次待用，在超凈工作臺上切去蒜瓣上部的貯藏葉，剩下約5mm厚帶發芽葉基的莖盤，十字切成4塊為外植體，分別接種在粗毒素體積分數分別為0%、10<%、20%、30(%、40(%的篩選培養基上，接種時使外植體傷口與培養基表面充分接觸，培養條件為 溫度20 25°C，光照2000Lx，14h光照/IOh黑暗條件下培養30天后，根據各處理愈傷組織誘導率及發育狀況，確定適宜的抗性篩選壓為25%。
3.根據權利要求I或2所述的一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞無性系的方法，其特征在于所述步驟(2)的具體方法為以大蒜帶發芽葉基的莖盤為外植體，接種在含粗毒素為5%的MS+B5有機+2，4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L的培養基上，培養30天，得到抗性胚性愈傷組織。
4.根據權利要求3所述的一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞無性系的方法，其特征在于所述步驟(3)的具體方法為配置附加不同體積分數的粗毒素增殖培養基MS+B5有機+2, 4-D 0.5 mg/L+KTl. 0 mg/L，粗毒素按每5%為一個梯度，直至粗度素體積分數為25%，分別將抗性愈傷組織接種到上述粗毒素的增殖培養基上，使胚性愈傷組織增殖，每30天為一個培養周期。
5.根據權利要求4所述的一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞突變體的方法，其特征在于所述步驟(5)的具體方法為將所得到的抗性愈傷組織接種至粗毒素分數為25%的MS+KT0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L的芽分化培養上，培養30天，獲得抗性芽。
6.根據權利要求5所述的一種篩選大蒜抗葉枯病體細胞突變體的方法，其特征在于所述步驟(8)的具體方法為對所得到部分再生植株利用SSR和SRAP標記手段進行分子鑒定。
全文摘要
本發明涉及一種大蒜抗葉枯病體細胞突變體篩選方法。該方法包括(1)以大蒜莖盤為外植體，以葉枯病粗毒素不同的體積分數為培養基，確定篩選壓；(2)以大蒜莖盤為外植體，接種附加粗毒素體積分數為5％的培養基上誘導出抗性愈傷組織；(3)配置附加不同體積分數的粗毒素增殖培養基，將抗性愈傷組織接種上；(4)將得到的愈傷組織接種到不含毒素的愈傷組織增殖培養基中，淘汰掉非抗性的愈傷組織或細胞；(5)將抗性愈傷組織或細胞接種至粗毒素體積分數為25％的芽分化培養基中誘導芽的分化；(6)將誘導得到的抗性芽接種到不含毒素的芽分化培養基中；(7)將得到的抗性芽接種至MS基本培養基上，再生植株；(8)對再生植株進行分子水平的鑒定。
文檔編號A01H4/00GK102805033SQ201210302098
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者陳書霞, 程智慧, 常燕霞, 孟煥文 申請人:西北農林科技大學